一種提高微藻產氫效率的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高微藻產氫效率的方法，屬于生物能源領域。該方法首先將產氫微藻細胞在培養基中培養至指數生長期；然后收集該藻體細胞，將其轉入包含有機物的微藻產氫培養基中，除氧、密封，在黑暗環境中繼續培養一定時間，所述的有機物包括葡萄糖、果糖、乙酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、蘋果酸、氨基酸中的至少一種，以及前述每種有機物的鈉鹽、鉀鹽中的至少一種；最后將該微藻細胞重新置于光照環境中誘導其分解水生產氫氣。實驗證實，本發明通過向微藻產氫培養基中添加有機物能夠顯著提高微藻的產氫效率，具有技術新穎、簡便可靠、效果顯著等特點，在新能源領域中具有重要的實際應用價值。
【專利說明】一種提高微藻產氫效率的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物能源【技術領域】，特別涉及一種提高微藻產氫效率的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著煤、石油、天然氣等化石能源的大量消耗，傳統能源正加速枯竭，同時 由化石能源的大量消耗造成的酸雨、光化學煙霧、霾、溫室效應等環境問題也日趨嚴重，開 發具有可持續發展性的新能源具有重要的戰略意義。
[0003] 氫能因具有清潔、高效等優點被視為一種理想的未來能源。氫氣的傳統制取方法 主要有熱分解法和電解法，這兩種方法對化石能源的依賴程度較大，因此其發展的可持續 性受到質疑。除物理、化學制氫方法外，近年來微藻制氫技術受到越來越多的關注。
[0004] 微藻不僅可以利用太陽能通過光合作用進行生長繁殖，而且許多微藻在無氧狀態 下培養一段時間后，其光合作用產生的氧氣被自身的呼吸作用消耗，低氧環境導致葉綠體 基質中的產氫酶被誘導表達，產氫酶接受來自電子傳遞鏈的電子將水光解產生的氫離子還 原生成氫氣，這類微藻被稱為產氫微藻。這種氫氣制取方式主要依賴太陽能和水，不需要消 耗大量化石能源，從能源的可持續發展方面來看是一種理想的制氫方法。但是，目前微藻制 氫與熱分解法和電解法制氫相比，效率仍十分底下，因此研發提高微藻產氫效率的技術方 法對于推動其發展具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的技術目的是針對目前利用微藻產氫效率較低的問題，提供一種提高微藻 產氫效率的方法。
[0006] 為實現上述技術目的，本發明采用的技術方案為：一種提高微藻產氫效率的方法， 首先將產氫微藻細胞在培養基中培養至指數生長期；然后收集該微藻細胞，將其轉入微藻 產氫培養基中，除氧、密封，在黑暗環境中繼續培養，使其快速消耗環境中可能未除凈的剩 余氧氣后進入無氧環境；最后將該微藻細胞重新置于光照環境中誘導其分解水生產氫氣， 其特征是：所述的微藻產氫培養基中包含有機物，所述的有機物包括但不限于葡萄糖、果 糖、乙酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、蘋果酸、氨基酸以及該葡萄糖、果糖、乙酸、丙酮酸、3-磷 酸甘油酸、蘋果酸、氨基酸中每種的鈉鹽或鉀鹽等中的任意一種或兩種以上的混合物。
[0007] 所述的產氫微藻包括纖維藻（Ankistrodesmus sp.)、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)> Chlamydomonas moewusii、夜配衣藻（Chlamydomonas noctigama)、八月 衣藻（Chlamydomonas augustae)、雪衣藻（Chlamydomonas nivalis)、小球藻（Chlorella fusca)、普通小球藻（Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、 海洋綠球藻（Chlorococcum littorale)、亞海生綠球藻（Chlorococcum submarinum)、亞 心形扁藻（Platymonas subcordiformis)、惰性葉衣藻（Lobochlamys segnis)、胳形紫菜 (Porphyra umbilical is)、斜生柵藻（Scenedesmus obi iquus)、空泡柵藻（Scenedesmus vacuolatus)、細長聚球藻（Synechococcus elongates)和羊角月牙藻（Selenastrum capricormutum)等，但不限于上述微藻，包括上述微藻突變體、亞種和變種。
[0008] 所述的氨基酸包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸等。
[0009] 所述的培養基包括但不限于TAP培養基、ES培養基或BG11培養基等。當培養基 為TAP培養基時，所述的微藻產氫培養基為TAP-S培養基；當培養基為ES培養基時，所述 的微藻產氫培養基為ES-S培養基；當培養基為BG11培養基時，所述的微藻產氫培養基為 BG11-S培養基。
[0010] 作為優選，所述的產氫微藻細胞在溫度為201：?401：，光照為5(^111 〇1，111-2,8-1? 400 μ mol · m 2 · s 1的培養環境中培養。
[0011] 所述的產氫微藻細胞在培養基中是否已培養至指數生長期可以通過紫外分光光 度計測定，當培養基在680nm處的吸收值（以下簡寫為0D_)在1. 0?5. 0時，判定該微藻 細胞已培養至指數生長期。
[0012] 作為優選，所述的有機物占微藻產氫培養基溶液的濃度為O.Olg· Γ1? 10. 〇g · ΙΛ 進一步優選為 0· lg · Γ1 ?5. 0g · ΙΛ 更優選為 0· 3g · Γ1 ?3. 0g · L'
[0013] 所述的除氧方法不限，包括氮氣等惰性氣體吹掃、真空抽濾、超聲脫氣、膜分離等。 作為優選，除氧后微藻產氫培養基溶液中的氧氣濃度低于4mg · L'
[0014] 所述的黑暗環境是指光照強度為0?5μ mol ·πΓ2 --Γ1直至完全黑暗。作為優選， 黑暗環境的溫度控制在15?35°C，在黑暗環境中繼續培養該微藻細胞0. lh?50h。
[0015] 所述的微藻細胞重新置于光照環境中，光強優選為50 μ mol · πΓ2 · f? 400μπιο1 · πΓ2 · s4,溫度優選為15?35°C，優選在50?250rpm轉速下，對微藻體細胞進 行連續光照、攪動培養。
[0016] 綜上所述，本發明在現有微藻產氫培養基中添加適量有機物，實驗證實，在相同處 理條件下，微藻細胞在包含有機物的微藻產氫培養基中能夠高效光解水，從而提高微藻產 氫效率。與現有氫氣生產技術相比，本發明具有如下優點：
[0017] 1、技術新穎：該方法通過向微藻產氫培養基中添加少量有機物進而使微藻細胞高 效光解水。
[0018] 2、簡便可靠：該方法對設備和技術的要求較低，不需要在目前微藻產氫工藝的基 礎上額外設計繁瑣的新設備和工藝流程。
[0019] 3、效果顯著：該方法較微藻產氫的傳統方法相比，能夠顯著提高微藻的產氫效率。
[0020] 因此，本發明是一種簡單、高效地提高微藻產氫效率的方法，在新能源領域具有較 好的實際應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發明中使用的微藻光解水產氫氣的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖與實施例對本發明做進一步詳細描述，需要指出的是，以下所述實 施例旨在便于對本發明的理解，而對其不起任何限定作用。
[0023] 對比實施例1 :
[0024] 本實施例是以下實施例1的對比實施例。
[0025] 本實施例中，產氫微藻為萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)，利用該萊茵衣 藻光解水產生氫氣的過程如下：
[0026] 1)按照TAP培養基的配方配制萊茵衣藻的TAP培養基，所含營養元素種類及濃 度如下：NH 4C10. 4g · L' Κ2ΗΡ040· 108g · L' ΚΗ2Ρ040· 108g · L' MgS04 · 7Η200· 156g · L' CaCl2 · 2Η200· 05g · I/1、Tris (堿）2. 42g · I/1、鹽酸 1. 0ml、Η3Β0311· 4mg · I/1、 MnCl2 · 4H205. 06mg · I/1、ZnS04 · 7H200. 22mg · I/1、FeS04 · 7H204. 99mg · I/1、 MoC12 ·6Η201· 61mg .L' (NH4)6M〇7024 ·4Η201· 57mg .171、冰乙酸 lml、CH3C00Na ·3Η202· Og .171 ;
[0027] 將300ml 0D68(I為2. 0的萊茵衣藻藻液接種于裝有500ml TAP培養基的錐形瓶中， 控制環境溫度為28±2°C、光強為lOOymol · πΓ2 · s'每天測定藻液的0D68Q。
[0028] 2)當錐形瓶中的藻體細胞進入指數生長期后，即藻液0D_達到2. 0以上時，以轉 速為3000rpm離心培養基10min，收集藻體細胞。
[0029] 配制萊茵衣藻的TAP-S產氫培養基，該產氫培養基中不包含葡萄糖：以水作 為溶劑，參照TAP培養基的配方，以氯化物替代培養基中相應的硫酸鹽，并添加有機 物，所含營養元素種類及濃度如下：NH 4C10. 4g/L、K2HP040. 108g/L、KH2P040. 108g/L、 MgCl2 ·6Η200· 129g/L、CaCl2 ·2Η200· 05g/L、Tris (堿）2. 42g .171、鹽酸 1. 0ml、H3B03ll. 4mg/ L、MnCl2 · 4H205. 06mg/L、ZnCl210. 43mg/L、FeCl2 · 4H203. 56mg/L、MoC12 · 6H201. 61mg/L、 (NH4)6M〇7024 · 4H20L 57mg/L、冰乙酸 lml、CH3C00Na · 3H202. Og · L'
[0030] 將藻體細胞用上述TAP-S微藻產氫培養基洗漆3次后，將藻體細胞轉入到該微 藻產氫培養基中，再向培養基中通入氮氣6min，立即密封，然后將微藻置于黑暗環境中， 28±2°C下暗誘導24小時。
[0031] 3)將經過暗誘導的培養體系重新置于光強為100 μ mol · m 2 · s \溫度為28±2°C 的環境，120rpm的磁力攪拌下，采用連續光照產氫，測定、收集產生的氫氣。
[0032] 實施例1 :
[0033] 本實施例中，產氫微藻與比較實施例1中完全相同，也是萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)，利用該萊茵衣藻光解水產生氫氣的過程如下：
[0034] 1)與對比實施例1中的步驟1)完全相同；
[0035] 2)與對比實施例1中的步驟2)基本相同，所不同的是萊茵衣藻的TAP-S產氫培養 基中包含0. 3g · Γ1的葡萄糖，具體配方如下：
[0036] 萊茵衣藻的包含0. 3g · Γ1葡萄糖的TAP-S產氫培養基的配方為：以水作為溶劑， 參照TAP培養基的配方，以氯化物替代培養基中相應的硫酸鹽，并添加有機物，所含營養 元素種類及濃度如下：葡萄糖 3g · ΙΛ NH4C1(X 4g/L、Κ2ΗΡ04(λ 108g/L、ΚΗ2Ρ04(λ 108g/L、 MgCl2 ·6Η200· 129g/L、CaCl2 ·2Η200· 05g/L、Tris (堿）2. 42g .171、鹽酸 1. 0ml、H3B03ll. 4mg/ L、MnCl2 · 4Η205· 06mg/L、ZnCl210. 43mg/L、FeCl2 · 4Η203· 56mg/L、MoC12 · 6Η201· 61mg/L、 (NH4)6M〇7024 · 4H20L 57mg/L、冰乙酸 lml、CH3C00Na · 3H202. Og · L'
[0037] 然后，將藻體細胞用上述包含葡萄糖的TAP-S微藻產氫培養基洗滌3次后，將藻體 細胞轉入到該包含葡萄糖的微藻產氫培養基中，再向培養基中通入氮氣6min，立即密封，然 后將微藻置于黑暗環境中，28±2°C下暗誘導24小時。
[0038] 3)與對比實施例1中的步驟3)完全相同；
[0039] 經過連續光照產氫，收集產氫系統頂部產生的氫氣后，各取對比實施例1與實施 例1中所收集的氣樣0. lml，于氣相色譜儀SP-6890上分析氣體樣品的組分及各組分的含 量，并繪制萊茵衣藻的氫氣產率表(如表1)。
[0040] 如表1所不，經過24h后，對比實施例1中未添加葡萄糖的產氫系統頂部氣樣中對 照氫氣產量為65. 3ml ?Ι/1培養基，而實施例1中添加葡萄糖的產氫系統頂部氣樣中對照氫 氣產量可以達到127. 3ml · L 1培養基，是未添加葡萄糖的產氫系統的1. 95倍；產氫過程維 持96h后，對比實施例1中未添加葡萄糖的產氫系統頂部氣體中對照的氫氣201. 3ml · Γ1 培養基，而實施例1中添加葡萄糖的產氫系統的氫氣產量可以達到373. 3ml *L 1培養基，是 未添加葡萄糖的產氫系統的1. 85倍。
[0041] 表1 :對比實施例1與實施例1中產氫系統氫氣產量統計表
[0042]
【權利要求】
1. 一種提高微藻產氫效率的方法，首先將產氫微藻細胞在培養基中培養至指數生長 期；然后收集該微藻細胞，將其轉入微藻產氫培養基中，除氧、密封，在黑暗環境中繼續培 養，使其消耗環境中可能未除凈的剩余氧氣后進入無氧環境；最后將該微藻細胞重新置于 光照環境中誘導其分解水生產氫氣，其特征是：所述的微藻產氫培養基中包含有機物，所述 的有機物包括葡萄糖、果糖、乙酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、蘋果酸、氨基酸以及前述每種有 機物的鈉鹽、鉀鹽中的一種或兩種以上的混合物。
2. 如權利1要求所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的有機物在微藻產 氫培養基中的濃度為〇· Olg · L1?10. Og · I71，優選為0· lg · I71?5. Og · I71。
3. 如權利1要求所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：通過紫外分光光度計測 定培養基，當培養基在680nm處的吸收值在1. 0?5. 0時，判定該微藻細胞已培養至指數生 長期。
4. 如權利要求1所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的培養基為TAP培 養基，微藻產氫培養基為TAP-S培養基；或者，所述的培養基為ES培養基，微藻產氫培養基 為ES-S培養基；或者，所述的培養基為BG11培養基，微藻產氫培養基為BG11-S培養基。
5. 如權利要求1所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的產氫微藻細胞的 培養環境為：溫度 20°C?40°C，光照 50 μ mol · m 2 · s 1 ?400 μ mol · m 2 · s L
6. 如權利要求1所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的除氧方法包括惰 性氣體吹掃、真空抽濾、超聲脫氣、膜分離；除氧后微藻產氫培養基溶液中的氧氣濃度低于 4mg · I71。
7. 如權利要求1所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的黑暗環境中光照 強度為〇?5 μ mol · m 2 · s、
8. 如權利要求1所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的黑暗環境中溫度 控制在15?35°C，繼續培養時間為0. lh?50h。
9. 如權利要求1所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征是：所述的微藻細胞重新置 于光照環境中，光強為50 μ mol · πΓ2 · s-1?400 μ mol · πΓ2 · s'溫度為15?35°C。
10. 如權利要求1至9中任一權利要求所述的提高微藻產氫效率的方法，其特征 是：所述的產氫微藻包括纖維藻（Ankistrodesmus sp.)、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)> Chlamydomonas moewusii、夜配衣藻（Chlamydomonas noctigama)、八月 衣藻（Chlamydomonas augustae)、雪衣藻（Chlamydomonas nivalis)、小球藻（Chlore 11a fusca)、普通小球藻（Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、 海洋綠球藻（Chlorococcum littorale)、亞海生綠球藻（Chlorococcum submarinum)、亞 心形扁藻（Platymonas subcordiformis)、惰性葉衣藻（Lobochlamys segnis)、胳形紫菜 (Porphyra umbilical is)、斜生柵藻（Scenedesmus obi iquus)、空泡柵藻（Scenedesmus vacuolatus)、細長聚球藻（Synechococcus elongates)和羊角月牙藻（Selenastrum capricormutum)，以及前述每種微藻的突變體、亞種和變種。
【文檔編號】C12R1/89GK104046651SQ201310084912
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2013年3月15日
【發明者】葛亞明, 張亞杰, 陸貽超, 呂學蘭 申請人:中國科學院寧波材料技術與工程研究所