專利名稱：一種植物表達載體pGⅡ0229-GUS的構建及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物表達載體的構建及應用，具體涉及一種植物表達載體pG II 0229-GUS的構建及應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
甘鹿(Saccharum Complex)是最主要的糖料作物,鹿糖占世界食糖總產(chǎn)的76%,占我國食糖總產(chǎn)的92% ;甘蔗也是最重要的生物質(zhì)能源作物之一，是迄今大田栽培作物中單位面積生物量和燃料乙醇產(chǎn)量最大的C4植物。甘蔗品種改良對產(chǎn)業(yè)科技進步貢獻率高達60%，但是甘蔗是高度雜合的無性繁殖作物，遺傳背景非常復雜，表現(xiàn)為異源多倍體和多倍的非整倍體，染色體個數(shù)40 120個不等，變化幅度之大為其它作物所不及，常規(guī)有性雜交育種，從實生苗開始一般需要10 13年才能從10 30萬株分離群體中培育出I個達到審(鑒)定要求的品種。現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展和研究技術手段的進步，使品種的定向改良和目標性狀育種成為可能。利用轉基因技術改良甘蔗品種具有獨特的優(yōu)勢，原因在于:(1)甘蔗屬于轉基因安全等級為I級的工業(yè)原料作物，批準轉基因甘蔗產(chǎn)業(yè)化應用相對容易；(2)甘蔗又是無性繁殖作物，只要選到優(yōu)良的單株就可以通過離體無性繁殖的方式，快速擴大群體并保持遺傳上的穩(wěn)定性。目前甘蔗轉基因技術主要有兩個途徑，一是基因槍轟擊法，二是農(nóng)桿菌介導法，二者在甘蔗遺傳轉化上已經(jīng)有應用實例，但是這兩種技術在甘蔗轉基因應用上，轉化效率都很低。為了提高甘蔗轉化效率，仍需進一 步對轉化體系進行優(yōu)化。但是目前用于體系優(yōu)化的瞬時表達載體轉化效率低，不利于對甘蔗遺傳轉化體系的優(yōu)化。為此，為了建立更好的甘蔗轉基因優(yōu)化體系，我們探討了一個新的瞬時植物表達載體構建及其在甘蔗遺傳轉化上的應用，目的是獲得一個瞬時表達效率高的載體，從而能更有效地對甘蔗遺傳轉化體系進行優(yōu)化，進而建立一種可實現(xiàn)甘蔗高效轉化的技術方法，為甘蔗轉基因改良提供技術支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物表達載體pG II 0229-GUS的構建方法及應用。針對現(xiàn)有甘蔗遺傳轉化體系優(yōu)化時所用載體瞬時表達效率不高問題，提供一種轉化效率高的載體。通過克隆獲得瞬時基因表達盒，進而將其構建到植物表達載體中，獲得一個新的瞬時植物表達載體，提高轉化效率，從而建立更好的甘蔗外源基因遺傳轉化體系。本發(fā)明的目的是通過以下方法實現(xiàn)的。本發(fā)明的一種植物表達載體pG II 0229-GUS的構建方法，包括引物設計、基因克隆和載體構建；其特征在于操作步驟如下:
1、引物設計:人工設計合成特異引物序列
Forward primer: 5’ - GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’
Reverse primer: 5’ - GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’ ；
2、PCR擴增:PCR 反應體系是 10XPCR Buffer 2.5 μ 1，dNTP 2.0 μ 1,10 μ mol/L的 Forward primer 1.0 μ 1,10 μ mol/L 的 Reverse primer 1.0 μ 1,5 U/μ I 的 Ex Taq酶 0.125 μ 1,100 ng/ μ I 的 DNA模板 1.0 μ I，加 ddH20 至終體積 25 μ I ；PCR程序是 95°C預變性5 min，95°C變性30 s，56°C退火30 s，72°C延伸3 min，30個循環(huán)，最后72°C延伸10min ;所述DNA模板是以pCAMBIA2301質(zhì)粒為DNA模板；
3、載體構建:將步驟2的PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段I，并將獲得的目的片段I用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI進行酶切，回收目的片段II，同時將pGreenI10229質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI進行酶切，回收目的片段III，將回收的目的片段II和目的片段III用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5ci中，挑取陽性克隆驗證，獲得pG II 0229-GUS載體；所述目的片段I是指用特異引物擴增出的含有35s啟動子、GUS瞬時表達基因和nos終止子的核酸片段；目的片段II是指用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切目的片段I后2927bp的核酸片段；目的片段III是指用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切pGreenI10229質(zhì)粒DNA后4406bp的核酸片段；所述瓊脂糖凝膠電泳，參照《分子克隆》工具書中瓊脂糖凝膠電泳的方法；所述將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5 α中，轉化方法參照《分子克隆》工具書中用氯化鈣制備和轉化感受態(tài)大腸桿菌的方法；所述酶切方法，參照限制性內(nèi)切酶的說明書；所述回收方法，參照膠回收試劑盒說明書；所述用T4-DNA連接 酶進行連接方法，參照T4-DNA連接酶操作說明書；
所述攜帶⑶S基因的植物表達載體pCAMBIA2301、根癌農(nóng)桿菌(AgrobacteriumtumefaciensyM株.EHA105、植物表達載體pGreenI10229、大腸桿菌DH5 α ,均由商業(yè)購買獲得。本發(fā)明的一種植物表達載體pG II 0229-GUS，可以在農(nóng)桿菌侵染轉化上應用，也可以在基因槍轟擊轉化上應用。若⑶S基因成功導入甘蔗組織細胞并在其中表達，則甘蔗心葉被染成藍色。對構建獲得的植物表達載體pG II 0229-GUS與原植物表達載體pCAMBIA2301在農(nóng)桿菌侵染轉化和基因槍轟擊轉化上的應用進行試驗，結果如表I和表2所示。表I的試驗結果表明，甘蔗心葉在進行農(nóng)桿菌侵染轉化時，植物表達載體pG II 0229-GUS比原來的植物表達載體PCAMBIA2301的瞬時表達率提高105.7%，經(jīng)顯著性測驗，二者之間呈極顯著差異。表2的試驗結果表明，甘蔗心葉在進行基因槍轟擊轉化時，植物表達載體pG II 0229-GUS比原來的植物表達載體PCAMBIA2301的瞬時表達率提高103.1%，經(jīng)顯著性測驗，二者之間呈極顯著差
巳表I農(nóng)桿菌侵染轉化時不同植物表達載體GUS瞬時表達率的影響
權利要求
1.一種植物表達載體pG II 0229-GUS的構建方法，包括引物設計、PCR擴增和載體構建；其特征在于: (O引物設計:人工設計合成特異引物序列Forward primer: 5’ - GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’Reverse primer: 5’ - GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’ ； (2) PCR 擴增:PCR 反應體系是 IOXPCR Buffer 2.5 μ I, dNTP 2.0 μ 1,10μ mol/L 的 Forward primer 1.0 μ I, 10 μ mol/L 的 Reverse primer 1.0 μ I, 5 U/ μ I的 Ex Taq 酶 0.125 μ 1,100 ng/ μ I 的 DNA 模板 1.0 μ 1，加 ddH20 至終體積 25 μ I ；PCR程序是95 °C預變性5 min，95 °C變性30 s，56°C退火30 s，72°C延伸3 min，30個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;所述DNA模板是以pCAMBIA2301質(zhì)粒為DNA模板； (3)載體構建:將步驟(2)的PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段I，并將獲得的目的片段I用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI進行酶切，回收目的片段II，同時將pGreenI10229質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI進行酶切，回收目的片段III，將回收的目的片段II和目的片段III用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5ci中，挑取陽性克隆驗證，獲得pG II 0229-GUS載體；所述目的片段I是指用特異引物擴增出的含有35s啟動 子、GUS瞬時表達基因和nos終止子的核酸片段；目的片段II是指用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切目的片段I后2927bp的核酸片段；目的片段III是指用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切pGreenI10229質(zhì)粒DNA后4406bp的核酸片段。
2.一種植物表達載體pG II 0229-GUS在農(nóng)桿菌侵染轉化上應用。
3.一種植物表達載體pG II 0229-GUS在基因槍轟擊轉化上應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物表達載體pGⅡ0229-GUS的構建及應用。植物表達載體pGⅡ0229-GUS的構建方法，包括引物設計、PCR擴增和載體構建。本發(fā)明設計的特異引物通過PCR擴增獲得的目的片段，包含有35s啟動子、GUS瞬時表達基因和NOS終止子，是一個完整的基因表達盒；植物表達載體pGⅡ0229-GUS只有7333bp，載體質(zhì)粒小，含有左右邊界，可以在農(nóng)桿菌侵染轉化上應用，也可以在基因槍轟擊轉化上應用。在遺傳轉化甘蔗時，GUS的瞬時表達率達到65%以上，適用于甘蔗，也適用于其他植物。
文檔編號C12N15/66GK103146736SQ201310102319
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權日2013年3月28日
發(fā)明者高世武, 林慶良, 郭晉隆, 許莉萍, 王天池, 闕友雄 申請人:福建農(nóng)林大學