專利名稱：一種提高植物耐鋁能力的載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種在植物體內(nèi)構(gòu)建新的檸檬酸合成途徑以提高植物耐鋁能力的載體及構(gòu)建方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鋁是地表上第三大元素，對(duì)植物的毒性很強(qiáng)。當(dāng)土壤溶液酸化后PH值下降到一定值時(shí)，鋁離子就會(huì)從硅酸鹽或氧化物中釋放出來(lái)，溶解到土壤溶液中(Ma JF, Furukawa J. 2003. Recent progress in the research of external Al detoxification in higher plants: a minireview. J Inorg Biochem. 97:46-51)。可溶性的鋁可以分為以下幾類自由鋁或是Al (H2O)63+、聚合鋁々113及低分子量鋁化合物。隨著土壤pH值的上升，Al (H2O)63+轉(zhuǎn)變?yōu)锳1(0H)2+、A1(0H)2+。在中性土壤中，主要以難溶的Al (OH)3形式存在。在堿性條件下主要是以鋁酸鹽陰離子Al (OH)4—形式存在(Matsumoto H. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants. Int Rev Cytol. 200:1-46)。不同形態(tài)的鋁對(duì)植物的毒性有明顯的差異。目前一般認(rèn)為在PH值低于4. 5的酸性土壤中，鋁主要是以 Al (H2O)63+形態(tài)存在的，即通常所說(shuō)的Al3+，這一形態(tài)的鋁被認(rèn)為是對(duì)植物毒性最強(qiáng)的形態(tài)。鋁并不是植物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)中的必需元素，鋁毒被認(rèn)為是酸性土壤上影響作物生長(zhǎng)的主要的限制因子。微摩爾水平的鋁離子即可對(duì)植物產(chǎn)生毒害，而酸性土壤溶液中Al3+的濃度約為 10-100 μ mol/L (Ma JF. 2000. Role of organic acid in detoxification of aluminum in higher plants. Plant Cell Physiol. 41:383-390)。鋁對(duì)根的毒害作用部位是根尖，包括根冠與根分生區(qū)，因此植物發(fā)生鋁毒害的最主要癥狀是其根生長(zhǎng)受到快速受阻，這可能是鋁通過一種未知的信號(hào)傳導(dǎo)途徑間接抑制根的生長(zhǎng)。此外，鋁離子交換量占土壤中陽(yáng)離子交換總量的20% 80%，容易導(dǎo)致土壤陽(yáng)離子流失，如造成磷、鉀、鈣、鎂、硼、 鉬等營(yíng)養(yǎng)元素的缺乏。鋁也可以和磷酸基、羥基等極性基團(tuán)結(jié)合，因此它可以與細(xì)胞質(zhì)及膜蛋白結(jié)合，影響膜的結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)鋁可以和ATP形成Al-ATP復(fù)合物，使植物細(xì)胞能量代謝過程受到限制。全世界有39. 5億hm2酸性土壤，其中可耕地土壤面積為1. 79億hm2，主要分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，尤其是發(fā)展中國(guó)家(Kochian LV. 1995. Celluar .Mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plant. Annu Rew Plant physiol plant mol Biol. 46:137)。我國(guó)酸性土壤遍及南方15個(gè)省區(qū)，總面積為2030萬(wàn)hm2，約占全國(guó)土地總面積的21%。一直以來(lái)，人們通常靠大量的施用石灰，來(lái)提高土壤的pH值，使游離鋁沉淀，解除鋁毒害。但是這種方法難以徹底解決土壤酸度問題，它只能對(duì)表層土壤進(jìn)行改良，對(duì)深層土壤的酸性沒有多大的作用，同時(shí)還存在著潛在的環(huán)境問題。因此，篩選和培育耐鋁作物品種是提高酸性土壤上的作物產(chǎn)量有效且可持續(xù)的方法。許多實(shí)驗(yàn)表明，植物可以通過分泌螯合劑如有機(jī)酸或磷酸將離子態(tài)的鋁變成螯合態(tài)的鋁從而解除鋁毒害。Miyasaka等人首先發(fā)現(xiàn)，在鋁脅迫條件下，耐鋁的菜豆品種向根際環(huán)境分泌的檸檬酸比敏感品種高10倍(Miyasaka SC, Buta JG, Howell RK, Foy CD.
31991. Mechanisms of aluminum tolerance in snapbeans: root exudation of citric acid. Plant Physiol. 96(3) : 737-743)。Pellet等發(fā)現(xiàn)在鋁脅迫條件下耐鋁玉米品種分泌的檸檬酸比敏感品種高7倍(Pellet DM, Grunes DL, Kochian LV. 1995. Organic acid exudation as an aluminum-tolerance mechanism in maize {Zea mays L. ). Planta. 196(4) : 788-795)。Delhaize等從單一的主基因座(Altl)水平上對(duì)鋁有不同耐受能力的一對(duì)近似同源的小麥品系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鋁敏感品系根尖積累的鋁為耐性品系的3-8倍， 而耐性品系蘋果酸的分泌比敏感性品系高出10倍左右，這些結(jié)果說(shuō)明小麥通過蘋果酸螯合鋁離子，減少鋁離子的毒害保護(hù)根尖(Delhaize E, Craig S, Beaton CD, Bennet RJ, Jagadish VC, Randallet PJ. 1993 Aluminum tolerance in wheat {Triticum aestivum L.) : I. Uptake and distribution of aluminum in root apices. Plant Physiol. 103(3): 685 - 93； Delhaize E, Ryan PR, Randall PJ. 1993 Aluminum tolerance in wheat {Triticum aestivum L.): II. Aluminum-stimulated excretion of malic acid from root apices. Plant Physiol. 103(3) : 695 - 702)。此后，研究者對(duì)鋁誘導(dǎo)的有機(jī)酸分泌和植物耐鋁能力作了大量深入的研究和探索。有機(jī)酸的分泌也被認(rèn)為是植物耐鋁的重要機(jī)制之一。目前已證實(shí)鋁脅迫下根系分泌蘋果酸、草酸和檸檬酸。這3種有機(jī)酸都可以和鋁螯合，但他們對(duì)鋁離子的螯合能力并不相同，螯合能力由大到小依次為檸檬酸、草酸、蘋果酸。有機(jī)酸解除鋁毒的能力主要與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，即-OH、-C00H官能團(tuán)在主 C 鏈上的位置(Hue NV, Craddock GR, Adams F. 1986. Effect of organic acids on aluminum toxicty in subsoils. Soil Sci Am J. 50:28-34)。植物體內(nèi)檸檬酸的合成主要通過檸檬酸循環(huán)中檸檬酸合酶(CS)的作用完成，CS 催化來(lái)自糖酵解或其它異化反應(yīng)的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合合成檸檬酸。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4植物CO2固定的一個(gè)重要酶，也是有機(jī)酸代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HC03_生成草酰乙酸(OAA)和無(wú)機(jī)磷酸(Pi)的不可逆反應(yīng)。 很多研究結(jié)果證明通過在植物中過量表達(dá)^增加植物中CS的酶活性，可以提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鋁的耐受性，這也說(shuō)明在植物中過量表達(dá)α是一種提高植物耐鋁能力的有效手段。過量表達(dá)玉米C4型全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因水稻葉片中PEPC的活性顯著增加，從而導(dǎo)致葉中和根中有機(jī)酸含量的增加，耐鋁能力顯著增強(qiáng)(Begum HH, Osaki Μ, Watanabe Τ, Shinano Τ. 2009. Mechanisms of aluminum tolerance in phosphoenolpyruvate carboxylase transgenic rice. J Plant Nutr. 2(1) : 84-96)。這些研究結(jié)果說(shuō)明PEPC的過量表達(dá)也能提高植物抗鋁毒能力。在大豆和菜豆的耐鋁型栽培種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CS和PEPC的活性在鋁脅迫下增加，這有助于有機(jī)酸的合成和分泌，增強(qiáng)植物的耐鋁能力。切除莖的植物及在黑暗條件下生長(zhǎng)的植物有機(jī)酸的分泌量顯著減少，這說(shuō)明光合作用和植物在鋁脅迫下有機(jī)酸的分泌活動(dòng) W^ffi^ (Range 1 AF, Rao IM, Braun H-P, Horst WJ. 2010. Aluminium resistance in common bean {Phaseolus vulgaris) involves induction and maintenance of citrate exudation from root apices. Physiol Plant. 138(2): 176-190; Yang ZM, Nian H, Sivaguru M, Tanakamaru S, Matsumoto H. 2001. Characterization of aluminium-induced citrate secretion in aluminium-tolerant soybean {Glycine max) plants. Physiol Plant. 113(1) : 64-71)。1，5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表達(dá)量最大的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的含量占植物細(xì)胞中可溶性蛋白的40-50%。控制rbcS 基因表達(dá)的啟動(dòng)子為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)，PrbcS的作用有很強(qiáng)的組織特異性，需要光信號(hào)的誘導(dǎo)，在葉片中的表達(dá)最強(qiáng)，常被用來(lái)實(shí)現(xiàn)目的基因在葉片中的高水平表達(dá)。現(xiàn)有的一些研究通過在在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)有機(jī)酸代謝相關(guān)酶的基因都能增加有機(jī)酸的分泌，從而提高植物耐鋁能力。但這些研究都是在植物中過量表達(dá)一種基因， 目前還沒有在植物中過量表達(dá)兩個(gè)或以上基因大幅提高植物耐鋁能力的報(bào)道。此外，現(xiàn)有的研究都利用組成型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)有機(jī)酸代謝相關(guān)基因，有些轉(zhuǎn)基因植物在正常條件下生長(zhǎng)時(shí)個(gè)體比對(duì)照植物小，這種現(xiàn)象被認(rèn)為可能是由于有機(jī)酸不斷分泌到植物體外而消耗大量碳源引起的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在植物體構(gòu)建新的檸檬酸以提高植物耐鋁能力的方法利用PrbcS啟動(dòng)子在煙草葉片細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)表達(dá)cs和ρ印c，通過PEPC的作用利用糖酵解產(chǎn)生的PEP生成更多的草酰乙酸，而草酰乙酸含量的增加使CS有更多的底物合成檸檬酸，這樣可在細(xì)胞質(zhì)中構(gòu)建一條檸檬酸合成途徑，以期增加檸檬酸的合成，從而進(jìn)一步提高植物對(duì)鋁的抗性。同時(shí)提供過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達(dá)載體，該載體是含有嗜熱藍(lán)藻(Synechococcus vulcanus)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(即PEPC基因)的植物表達(dá)載體。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明所提供的用于提高植物耐鋁毒能力的載體，是具有光誘導(dǎo)啟動(dòng)子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達(dá)載體。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因來(lái)源于嗜熱藍(lán)藻(Synechococcus vulcanus)0 所述的來(lái)源于嗜熱藍(lán)藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC (登錄號(hào)為AB057454)的一個(gè)突變體(889位的Lys被突變成了 Ser)，該突變體PEPC對(duì)蘋果酸的反饋抑制不敏感。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游為Rubisco小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述載體中，用于構(gòu)建所屬植物表達(dá)載體的起始載體為pH2GW7 (購(gòu)自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。本發(fā)明的上述植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-PEPC由下述方法構(gòu)建而成
(1)從GenBank中查找嗜熱藍(lán)藻PEPC的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物 ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘
ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘ 5’端引物ρ印c5，末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位點(diǎn)；3’端引物ρ印c3， 末端加損ol酶切位點(diǎn)；以本申請(qǐng)人構(gòu)建的一個(gè)入門質(zhì)粒載體pENTR 2B-KsPEPC (Chen LM. Genetic Engineering of photosynthesis in C3 plant. Yunnan: Yunnan Science and Technology press, 2008)為模板擴(kuò)增得到PEPC突變體的全長(zhǎng)編碼區(qū)的DNA片段；
(2)回收并純化PEPC全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pUCm-PEPC ；
(3)構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC，用 Nco I 和 Xho I 切割 pENTR*-PrbcS-*T_GFP (pENTR*-PrbcS-*T-GFP的構(gòu)建方法見申請(qǐng)?zhí)枮?00710066422. 9的申請(qǐng))和pUCm-PEPC，回
5收載體pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)，獲得重組質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-PEPC ；
(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-PEPC，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把 PrbcS-PEPC亞克隆到植物表達(dá)載體pH2GW7 (Gateway的目的載體)中，獲得PEPC基因的植物表達(dá)載體 pH2-35S-PrbcS-PEPC。本發(fā)明利用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS構(gòu)建PEPC基因的植物表達(dá)載體，同時(shí)在植物中轉(zhuǎn)化PPZP211-PrbcS-cs植物表達(dá)載體(pPZP211-PrbcS-cs的構(gòu)建方法見申請(qǐng)?zhí)枮?200710066419. 7的申請(qǐng))，以便在轉(zhuǎn)基因植物葉片的細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)過量表達(dá)PEPC基因和CS 基因，在植物細(xì)胞之中構(gòu)建新的檸檬酸合成途徑。直接利用光合作用產(chǎn)物通過糖酵解途徑產(chǎn)生的碳骨架合成檸檬酸，使之分泌到細(xì)胞外，最后通過根系進(jìn)入到土壤中，螯合土壤中的鋁離子，解除酸性土壤中高濃度的鋁對(duì)植物的毒害，提高轉(zhuǎn)基因植物耐鋁毒的能力。將植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-PEPC通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或其它物理、化學(xué)方法導(dǎo)入植物組織并整合到植物基因組中，再將植物表達(dá)載體pPZP211-PrbcS-cs導(dǎo)入含有PEPC 基因的植物組織并整合到轉(zhuǎn)基因植物基因組中，得到含PEPC和CS的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的專用載體旨在用于提高植物對(duì)鋁毒的耐受能力，對(duì)單子葉和雙子葉植物都適用，如煙草、 水稻、大豆、小麥等。本發(fā)明轉(zhuǎn)PEPC和CS基因的煙草植株檸檬酸合成酶活性是野生型煙草的2. 4 2. 6倍，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性是野生型煙草的2. 2 2. 4倍。用13C NMR分析 NaH13CO3在轉(zhuǎn)基因植物中的代謝譜，結(jié)果顯示在鋁脅迫條件下，同時(shí)轉(zhuǎn)和G基因煙草中來(lái)自NaH13CO3的13C代謝流進(jìn)入葡萄糖或果糖后通過糖酵解途徑進(jìn)入有機(jī)酸如0AA(PEPC 反應(yīng)的產(chǎn)物)和檸檬酸(CS反應(yīng)的產(chǎn)物)及蘋果酸的流量都高于野生型煙草和單轉(zhuǎn)CS的煙草，說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因煙草中基因和^基因的過量表達(dá)成功地構(gòu)建了一條新的檸檬酸合成途徑，使轉(zhuǎn)基因煙草中檸檬酸的合成量顯著增加。在受到鋁脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)和^基因的煙草檸檬酸的分泌量是野生型的3. 8 4倍，根系生長(zhǎng)良好，能提高植物對(duì)鋁毒的抗性。本發(fā)明的專用載體能在提高植物(如煙草)對(duì)鋁毒的耐受性方面發(fā)揮很大作用，特別是在中國(guó)南方酸性紅壤中，可顯著促進(jìn)植物對(duì)鋁毒的耐受能力，因而也為植物品種改良提供了一條新途徑。


圖1為在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞質(zhì)中構(gòu)建新的檸檬酸合成途徑策略； 圖2為中間載體的構(gòu)建策略；
圖3為中間載體的檢測(cè)
A 重組質(zhì)粒的 PCR 檢測(cè)1 :DNA Marker III ；2_3 以 pUCmjiffl/7 為模板，用
引物pepc5和pepc3擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物；
B -.Hind IlWEcoR I 分別酶切檢驗(yàn) pUCm-/ ^1。1 =PUCiiitcEdC 重組質(zhì)粒；2-3 -.Hind III 酶切 pUCm-Z^/T 重組質(zhì)粒；4_5 -.EcoR I 酶切 pUCm-Z^/T 重組質(zhì)粒；6 :DNA Marker III ；
C -.Nco I 和損ο I 雙酶切檢驗(yàn) pUCm-/^/^。1 :DNA Marker III ；2 -.Nco I 和損ο I 雙酶切PUCmTcE^重組質(zhì)粒；3重組質(zhì)粒。圖4為入門克隆載體pENTR*-PrbcS_/忍/C的構(gòu)建策略；圖5為入門克隆載體pENTR*-PrbcS-/ T的檢測(cè)
A 重組質(zhì)粒 pENTR^-PrbcS-Z^/T的 PCR檢測(cè)；1_5 以 pENTR^-PrbcS-/^/^質(zhì)粒為模板， 利用ρ印c5和ρ印c3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；6 =DNA Marker III ；
B 用 BatnHl 和 Sma\ 雙酶切檢驗(yàn) pENTI^-PrbcS-/^/^ ;1 :DNA Marker III ；2-5 -.BamHl 和 Smal 雙酶切 pENTt^-PrbcS-Z^/T重組質(zhì)粒；6 :pENTR*-PrbcS-Z^CMi ； 圖6為用Gateway的LR反應(yīng)構(gòu)建/^/C基因的植物表達(dá)載體策略； 圖7為PEPC植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-/^/T的檢測(cè)和農(nóng)桿菌菌落的PCR檢測(cè) A M BamHl 和 Smal 雙酶切檢驗(yàn) pffi-SSS-PrbcS-/^/^ ； 1_2 M BamHl 和 SmaY 雙酶切 Pffi-SSS-PrbcSTcST 質(zhì)粒；3 :DNA Marker III ；
B 轉(zhuǎn)化 Pffi-SSS-PrbcSTcST 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 PCR 檢測(cè)；1 :DNA Marker III ；2 以 pH2-35S-PrbcS-/忍/C質(zhì)粒為模板，利用ρ印c5和ρ印c3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；3 以 PH2GW7質(zhì)粒為模板，利用pepc5和ρ印c3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；4 以農(nóng)桿菌菌落為模版，利用P印c5和ρ印c3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；
圖8為PEPC和CS在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況以及轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) A Southern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中α基因插入情況；以CS基因的寡居核苷酸片斷為探針作Southern blot分析；pcsl, pcs4, pcsl4 -難PEPC^cs的雙轉(zhuǎn)基因煙草；rcsl, rcs4, rcsl4 只轉(zhuǎn)α的單轉(zhuǎn)基因煙草；WT 未轉(zhuǎn)基因的野生型煙草(負(fù)對(duì)照)；
B =Southern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中/^/T基因插入情況；以PEPC基因的寡居核苷酸片斷為探針，作Southern blot分析；ρ印c2，pepcl4, ρ印cl7 只轉(zhuǎn)基因的單轉(zhuǎn)基因煙草，其他株系的名稱與A中的描述相同；
C =RT-PCR檢測(cè)煙草中CS基因的轉(zhuǎn)錄水平；Marker =DNA Marker III ；cs 正對(duì)照(以質(zhì)粒pPZP211-PrbcS-cs為模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；
D :RT-PCR檢測(cè)煙草中PEPC基因轉(zhuǎn)錄水平；Marker =DNA Marker III ；pepc 正對(duì)照(以質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-/忍/C為模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物； 圖9為PEPC和CS在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶活性測(cè)定 A =CS在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶活性測(cè)定； B =PEPC在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶活性測(cè)定；
圖10為IO13C-NMR分析50 μ mol · L-1鋁脅迫24h后轉(zhuǎn)基因煙草中NaH13C03代謝譜； 圖11為13C-NMR分析沒有鋁脅迫時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草中NaH13C03代謝譜； 圖12為轉(zhuǎn)基因煙草檸檬酸分泌量的測(cè)定 A 轉(zhuǎn)基因煙草在無(wú)鋁脅迫條件下檸檬酸的分泌量； B 轉(zhuǎn)基因煙草在30 μ mol/L的AlCl3脅迫下檸檬酸的分泌量； 圖13為PEPC和CS雙轉(zhuǎn)基因煙草在鋁毒脅迫下根相對(duì)生長(zhǎng)率的測(cè)定； 圖14為轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁毒脅迫的沙質(zhì)土壤中地上部分的生長(zhǎng)情況及株高；A和B轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁脅迫的沙質(zhì)土壤中的生長(zhǎng)狀況C轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁脅迫的沙質(zhì)土壤中生長(zhǎng)時(shí)的株高；
圖15為轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁脅迫的沙質(zhì)土壤中根部的生長(zhǎng)情況及根干重； A 轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁脅迫的沙質(zhì)土壤中根的生長(zhǎng)情況； B 轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁脅迫的沙質(zhì)土壤中根的干重。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1 基因擴(kuò)增及TA克隆
/WT基因DNA編碼區(qū)的擴(kuò)增及TA克隆策略如圖2所示，首先根據(jù)PEPC基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列如下
ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘ ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘
5，端引物ρ印c5末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位點(diǎn)；3，端引物ρ印c3 末端加損ο I酶切位點(diǎn)。以構(gòu)建的一個(gè)含有嗜熱藍(lán)藻突變體基因的入門載體pENTR 2B-KsPEPC(Chen LM. Genetic Engineering of photosynthesis in C3 plant. Yunnan: Yunnan Science and Technology press, 2008)為模板，用PEPC特異引物ρ印c5和ρ印c3擴(kuò)增得到突變體 Λ57Τ全長(zhǎng)基因的編碼區(qū)DNA片段(3. 0Kb)，回收并純化PEPC全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到 PUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進(jìn)一步的PCR檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)。以重組質(zhì)粒為模板，用引物P印c5和ρ印c3引物擴(kuò)增得到3. Okb的PCR產(chǎn)物(圖3A)。根據(jù)/^/T片段上的酶切位點(diǎn)，用BernHl和Sma\雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pUCm-PEPC含有3. Okb左右的PEPC插入片段(圖2B)。根據(jù)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pUCm-PEPC載體兩端的多克隆位點(diǎn)，用AfcoI和損ol雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pUCm-PEPC含有3. Okb左右的DNA插入片段(圖 3C)。實(shí)施例2 入門克隆載體pENTR*-PrbcS_PEPC的構(gòu)建策略
Λ57Τ基因入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC的構(gòu)建策略如圖4所示，首先用NcoI和XhoI 切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-PEPC，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后產(chǎn)生的載體片斷 pENTR*-PrbcS (4. Okb)及 pUCm-PEPC 被切割產(chǎn)生的 PEPC 基因的 DNA 片斷(3. Okb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTR*_PrbcS和/^/C基因的DNA片斷產(chǎn)生入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5 α，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50 mg/ml)的平板上，于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出連接成功的質(zhì)粒載體 pENTR*-PrbcS-PEPC，用/^/C上下游的特異性引物ρ印c5和ρ印c3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選的質(zhì)粒都能擴(kuò)增出一條3. Okb的PEPC條帶(圖5A)。用NcoI和XhoI雙酶切檢測(cè)，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上有3. O kb的/^/C基因片段(圖5B)。確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-PEPC。實(shí)施例3 =PEPC基因植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS_PEPC的構(gòu)建策略
通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把PrbcS-PEPC亞克隆到植物表達(dá)載體pH2GW7 (Gateway 的目的載體)中(圖6)。具體的做法是用質(zhì)粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pH2GW7， 在 Gateway 的 LR反應(yīng)體系中加 pENTR*-PrbcS-PEPC和 pH2GW7 各 150 ng, 1 μ 1 LR ClonaseII Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25°C反應(yīng)過夜，通過整合酶的作用把PrbcS-PEPC整合到pH2GW7中獲得PEPC的植物表達(dá)載體質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-PEPC (圖6)。用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素 (Spe,50 mg/ml)的平板上，于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出大小和理論預(yù)測(cè)值相符的整合質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-PEPC進(jìn)行檢測(cè)， 用基因內(nèi)部的酶切位點(diǎn)用BamHl和SmaY雙酶切重組質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS_PEPC，可以得到2. 5 kb的片段(圖7A)。確認(rèn)是整合成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。PH2GW7攜帶的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?(Hgr)，這樣可用加有潮霉素的平板篩選轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)施例4 用基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體 pH2-35S-PrbcS-PEPC轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中， 輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD)滑槽中，用1 mm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入 0.5ml SOC培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1.5 ml的離心管中；28°C,200 rpm搖床培養(yǎng)3_5h ；室溫下， 7500 rpm離心1 min，棄大部分上清，保留100 μ 1將細(xì)胞懸浮；把農(nóng)桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe，50 mg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入20 μ 1 ddH20中，98°C處理5分鐘后取出5 μ 1農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。用/^化基因的上下游的特異性引物P印c5和ρ印c3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選的菌落能擴(kuò)增出一條3. 0 kb的條帶(圖7B)，經(jīng)菌落PCR確認(rèn)的轉(zhuǎn)化子菌落用于轉(zhuǎn)化植物。實(shí)施例5 用含有基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草
挑取攜帶有質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-PEPC的農(nóng)桿菌單菌落接種于50 ml的LB培養(yǎng)基中(含 Spe, 100 mg/ml)，180rpm，28。C 培養(yǎng) 24 h，待菌液 OD6tltl 至 1. 0 左右，離心 10 min(3000rpm), 沉淀菌體。再用10 ml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心10 min (3000rpm)，沉淀菌體。重復(fù)以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。 制備煙草OVicoiiaaa tabacum cv. Xanth)的無(wú)菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進(jìn)一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無(wú)菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15-20 min，用無(wú)菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSl (MS+NAA 0.21 mg/ml+BAP 0. 02 mg/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含潮霉素(25 mg/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4 (MS+NAA 0.53 mg/ml+BAP 0.5 mg/ml) 上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含潮霉素(25 mg/ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)。實(shí)施例6 含有α基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化含有/^/C的轉(zhuǎn)基因煙草
挑取攜帶有質(zhì)粒pPZP211-PrbcS-CS的農(nóng)桿菌單菌落(見本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專利申請(qǐng)， 申請(qǐng)?zhí)枮?00710066419. 7)接種于50 ml的LB培養(yǎng)基中(含Spe，100 mg/ml)，搖菌及懸浮方法同實(shí)施例5。制備Λ57Τ轉(zhuǎn)基因煙草的無(wú)菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化已插入 /WT基因的煙草，愈傷組織的培養(yǎng)同實(shí)施例5，將外植體轉(zhuǎn)移至含潮霉素(25 mg/ml)和卡那霉素(50 mg/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4 (MS+NAA 0. 53 mg/ml+BAP 0.5 mg/ml)上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含潮霉素05 mg/ml)和卡那霉素(50 mg/ ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)。實(shí)施例7 M和/ 1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 為了確認(rèn)通過潮霉素和卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實(shí)含有導(dǎo)入的目的基因的
DNA片段，用PCR方法對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進(jìn)一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組稱取植物葉片100 mg左右置于1.5 ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入 900 “1預(yù)熱到65。(的2\07^緩沖液(111^8-!1(1 pH 7.5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, CTAB觀)，65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，離心10 min (7500 rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1.5 ml EP管；再次加入500 μ 1 氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，離心10 min (7500 rpm);取出上清置于新的EP管中，加 Λ 1/10體積3Μ ρΗ5· 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20 min( 12000 rpm);棄上清，用75%乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組 DNA樣品。用Kpn I消化20 mg基因組DNA，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分離消化后的DNA， 用0.4 mol L—1 NaOH作Southern印跡，通過毛細(xì)管作用把酶切的基因組DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜 (Hybond-N+ membrane)上。檢測(cè)α基因的Southern雜交用生物素標(biāo)記的含有α基因編碼區(qū)特異的寡核酸探針 5 ‘ -Biotin-AGACCAGAAGAGGTTTGGACTTGAAGCCACCGCACAG AGT-3 ‘ 作雜交試驗(yàn)。檢測(cè)/ 1基因的Southern雜交用生物素標(biāo)記的含有/ 1基因編碼區(qū)特異的寡核酸探針為 5' -Biotin- GAGGATCTCAAGCACGCCCCAGCGGTGCTGACCCAACTATT-3 ‘。在 37。C 預(yù)雜交液中預(yù)雜交6 h后，加入適量探針進(jìn)行過夜雜交。雜交結(jié)束后，用洗膜液(2X SSC和 0. 1% SDS)于37°C洗膜2次，每次15 min。然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，再加入偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的生物素抗體(Invitrogen)孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(SuperSignal Western Blotting Kits，Pierce)檢測(cè)雜交信號(hào)。對(duì)cs的Southern雜交結(jié)果如圖8A所示，3 個(gè) C1S 和雙轉(zhuǎn)基因煙草株系(pcsl, pcs4, pcsl4)和 3 個(gè) pPZP211-PrbcS-cs 轉(zhuǎn)基因株系(rcsl，rcs4, rcsl4)都有2條以上的雜交帶，而野生型(WT)只有一條雜交帶，這說(shuō)明所轉(zhuǎn)的^基因cDNA已成功插入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中。對(duì)PEPC的Southern雜交結(jié)果如圖8B所示，pcsl、pcs4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因株系和3個(gè)pH2-35S-PrbcS-pepc轉(zhuǎn)基因株系(P印c2，pepcl4, ρ印cl7)都有雜交帶，而野生型則沒有，這說(shuō)明所轉(zhuǎn)的/ 1基因已成功插入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中。為了考察目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測(cè)G和/ ’/C基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA，取植物嫩葉約 0. 1 g，加入 1 ml 的 TRIzoL 提取液在研缽中研磨，室溫靜置5 min后移入離心管，再加入0. 2 ml氯仿，振蕩混勻，離心15 min (12000 rpm)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5 ml異丙醇，混勻室溫放置10 min，4°C離心10 min( 12000 rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇1 ml清洗，4°C離心5 min(7500 rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量和濃度。使用Reverse Transcriptase進(jìn)行cDNA的合成，取植物總RNA約 0.1 μ g-5 μ g,oligo (dT) 50 ng, 10 mM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC處理水補(bǔ)足至 10 μ ，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5 min，冰浴10 min，加入反應(yīng)混合物9 μ (5Xreaction buffer 4 μ 1,25 mM MgCl2 4 μ 1,0. IM DTT 2 μ 1，RNA酶抑制劑 1 μ 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫2 min，加入1 μ M-MuLV Reverse Transcriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫20 min,然后42°C 保溫70 min，合成cDNA。以cDNA為模板，檢測(cè)cs用編碼區(qū)的兩個(gè)上下游引物cs5 (5'-ATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3 ‘)和 cs3(5' -TCATGCTTTCTTGCAATGGTTC-3 ‘)，檢測(cè) ρ印c 用位于編碼區(qū)內(nèi)的兩個(gè)上下游引物P印cp5 (5' -ATTAGCTCACGGCCAACACG-3‘)和ρ印cp3 (5' -TTAGCCTGTATTGCGCAT CCC-3‘)。用煙草 18s rRNA 作為內(nèi)參，擴(kuò)增 18s rRNA cDNA所用上下游引物為 18S5(5' -GGGCATTCGTATTTCATAGTCAG-3‘)和 18S3(5' -AAGGGATACCTCC GCATAGC-3')。對(duì)α的RT-PCR分析結(jié)果如圖8C所示，pcsl、pcs4、pcsl4雙轉(zhuǎn)基因株系和 rcsl、rcs4、rcsl4轉(zhuǎn)基因株系α基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于野生型。%ρ印c的RT-PCR 分析結(jié)果如圖8D所示，pcsl、pcs4、pcsl4雙轉(zhuǎn)基因株系和ρ印c2、ρ印cl4、ρ印cl7轉(zhuǎn)基因株系可擴(kuò)增出與正對(duì)照相同的目的條帶，而以野生型煙草則沒有明顯的目的基因條帶。這些結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)入的^和/^/C基因在轉(zhuǎn)基因植物中有較高的轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因煙草中CS和PEPC的活性分析
選取經(jīng)RT-PCR分析表明有目的基因的轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)基因煙草植株測(cè)定檸檬酸合成酶的活性。從煙草葉片中抽提可溶性蛋白，取0.2 g煙草葉片，加1 ml蛋白抽提液[100 mM Tris-HCl (pH 7.5) ； 10% (V/V)甘油；10 mM 巰基乙醇；1 mM PMSF ；5%(ff/V) PVP]研磨，轉(zhuǎn)移至EP管中，13000 r/min離心25 min (4°C)。將上清移到新的EP管中，用Bradford方法測(cè)定植物上清中的蛋白質(zhì)濃度。檸檬酸合成酶的活性測(cè)定按Anoop等(Anoop VM, Basu U, Mccammon MT, McAlister-Henn L, Taylor GJ. 2003. Modulation of citrate metabolism alters aluminium tolerance in yeast and transgenic canola overexpressing a mitochondrial citrate synthase. Plant Physiol, 132(4) : 2205—2217)的方法進(jìn)fiS 原理為L(zhǎng)-蘋果酸在蘋果酸脫氫酶的作用下生成草酰乙酸，而草酰乙酸極不穩(wěn)定，在檸檬酸合成酶和乙酰輔酶A的作用下，能夠生成檸檬酸。在該反應(yīng)中，通過測(cè)定波長(zhǎng)為340 nm處 NADH的增加量從而獲得CS的相對(duì)酶活性。測(cè)定CS酶活性的反應(yīng)體系為0.05 M Tris-HCl (pH 7. 5)，10 mM L-Malate, 10 U MDH, 0. 5 mM NAD，在 Iml 的反應(yīng)體系中加入 100 μ g 煙草蛋白樣品。在紫外分光光度儀上測(cè)其340 nm處的吸收值(0D值)，待讀數(shù)穩(wěn)定后，加入 10 μ L 4 mM CoA (乙酰輔酶A)，在Imin之內(nèi)檢測(cè)340 nm處的吸收值。計(jì)算兩次讀數(shù)的差值，得到CS酶活性數(shù)據(jù)。其中rcsl、rcs4和rcsl4轉(zhuǎn)基因株系的CS酶活性是野生型的 2-2. 4倍，pcsUpcs4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因煙草的CS酶活性是野生型的2. 4-2. 6倍(圖9A)。PEPC酶活測(cè)定參照Ku等(Ku MSB, Agarie S, Nomura Μ, Fukayama H, Tsuchida H, Ono K, Hirose S, Toki S, Miyao Μ, Matsuoka Μ. 1999. High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Nature Biotechnology, 17(1) : 76-80)的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系為 50 mM Tris-HCl ( pH 8· O )， IOmM MgSO4,10 mM KHCO3, 5 mM 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，0. ImM NADH，蘋果酸脫氫酶(MDH， 約IOU )，反應(yīng)液總體積1 ml，30°C水浴預(yù)溫10 min，以加入酶粗提物來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)，迅速檢測(cè) 340 nm下每隔60 s吸光度的下降速率。結(jié)果顯示ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7轉(zhuǎn)基因株系的 PEPC酶活性是野生型的2. 1-2. 3倍，pcsl、pcs4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因煙草的PEPC酶活性是野生型的2. 2-2. 4倍(圖9B)。這也說(shuō)明pcsl、pcs4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因煙草葉中CS和PEPC
11的酶活性都增強(qiáng)。實(shí)施例9 =NaH13CO3標(biāo)記試驗(yàn)和13C-NMR分析
為了確定在煙草葉片中過量表達(dá)的M和/確實(shí)能利用光合作用合成的糖通過糖酵解產(chǎn)生的PEP增加檸檬酸的合成，首先將煙草植株浸入150 mL的NaH13CO3處理液(5 mmol Γ1 NaH13CO3,0. 1% MES (w/v, pH 5. 7))中，在 25° C 條件下持續(xù)光照(100 Mmol πΓ2 s — 1) 并振蕩培養(yǎng)(100 rpm)5 h，然后取出煙草植株用蒸餾水洗盡植物表面的殘留的NaHuCO3，再分別置于 150 mL 含 50 μ mol Γ1 AlCl3 和不含 AlCl3 的 CaCl2 (0.5 mmol ΛρΗ4·3)溶液中，于25°C恒定光照(100 mmol m_2 s—1)下處理M h，用預(yù)冷無(wú)菌蒸餾水沖洗植物表面的處理液后，用吸水紙吸去表面水分后將葉片在液氮中速凍并在研缽中磨成粉末，加入4 mL 100 mmol L—1磷酸鉀緩沖液(KPB，pH 7. 4)抽提。抽提液在沸水浴處理3 min使酶失活后離心(12000 X g) 10 min去除細(xì)胞碎片。上清液被冷凍抽干后溶于0. 5 mL的100 mmol Γ1 KPB緩沖液中，再轉(zhuǎn)移樣品至5 mm核磁管，加入2H2O至5% (ν/ν)，并將封入毛細(xì)管的甲酰胺插入核磁管中作為內(nèi)參與樣品一起進(jìn)行13C-NMR分析。13C-NMR分析方法參照Chen等 (Chen LM, Yurimoto H, Li KZ, et al. Assimilation of formaldehyde in transgenic plants due to the introduction of the bacterial ribulose monophosphate pathway genes. Biosci Biotechnol Biochem, 2010，74(3) : 627-635)的方法進(jìn)行，"C NMR 數(shù)據(jù)通過布魯克核磁共振儀(DRX 500-MHz)獲得，參數(shù)如下寬帶質(zhì)子去耦，5-ms (90° )脈沖， 譜寬37594 Hz，采樣時(shí)間0.5 s，延滯時(shí)間1.2 s，樣品溫度保持在25° C，每個(gè)樣品采集 32000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，掃描1200次，處理數(shù)據(jù)時(shí)線寬為4 Hz0樣品中各[13C]共振峰的化學(xué)位移參照馬來(lái)酸亞甲基碳原子共振峰(130. 66 ppm)。在計(jì)算不同樣品中[1-13C]代謝物的相對(duì)含量時(shí)，目標(biāo)共振峰以甲酰胺為內(nèi)參進(jìn)行積分。用13C-NMR分析有鋁脅迫下和無(wú)鋁脅迫轉(zhuǎn)基因煙草株系(pCSl，rCSl)中CS和PEPC 催化的反應(yīng)底物和產(chǎn)物的含量變化。用未經(jīng)任何處理的野生型煙草作為對(duì)照檢測(cè)煙草葉片中各種背景1弋-NMR共振信號(hào)的水平(圖10E和圖11D)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首先用NaHuCO3做 5 h的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，通過光合作用的CO2同化途徑使葡萄糖和果糖的碳原子被13C標(biāo)記上(圖 10D)，然后再進(jìn)行有鋁(圖10)和無(wú)鋁脅迫(圖11)的處理16 h，觀察進(jìn)入糖的1V在有機(jī)酸中的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有鋁脅迫下，在雙轉(zhuǎn)^和/76 ^基因煙草的13C-NMR共振譜(圖10B) 中，PEPC反應(yīng)的產(chǎn)物OAA的共振信號(hào)峰(22. 52 ppm)比WT (圖10C)和單轉(zhuǎn)CS基因煙草 (圖10A)的強(qiáng)。同時(shí)在α和/76·/^雙轉(zhuǎn)基因煙草的13C-NMR共振譜(圖10B)中，CS反應(yīng)的產(chǎn)物檸檬酸(Cit)的共振信號(hào)峰(70. 13 ppm)也比WT (圖10C)和CS轉(zhuǎn)基因煙草(圖10A) 的強(qiáng)，說(shuō)明^的過量表達(dá)增加其合成量，使PEPC反應(yīng)產(chǎn)生的OAA被有效轉(zhuǎn)化成Cit。在α 和/7印c雙轉(zhuǎn)基因煙草的13C-NMR共振譜(圖10Β)中，蘋果酸Mal的共振信號(hào)峰(64. 93 ppm) 也比WT (圖10C)和α轉(zhuǎn)基因煙草(圖10Α)的強(qiáng)，說(shuō)明PEPC的過量表達(dá)也增加其合成量， 可能是由于PEPC的作用生成較多的OAA也有助于Mal的合成。在無(wú)鋁脅迫下，α和/76·/^ 雙轉(zhuǎn)基因煙草的13C-NMR共振譜(圖11Α)與WT (圖11C)和CS轉(zhuǎn)基因煙草(圖11Β)相比差別不大，但是在WT的13C-NMR共振譜中發(fā)現(xiàn)丙酮酸(ΡΑ，15.17 ppm)比較強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)基因煙草中沒有這兩種共振峰。實(shí)施例10 轉(zhuǎn)基因煙草植株根分泌檸檬酸的測(cè)定
選取形態(tài)大小相對(duì)均一的小苗，分別置于50 mL含300 μ mol Γ1 AlCl3和不含AlCl3的 CaCl2 (0.5 mmol Γ1，pH4. 3)溶液中，于 25°C 恒定光照(100 μ mol m2 下處理 72 h， 每天更換新鮮的處理液，收集處理液濃縮干燥后溶于1 mL蒸餾水中，檸檬酸的分泌量用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草檸檬酸分泌量的分析結(jié)果如圖12所示，在無(wú)鋁脅迫的酸性條件下，rcsl、rcs4和rcsl4轉(zhuǎn)基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的 1. 8-1. 9倍，ρ印c2、pepcl4和ρ印cl7轉(zhuǎn)基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的1. 3-1. 4倍， pCSl、pCS4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因植株的檸檬酸分泌量是野生型的2. 5-2. 7倍(圖12A)。在300 μ mol L-1AlClJ辦迫的酸性條件下，rcsl、rcs4和rcsl4轉(zhuǎn)基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的2. 7-3. 3倍，ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7轉(zhuǎn)基因植株檸檬酸的分泌量是野生型的1. 3-1. 5 倍，pcsUpcs4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因煙草的檸檬酸分泌量是野生型的3. 8-4倍(圖12B)。實(shí)施例11 轉(zhuǎn)基因煙草植株在鋁毒脅迫下根伸長(zhǎng)速率的測(cè)定
根的相對(duì)伸長(zhǎng)率(Al3+處理與對(duì)照(無(wú)Al3+處理)的根系伸長(zhǎng)量的百分比。)是衡量植物耐Al性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，因此我們還測(cè)定在鋁毒脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株根相對(duì)生長(zhǎng)率。 將大小均勻一致的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草幼苗，分別置于AlCl3濃度為30 μ mol/L的 CaC12溶液中。處理24小時(shí)之后，測(cè)量供試植株根的生長(zhǎng)量，重復(fù)5次。結(jié)果表明30 μ mol Γ1的AlCl3處理煙草植株24 h后，野生型煙草根相對(duì)伸長(zhǎng)量為39%，rcsl、rcs4和rcsl4 轉(zhuǎn)基因植株根相對(duì)伸長(zhǎng)量為84-90%，ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7轉(zhuǎn)基因植株的根相對(duì)伸長(zhǎng)量為57-64%, pcsl、pcs4和pcsl4雙轉(zhuǎn)基因煙草的根相對(duì)伸長(zhǎng)量為102-115% (圖13)。由此可見轉(zhuǎn)雙基因植株的鋁抗性比單基因煙草和野生型煙草強(qiáng)，其根生長(zhǎng)不受抑制。實(shí)施例12 轉(zhuǎn)基因煙草植株在鋁毒脅迫的沙質(zhì)土壤中的生長(zhǎng)情況分析 將大小均勻一致且生根良好的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗以及野生型煙草幼苗移載到新的珍珠
巖基質(zhì)中，在溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每星期澆灌含有0.5 mM A1C13的Blaydes培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液兩次，六周后觀察其生長(zhǎng)狀況，用卷尺測(cè)定株高。用清水將根部的細(xì)沙沖洗干凈后觀測(cè)根部生長(zhǎng)狀況，將根部烘干后測(cè)定根部干重。結(jié)果顯示rcsl、rcs4轉(zhuǎn)基因植株和pcsl、pcs4雙基因植株生長(zhǎng)良好，并且已經(jīng)出現(xiàn)花蕾。然而野生型煙草植株生長(zhǎng)明顯受阻，植株矮小，發(fā)育遲緩(14A)。P印c2、p印cl4轉(zhuǎn)基因株系和野生型并沒有太明顯的差異(圖14B)。通過對(duì)煙草植株高度的測(cè)量發(fā)現(xiàn)rcsl、 rcs4轉(zhuǎn)基因煙草的株高為野生型煙草的1. 4-1. 5倍，ρ印c2、pepcl4轉(zhuǎn)基因煙草的株高為野生型煙草的1-1. 2倍，pcsl、pcs4雙轉(zhuǎn)基因煙草的株高為野生型煙草的1. 7-1. 8倍(圖 14C)。用清水將煙草根部沖洗干凈后觀察根部的長(zhǎng)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)rcsl、rcs4轉(zhuǎn)基因煙草和 pcsl、pcs4雙轉(zhuǎn)基因煙草根部的生物量明顯高于野生型煙草(圖15A)。將根烘干后測(cè)定其干重發(fā)現(xiàn)，rcsl、rcs4轉(zhuǎn)基因煙草的根部干重是野生型的2. 4 2. 5倍，ρ印c2、pepcl4轉(zhuǎn)基因煙草的根部干重是野生型的1. 2 1. 3倍，pcsl、pcs4雙轉(zhuǎn)基因煙草的根部干重是野生型的3. 4 3. 7倍(圖15B)。
1權(quán)利要求
1.一種用于提高植物耐鋁毒能力的載體，其特征在于是具有光誘導(dǎo)啟動(dòng)子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因來(lái)源于嗜熱藍(lán)藻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述的來(lái)源于嗜熱藍(lán)藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC的一個(gè)突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的載體，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游為Rubisco小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的載體，其特征在于所述載體中用于構(gòu)建所屬植物表達(dá)載體的起始載體為PH2GW7。
6.一種用于提高植物耐鋁毒能力的載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括下列技術(shù)方案(1)從GenBank中查找嗜熱藍(lán)藻PEPC的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物 ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘5’端引物ρ印c5，末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位點(diǎn)；3’端引物ρ印c3， 末端加損ol酶切位點(diǎn)；以本申請(qǐng)人構(gòu)建的一個(gè)入門質(zhì)粒載體pENTR 2B-KsPEPC為模板擴(kuò)增得到PEPC突變體的全長(zhǎng)編碼區(qū)的DNA片段；(2)回收并純化PEPC全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pUCm-PEPC ；(3)構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC，用 Nco I 和 Xho I 切割 pENTR*-PrbcS-*T_GFP 和pUCm-PEPC，回收載體pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)，獲得重組質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-PEPC ；(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-PEPC，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把PrbcS-PEPC亞克隆到植物表達(dá)載體PH2GW7中，獲得PEPC基因的植物表達(dá)載體 pH2-35S-PrbcS-PEPC0
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于提高植物耐鋁毒能力的載體及構(gòu)建方法，該載體是具有光誘導(dǎo)啟動(dòng)子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表達(dá)載體；通過從GenBank中查找嗜熱藍(lán)藻PEPC的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物；回收并純化PEPC全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pUCm-T載體上；構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-PEPC；構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-PEPC。本發(fā)明轉(zhuǎn)PEPC和CS基因的煙草植株檸檬酸合成酶活性是野生型煙草的2.4～2.6倍，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性是野生型煙草的2.2～2.4倍。本發(fā)明的專用載體能在提高植物對(duì)鋁毒的耐受性方面發(fā)揮很大作用，特別是在中國(guó)南方酸性紅壤中，可顯著促進(jìn)植物對(duì)鋁毒的耐受能力，因而也為植物品種改良提供了一條新途徑。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102199620SQ201110056779
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者易瓊, 李昆志, 玉永雄, 王奇峰, 胡清泉, 趙玥, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué), 西南大學(xué)