專利名稱：一種植物表達(dá)載體及培育低植酸水稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種植物表達(dá)載體及培育低植酸水稻的方法。
背景技術(shù)：
植酸(PA,phytic acid),又名肌醇六磷酸(myo-inositol-l, 2, 3,4, 5,6-hexakisphosphate,簡(jiǎn)寫InsP6或IP6),廣泛存在于禾谷類、豆類、堅(jiān)果、油料作物的種子中，是植物磷的主要儲(chǔ)存形式。在植物體內(nèi)，植酸及其衍生物承擔(dān)著多種生理功能，如在種子發(fā)育過(guò)程中儲(chǔ)藏磷、能量等，在種子萌發(fā)時(shí)向種子提供無(wú)機(jī)磷。此外，植酸及其衍生物也 參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換、ATP代謝及抗逆性等過(guò)程。然而，由于人和非反芻動(dòng)物(豬、雞、魚等)腸胃內(nèi)缺乏消化植酸及植酸鹽的相關(guān)酶，因此以禾谷類、豆類等為主食的人類和飼用動(dòng)物的排泄物中磷的含量很高，極易造成環(huán)境水體富營(yíng)養(yǎng)化；同時(shí)植酸與Zn2+、Ca2+、Fe3+等形成的植酸鹽不能被人和非反芻動(dòng)物所吸收利用，造成這些微營(yíng)養(yǎng)的生物有效性下降。因此，通過(guò)遺傳育種或者基因工程技術(shù)獲得植酸含量適當(dāng)下降、其他農(nóng)藝性狀沒(méi)有顯著變異的作物，不僅能夠提高食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境有重要的社會(huì)意義。V. Raboy等(1996)采用化學(xué)誘變劑處理玉米，培育了兩類低植酸突變體Ipal和lpa2，植酸含量分別下降66%和30%。隨后應(yīng)用Y射線和化學(xué)誘變劑在大麥、水稻、小麥、大豆等作物獲得了多種植酸突變體和品種，這些突變體和品種的種子植酸含量下降幅度從30到90%不等。然而研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著種子中植酸含量下降，作物的其他農(nóng)藝性狀也會(huì)發(fā)生改變，如作物減產(chǎn)、種子活力下降、植株形態(tài)改變，甚至?xí)绊懼参飳?duì)病原菌的抗性，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致致死突變。因此，獲得作物種子植酸含量下降而其他農(nóng)藝性狀沒(méi)有顯著變異的低植酸品種成為擺在育種家面前的難題。到目前為止，植物植酸代謝途徑已經(jīng)了解比較清楚，參與植酸代謝的多個(gè)功能基因已經(jīng)被報(bào)道。包括將光合作物產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成ID-肌醇-3-磷酸的MIPS基因；負(fù)責(zé)肌醇和3-磷酸肌醇之間轉(zhuǎn)化的MIK和IMP基因；參與肌醇磷酸化的IPKl和IPK2基因；承擔(dān)運(yùn)輸植酸到貯藏小泡的MRP5(水稻)基因；將植酸水解為肌醇和無(wú)機(jī)磷的植酸酶基因。目前功能研究最為詳細(xì)的是MIPS基因，并通過(guò)基因沉默技術(shù)在多種作物中獲得了相應(yīng)的低植酸突變體。Ruth Keller等(1998)應(yīng)用組成型啟動(dòng)子和反義RNA技術(shù)，獲得了MIPS基因表達(dá)水平下降的轉(zhuǎn)基因土豆，分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因土豆葉片中肌醇的含量下降；AlineC. S. Nunes等(2005)通過(guò)RNAi技術(shù)沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了 94. 5%；MioKuwano等(2008)通過(guò)反義RNA技術(shù)在種子特異性啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，獲得了植酸含量下降、其他農(nóng)業(yè)性狀沒(méi)有顯著變異的轉(zhuǎn)基因水稻。此外，Shi等(2007)應(yīng)用RNAi技術(shù)，在玉米種子特異性啟動(dòng)子01el6和Glb驅(qū)動(dòng)下，通過(guò)沉默MRP4基因獲得種子植酸含量下降的玉米和大豆。目前還沒(méi)有通過(guò)RNAi技術(shù)沉默其他植酸代謝相關(guān)基因，培育低植酸水稻或其他作物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種植物表達(dá)載體，利用該植物表達(dá)載體能特異性地抑制水稻種子中相應(yīng)植酸代謝相關(guān)基因MIK的表達(dá)，從而獲得性狀穩(wěn)定的低植酸水稻植株。一種RNAi抑制水稻MIK基因表達(dá)的植物表達(dá)載體，包括插入原始載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元和特異性啟動(dòng)子，所述特異性啟動(dòng)子為啟動(dòng)子01eOsinl8，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。MIK基因來(lái)自于水稻，其基因序列號(hào)；LOC 0s03g52760，其序列如SEQ ID No. 8所示。本發(fā)明植物表達(dá)載體使用種子特異性啟動(dòng)子OleosinlS，可以使基因沉默事件僅發(fā)生在種子胚和糊粉層，能夠有效地避免其他組織部位植酸合成受到影響。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元包括中間的內(nèi)含子及兩端的目的基因片段和目的基因片段的 反向互補(bǔ)片段，所述目的基因片段為MIK基因cDNA序列的部分序列，MIK基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。內(nèi)含子在本發(fā)明中沒(méi)有特異性的要求，它可以來(lái)自菜豆亞硝酸還原酶基因(基因序列號(hào)U10419. 1)，堿基序列如SEQ ID NO. 3所示。擴(kuò)增所述目的基因片段的引物為引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R如下MIKRNAi-F :5，-TACTTGAGAAGGCAGTAAAACGAC-3，；MIKRNAi-R :5，-AGAGCACATAATTCAACAGAGAGC-3，；所述原始載體可以是pCAMBIA1301-35SN或其他可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雙元載體。本發(fā)明還提供了一種培育低植酸水稻的方法，包括(I)構(gòu)建所述的植物表達(dá)載體；(2)將所述植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織；(3)將水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。其中，所述植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法為(I)構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元；(2)將啟動(dòng)子Oleosin 18替換原始載體的啟動(dòng)子；(3)將發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元插入啟動(dòng)子Oleosin 18的下游。所述農(nóng)桿菌可以選擇為EHA105根瘤農(nóng)桿菌。為了獲得性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因低植酸植株，可以對(duì)獲得低植酸水稻植株多代種植。其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建過(guò)程為(I)提取水稻幼胚總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，利用引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將pSSK-IN載體和擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)兩次雙酶切，然后連接獲得帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元的載體。所述啟動(dòng)子Oleosin 18的制備方法為(I)提取水稻種子總DNA ；(2)以所述總DNA為模板，利用引物01el8_F和01el8_R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述引物01el8_F和01el8_R如下01el8-F:5’ -AAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’ ；
01el8-R :5’ -GGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCA AGATGA-3’。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明提供的方法利用種子特異性啟動(dòng)子Oleosin 18控制水稻種子中MIK基因表達(dá)，使基因沉默事件僅發(fā)生在種子胚和糊粉層，能夠有效避免水稻其他組織部位植酸合成受到影響。(2)利用本發(fā)明提供的方法能夠獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因低植酸水稻品系，并且與其他非轉(zhuǎn)化陰性系在株高、穗長(zhǎng)、千粒重等其他農(nóng)藝方面無(wú)顯著差異，保證了轉(zhuǎn)基因低植酸水稻的整體品質(zhì)。


圖IA為01eosinl8_T載體的菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果圖。圖IB為MIK-T載體的菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果圖。圖2為pSi-MIK載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的⑶S顯色圖。其中，“ + ”表示轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，表示非 轉(zhuǎn)基因陰性。圖4為轉(zhuǎn)基因水稻葉片⑶S顯色圖。其中，“ + ”表示轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，表示非轉(zhuǎn)基因陰性。圖5為種子無(wú)機(jī)磷顯色反應(yīng)結(jié)果圖。其中，“ + ”表示轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，表示非轉(zhuǎn)基因陰性。
具體實(shí)施例方式1、MIK基因片段的擴(kuò)增(I)總 RNA 提取采用QIAGEN RNeasy Plant Mini試劑盒提取日本晴開(kāi)花后14天幼胚總RNA,具體步驟為①用液氮把樣品磨成粉末，轉(zhuǎn)移至自備的I. 5mL離心管中，可直接做下面的步驟或者存于_70°C冰箱中。②稱取重量小于IOOmg的樣品到離心管中，加入450 μ L RLT或RLC緩沖液(使用前加4. 5 μ L β -巰基乙醇)，劇烈振蕩，56°C下溫浴3min，渦旋混勻樣品。③將溶解的樣品轉(zhuǎn)移到紫色回收柱中，HOOOrpm離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL離心管中(自備)，不要攪動(dòng)管底沉淀。④上清液中加入O. 5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻。⑤將樣品轉(zhuǎn)移到粉紅色的離心柱中，10，OOOrpm離心15s。⑥棄去收集管中的液體，在回收柱中加入700 μ L緩沖液RW1，IOOOOrpm離心15s。⑦將回收柱轉(zhuǎn)到一新的2mL收集管中，加入500 μ L緩沖液RPE，IOOOOrpm離心15s0⑧再加一次500 μ L RPE緩沖液，HOOOrpm離心2min，之后倒出液體，再空管離心Imin0⑨將回收柱置于一新的I. 5mL離心管中，加入30-50 μ L RNase-free水至膜上，12000rpm離心lmin。加RNase-free水可分為兩步,例如先加30 μ L洗一次,再加20 μ L洗一次。(2)反轉(zhuǎn)錄采用M-MLV RTase cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。具體步驟為①RNA 預(yù)變性10 μ L RNA (200ng/ μ L) +2 μ L Oligo (dT)，65 °C，5min，冰上冷卻2min ；②反轉(zhuǎn)錄利用預(yù)變性后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將獲得的cDNA在42 V下保溫Ih，冰上冷卻，備用。反轉(zhuǎn)錄體系如下
權(quán)利要求
1.一種RNAi抑制水稻MIK基因表達(dá)的植物表達(dá)載體，包括插入原始載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元和特異性啟動(dòng)子，其特征在于，所述特異性啟動(dòng)子為啟動(dòng)子Oleosin 18,其核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述原始載體為PCAMBIA1301-35SN。
3.如權(quán)利要求I所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元包括中間的內(nèi)含子及兩端的目的基因片段和目的基因片段的反向互補(bǔ)片段，所述內(nèi)含子的堿基序列如SEQ ID No. 3 所示。
4.如權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述MIK基因的核苷酸序列如SEQID NO. 8 所示。
5.一種培育低植酸水稻的方法，其特征在于，包括 (1)構(gòu)建如權(quán)利要求I 4任一所述的植物表達(dá)載體； (2)將所述植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織； (3)將水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法為 (1)構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元； (2)將啟動(dòng)子Oleosin18替換原始載體的啟動(dòng)子； (3)將發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元插入啟動(dòng)子Oleosin18的下游。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌EHA105。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將低植酸水稻植株種植多代，獲得性狀穩(wěn)定植株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物表達(dá)載體及培育低植酸水稻的方法，該植物表達(dá)載體包括插入原始載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元和特異性啟動(dòng)子，所述特異性啟動(dòng)子為啟動(dòng)子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。該方法包括(1)構(gòu)建所述植物表達(dá)載體；(2)將所述植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織；(3)將水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。本發(fā)明利用種子特異性啟動(dòng)子Oleosin 18控制基因表達(dá)，使基因沉默僅發(fā)生在種子胚和糊粉層，能夠有效避免水稻其他組織部位植酸合成受到影響。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102864167SQ20121036407
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者舒慶堯, 李文旭, 趙海軍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)