一種抗腫瘤融合蛋白、其編碼基因和用途
【專利摘要】本發明提供一種抗腫瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一級氨基酸序列結構：EGFR特異性靶向寡肽-連接肽1-力達霉素輔基蛋白-連接肽2-(促吞噬肽)n；其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列，所述力達霉素輔基蛋白具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列，所述促吞噬肽具有SEQ?ID?NO:3所示的氨基酸序列，并且n=1-3。該融合蛋白為靶向EGFR且含有LDP和Tuftsin的新型蛋白，不僅保留Tuftsin的促吞噬作用，而且具有靶向性，在動物體內具有良好的抗腫瘤效果。本發明還提供了該融合蛋白的編碼基因、與力達霉素發色團組裝的強化融合蛋白以及它們的制藥用途。
【專利說明】一種抗腫瘤融合蛋白、其編碼基因和用途

【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥用蛋白【技術領域】。具體而言，本發明涉及一種抗腫瘤融合蛋白、其編 碼基因、以該融合蛋白為活性成分的藥物以及其制藥用途。

【背景技術】
[0002] 表皮生長因子受體（EGFR)異常表達是多種上皮來源的腫瘤細胞的重要特性，因此 EGFR已成為腫瘤靶向性治療的理想靶點。但是，抗EGFR的抗體分子量大、免疫原性強，難以 穿透到實體腫瘤的內部，而EGFR的小分子酪氨酸抑制劑雖然組織擴散和穿透力強、低免疫 原性，但是一般和細胞毒藥物一起使用。
[0003] 促吞噬肽（Tuftsin)由Najjar等人于1970年在美國Tufts大學首次發現，并因 此而得名。它是一種促進巨噬細胞吞噬作用的人體自然存在的活性物質，位于IgG重鏈Fc 段CH2區域殘基289-292部分，分子量為500kD。吞噬細胞、巨噬細胞和單核細胞等免疫細 胞的細胞膜上都含有Tuftsin的特異性受體，當該特異性受體與Tuftsin結合后，這些細胞 即可發揮其吞噬、殺菌和抗腫瘤及其它活性作用。動物體內實驗證明，移植了白血病細胞 的動物在注射Tuftsin后，其移植性腫瘤的發生延遲，發生率降低，并且實驗動物的壽命得 到延長。此外，Tuftsin脂質體藥物載體能夠增強抗腫瘤藥物的抑制腫瘤細胞增殖的作用。 進一步研究還指出，Tuftsin及其同系物具有選擇性的抗腫瘤活性，并且可能通過抑制DNA 拓撲異構酶的活性發揮其抗腫瘤的作用。并且，在臨床檢測中發現，Tuftsin可以促進白細 胞腫瘤細胞吞噬，且如將其標記微顆粒的表面可以用來抗炎癥治療。然而遺憾的是，促吞 噬肽（Tuftsin)分子活性功能基團還存在爭議：其活性基團主要為氮端的賴氨酸-NH 2及碳 端的-C00H，到底是那個基團起主要的活性作用還未研究清楚。因此將促吞噬肽（Tuftsin) 作為效應分子時，為了保護這兩個基團或修飾這兩個基團，主要采用了化學合成促吞噬肽 (Tuftsin)化合物的方式。但是，在化學合成時，副產物太多，主產物不易獲得和純化，并且 難大量生產。此外，已知促吞噬肽（Tuftsin)分子的分子量太小，對腫瘤細胞沒有結合能力， 動物實驗大量使用時有一定的毒性。
[0004] 力達霉素（LDM)是由1個輔基蛋白（Lidamycin apoprotein, LDP)和1個發色團 (active enediyne chromophore，AE)組成的一種烯二炔類抗腫瘤抗生素，可以作為彈頭藥 物。其中，發色團是活性部分，含有一個九元環烯二炔核心結構，分子量為843Da ;輔基蛋白 起保護發色團的作用，由110個氨基酸組成，分子量為10506Da，并且這兩個部分可以拆分。 研究發現，LDP本身在體內具有中等程度的抗腫瘤作用，并且由于其具有獨特的分子結構， 可以作為開發新型抗腫瘤藥物的支架載體。
[0005] 基于上述現有技術狀況，可以考慮以力達霉素輔基蛋白為支架載體，構建具有 EGFR特異性的、基于促吞噬肽的抗腫瘤融合蛋白。


【發明內容】

[0006] 基于上述技術問題，本發明的一個目的是提供一種以LDP為支架具有靶向EGFR的 促吞噬肽的融合蛋白，該融合蛋白為具有抗腫瘤作用的小分子藥用蛋白。
[0007] 本發明的另一個目的是提供該融合蛋白的編碼基因。
[0008] 由于力達霉素具有可拆分和組裝的特性，本發明還提供一種與發色團組裝的強化 融合蛋白。
[0009] 本發明的還一個目的是提供以上述融合蛋白為活性成分的藥物以及上述融合蛋 白的制藥用途。
[0010] 本發明通過以下技術方案實現上述目的：
[0011] 迄今為止，在國外文獻報道的相關促吞噬肽（Tuftsin)化合物抗腫瘤的研究中，促 吞噬肽（Tuftsin)化合物都是通過化學合成獲得的。其原因在于，促吞噬肽（Tuftsin)分 子量太小，無法通過基因工程的方法構建載體和表達。這給促吞噬肽的應用帶來了一定的 困難。對此，本發明人通過基因工程技術構建了以LDP為支架具有靶向EGFR的促吞噬肽 融合蛋白（本文命名為ET-tuftsin或ET-tuftsin-tuftsin)重組載體，將其轉化到工程菌 BL21starTM(DE3)中表達，并經純化獲得了一種多功能的具有抗腫瘤作用的小分子藥用蛋 白。其中，除表達的蛋白含促吞噬肽之外，關于EGFR靶向性則選取了與EGFR受體結合的 EGF重要結構C環，其上22個氨基酸殘基作為導向分子，由此形成的小分子也更容易穿透組 織，到達實體腫瘤的更深部。此外，因力達霉素具有可拆分和組裝的特性，本發明人還成功 組裝了一種新的雙彈頭強化融合蛋白（本文命名為ET-tuftsin-AE)。體內體外試驗證實，經 抗腫瘤作用得到進一步加強。
[0012] 因此，一方面，本發明提供一種抗腫瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一級氨基 酸序列結構：
[0013] EGFR特異性靶向寡肽-連接肽1-力達霉素輔基蛋白-連接肽2-(促吞噬肽）η ;
[0014] 其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22個氨 基酸；所述力達霉素輔基蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110個氨基酸；所述 促吞噬肽具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共4個氨基酸；并且，n=l-3。
[0015] 在該融合蛋白中，連接EGFR特異性靶向寡肽與力達霉素輔基蛋白的連接肽1與 連接力達霉素輔基蛋白與促吞噬肽的連接肽2可以相同或不同。優選地，所述連接肽1為 (GGGGS) 2，所述連接肽2為（GGGGS)2。選擇（GGGGS)Jt為連接肽的原因在于，一方面利于 在工程菌如大腸桿菌中表達；另一方面，連接肽太短，剛性大，不利于蛋白分子伸展，容易造 成蛋白分子構想相互遮掩，影響蛋白功能，并且力達輔基蛋白（LDP)支架分子共110個氨基 酸，具有α螺旋和β折疊，結構復雜，分子量比較大，因此，選用（GGGGS) 2。
[0016] 優選地，n=l，所述融合蛋白具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；
[0017] 進一步優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示或SEQ ID N0:5。
[0018] SEQ ID N0:4為本發明提供的一個具體融合蛋白的氨基酸序列，共156個氨基酸。 從氨基端至羧基端，該融合蛋白包括：EGFR特異性靶向寡肽（Ec)，共22個氨基酸；連接肽 1，為（GGGGS) 2柔性肽，共10個氨基酸；力達霉素輔基蛋白（LDP)，共110個氨基酸；連接肽 2,為（GGGGS)2柔性肽，共10個氨基酸；促吞噬肽（Tuftsin，TF)，共4個氨基酸。
[0019] SEQ ID N0:5為本發明提供的一個具體融合蛋白的氨基酸序列，共166個氨基酸。 相比于SEQ ID N0:4,該融合蛋白在EGFR特異性靶向寡肽之前具有Met和Ala，在促吞噬肽 的C端具有Leu和Glu以及（His) 6標簽。
[0020] 或者，n=2,所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列；
[0021] 優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:13所示。
[0022] SEQ ID NO: 13為本發明提供的一個具體融合蛋白的氨基酸序列，共160個氨基酸。 相比于SEQ ID N0:4,該融合蛋白在羧基端具有連續的2個促吞噬肽。
[0023] 另一方面，本發明提供上述融合蛋白的編碼基因。
[0024] 優選地，所述編碼基因具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
[0025] 優選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:7所示。
[0026] 再一方面，本發明提供一種抗腫瘤強化融合蛋白，所述強化融合蛋白為本發明的 上述融合蛋白與力達霉素發色團組裝而成。
[0027] 根據本發明的【具體實施方式】，所述強化融合蛋白通過包括以下步驟的方法組裝而 成：將本發明提供的上述融合蛋白與力達霉素發色團以1:3的分子比混合，于4°C下避光緩 慢晃動反應12?16個小時。反應接受后，去除多余發色團，得到組裝成功的強化融合蛋 白。具體而言，所述強化融合蛋白通過包括以下步驟的方法組裝而成：取高活性的力達霉 素純品，經C4柱分離活性發色團，流動相為水：乙腈：三氟乙酸（78%:22%:0.05%，體積比)， 監測350nm處的吸光值，以收集發色團；將本發明提供的上述融合蛋白與力達霉素發色團 以1:3的分子比混合，置于搖床上緩慢晃動，4°C下避光反應12-16小時；將二者的混合液經 S印hadex G-75柱除去未包裝上的發色團，HPLC(C4 300A柱）檢測350nm處的吸光值，觀 察發色團與融合蛋白是否組裝成功。
[0028] 另一方面，本發明還提供一種抗腫瘤藥物，所述藥物以本發明提供的上述融合蛋 白和/或強化融合蛋白為活性成分。優選地，所述抗腫瘤藥物用于治療或預防鱗癌、肺癌或 乳腺癌，優選鱗癌。
[0029] 又一方面，本發明還提供上述融合蛋白或強化融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用 途。優選地，所述抗腫瘤藥物用于治療或預防鱗癌、肺癌或乳腺癌，優選鱗癌。
[0030] 綜上，本發明應用基因工程的方法提供了一種新型的具有特異性、靶向性的融合 蛋白。該融合蛋白為靶向EGFR (表皮生長因子受體)、且含有LDP和Tuftsin的新型蛋白。 該融合蛋白不僅保留Tuftsin的促吞噬作用，而且具有靶向性，在動物體內具有良好的抗 腫瘤效果。此外，由于該融合蛋白含有LDP作為支架，可以組裝抗腫瘤抗生素力達霉素的烯 二炔發色團AE，從而進一步提高了抗腫瘤療效。并且實驗證明，與現有融合蛋白相比，本發 明的融合蛋白具有抑瘤效果更佳的優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0032] 圖1示出了重組表達質粒pET3〇-ET_tuftsin的構建。
[0033] 圖2示出了重組菌表達產物ET-tuftsin融合蛋白的檢測結果。其中：
[0034] 圖2A為ET-tuftsin融合蛋白定位分析的電泳圖譜，1-蛋白分子量標準，2-IPTG 誘導全菌組分，3-上清組分，4-周質腔組分，5-細胞質可溶組分，6-包涵體組分；
[0035] 圖2B為ET-tuftsin融合蛋白純化后的SDS-PAGE和Western Blot結果，1-蛋白 分子量標準，2、3_純化ET-tuftsin蛋白，4、5-ET_tuftsin融合蛋白WesternBlot結果；
[0036] 圖2C為HLPC檢測ET-tuftsin融合蛋白的純度結果。
[0037] 圖3示出了 ET-tuftsin融合蛋白體外結合能力的分析結果。其中：
[0038] 圖3A和3B為不同腫瘤細胞及J774A. 1中EGFR表達量的Western Blot檢測結 果；
[0039] 圖3C為A431細胞中ET-tuftsin融合蛋白ELISA免疫活性分析結果；
[0040] 圖3D為J774A. 1細胞中ET-tuftsin融合蛋白ELISA免疫活性分析結果。
[0041] 圖4示出了細胞免疫熒光檢測ET-tuftsin融合蛋白與腫瘤細胞結合結果（TRITC 標記羊抗鼠 IgG染色)。其中，圖4A為A431細胞，圖4B為A549細胞，圖4C為MCF-7細胞， 圖4D為SK-BR-3細胞。
[0042] 圖5示出了細胞免疫熒光分析融合蛋白ET-tuftsin和蛋白LDP分別與A431細胞 的結合活性結果。其中：
[0043] 圖5A-5C為融合蛋白ET-tuftsin作用于A431細胞：5A，細胞核DAPI著色圖片； 5B，細胞膜著色圖片；5C，細胞核和細胞膜著色圖片；
[0044] 圖OT-5F為蛋白LDP作用于A431細胞：5D，細胞核DAPI著色圖片；5E，細胞膜著色 圖片；5F，細胞核和細胞膜著色圖片。
[0045] 圖6示出了 ET-tuftsin融合蛋白的體外吞噬活性分析結果。其中：
[0046] 圖6A為ET-tuftsin融合蛋白作用于J774A. 1細胞；
[0047] 圖6B為LDP蛋白作用于J774A. 1細胞；
[0048] 圖6C為采用流式細胞儀分析融合蛋白ET-tuftsin和蛋白LDP促小鼠巨噬細胞 J774A. 1的吞噬活性結果。
[0049] 圖7示出了融合蛋白ET-tuftsin和LDP、Tuftsin對腫瘤細胞的抑制率比較結果。
[0050] 圖8示出了高效液相色譜法鑒定的強化融合蛋白ET-tuftsin-AE的分子組裝結 果。其中：1、3_雜蛋白吸收峰；2-融合蛋白吸收峰；4-發色團吸收峰。

【具體實施方式】
[0051] 以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。
[0052] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥 材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0053] 實施例1重組表達載體pET30-ET_tuftsin的構建
[0054] 本實施例中使用的重組質粒pEL含有EGFR寡肽配體Ec基因和LDP基因，構建方 法及其圖譜參見郭曉芳，"靶向表皮生長因子受體的寡肽與力達霉素強化融合蛋白的構建 及其抗腫瘤活性"，《癌癥》，2009, 28 (6) :561-568)。大腸桿菌感受態DH5a為北京全式金 生物科技公司產品，pET30a(+)為Novagen公司（69909-3)的產品，PCR引物由英維杰基上 海公司合成。
[0055] 構建重組載體pET3〇-ET_tuftsin需要3條引物：
[0056] El (SEQ ID N0:8) :5，-gc cat atg aaa tac ctg ctg ccg acc_3，（下劃線為 Ndel酶切位點）
[0057] P2 (SEQ ID N0:9) :5，-gcc gaa ggt cag age cac gtg-3，
[0058] T2 (SEQ ID NO: 10) :5' -gc etc gag aeg egg ett ggt tga acc gcc tee acc tgaacc gcc tcc acc gcc gaa ggt cag age cac_3'（下劃線為 Xhol 酶切位點）
[0059] 以重組質粒pEL為模板，采用引物El和P2進行常規PCR反應：94°C預變性3分 鐘，然后94°C變性30秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸45秒，進行30個循環的擴增反應，最后 72 °C延伸10分鐘。反應體系含：
[0060] 模板質粒DNA 100ng El (20 pM) 0.5 μ? Ρ2 (20 ρΜ) 0.5 μ! Premix PrimetSTAE 25 μ! 無菌雙蒸水補至總體積 50 μ 1
[0061] 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用Omega公司凝膠回收試劑盒回收501bp的基因片 段，該基因片段帶有信號肽，命名為Ec-ldp (SEQ ID N0:11)。
[0062] 以Ec-ldp為模板，引物El和T2進行PCR反應，采用的PCR反應條件為：94°C預變 性3分鐘，然后94°C變性50秒，55 °C退火50秒，72 °C延伸50秒，進行30個循環的擴增反 應，最后72°C延伸8分鐘。反應體系含：
[0063] 模板質粒DNA 100 ng R1 (20 pM) 0.5 μ! Τ2(20 ρΜ) 0.5 μΙ Prcmix PrirneiS I AK 25 μ? 無菌雙蒸水補至總體積 50 μ?
[0064]
[0065] 將得到的基因片段命名為ET-tuftsin基因 （SEQ ID Ν0:7)。
[0066] ET-tuftsin基因包括4部分，從5'端到3'端依次為NdeI酶切位點（6bp)、pe 1Β信 號肽的編碼序列（69bp)、Ec的編碼序列（66bp)、柔性肽（GGGGS)2的編碼序列（30bp)、LDP的 編碼序列（330bp)、柔性肽（GGGGS) 2的編碼序列（30bp)、tuftsin的編碼序列（12bp)、Xhol 酶切位點（6bp)，共549bp。其中pe 1B信號肽的作用是促使融合蛋白在細菌的周質腔中表 達，之后將被周質腔中的信號肽酶切除，只保留末端的丙氨酸和甲硫氨酸。
[0067] 分別用Ndel和Xhol雙酶切ET-tuftsin基因和pET30a ( + )載體，然后連接，得到 重組表達載體，命名為pET30-ET-tuftsin，并轉化至大腸桿菌DH5 α，挑選出陽性克隆進行 測序，質粒構建流程見圖1。結果表明，酶切結果和測序結果與預期完全一致。
[0068] 在得到的重組質粒pET30-ET-tuftsin中，在促吞噬肽編碼序列的3'末端有Xhol 酶切位點，并且pET30a ( + )載體含有組氨酸標簽（6個氨基酸，His-tag標簽)，使得該重組 質粒pET30-ET-tuftsin在表達融合蛋白時使蛋白含有His-tag標簽，以便于純化和鑒定。
[0069] 實施例2融合蛋白ET-tuftsin在大腸桿菌中的表達和純化
[0070] 本發明使用的大腸桿菌菌株BL21star?(DE3)是Novagen公司的產品。
[0071] 將實施例1中構建的重組表達載體pET30-ET-tuftsin轉化至大腸桿菌BL21中， 挑取陽性單克隆接種LB培養基(卡那霉素50μ g/ml)，37°C下過夜培養。送去測序，選取測 序和酶切結果正確的陽性菌株_80°C下保存。
[0072] 將該陽性單克隆接種5ml LB培養基，37°C下過夜培養，當0D=1.0_2. 0時，加入 lmmol/L IPTG，誘導8h，按照pET系統操作手冊（Novagen公司)對培養液上清液、周質腔、細 胞質可溶以及不可溶組分進行分析。融合蛋白ET-tuftsin分子量大小為16.3KD。發現，經 12% SDS-PAGE電泳分析，ET-tuftsin蛋白主要定位于周質腔中（圖2A)，分子量大小與預期 相符。對影響蛋白表達產量的各個條件進行了優化，最終確定表達條件為：溫度37°C、菌體 起始密度A600=l. 0、IPTG濃度為0. lmmol/L、誘導時間為8h。
[0073] 融合蛋白是可溶性的，不需經過復性，可經過高滲、低滲處理后釋放出來，并且融 合蛋白ET-tuftsin在碳末端帶有His-tag標簽，因此采用GE公司的His-tag5ml的鎳柱， 按試劑盒說明書進行Ni2+親和色譜純化。用不同濃度的咪唑將蛋白提純，咪唑的濃度分別 為20mM、50mM、70mM、100mM和250mM，250mM咪唑洗下的蛋白經12%SDS-PAGE電泳分析鑒定 為目的蛋白ET-tuftsin (圖2B)，分子量大小與預期相符。HPLC檢測其純度達到了 90. 2% (圖2C)，產量為每升發酵液大概獲得6mg的活性蛋白。
[0074] 得到的融合蛋白ET-tuftsin的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
[0075] 實施例3融合蛋白ET-tuftsin體外細胞結合活性測定
[0076] 實驗(一）：
[0077] 將對數生長期的人皮膚鱗癌細胞A431和小鼠巨噬細胞J774A. 1用預冷的PBS洗 滌2次，用胰酶消化細胞，再用PBS洗滌2次，加入適量細胞裂解液(北京寶賽生物技術公 司），冰上裂解10分鐘。之后于4°C，10, OOOrpm下離心30分鐘，收集上清液。
[0078] 用BCA試劑盒進行融合蛋白ET-tuftsin定量，取100 μ g蛋白與適量5X上樣緩 沖液混合，沸水浴中變性5分鐘，-80°C保存備用。
[0079] Western Blot檢測腫瘤細胞EGFR的表達水平，結果顯示A431為EGFR高表達細胞 株，而J774A. 1檢測不到EGFR的表達（圖3A)。
[0080] 相同的方法處理人皮膚鱗癌細胞A431、小鼠巨噬細胞J774A. 1、人肺癌細胞A549、 人肺癌細胞H460、人乳腺癌細胞MCF-7和SK-BR-3,用BCA試劑盒進行融合蛋白ET-tuftsin 定量，取20 μ g蛋白與適量5X上樣緩沖液混合，沸水浴中變性5分鐘，-80°C保存備用。
[0081] Western Blot檢測腫瘤細胞EGFR的表達水平，結果顯示A431為EGFR高表達細胞 株，而A549中表達EGFR，MCF-7和SK-BR-3表達EGFR較少，J774A. 1和H460不表達EGFR (圖 3B)。
[0082] 以酶聯免疫吸附分析方法（ELISA)檢測融合蛋白的免疫原性。將A431和J774A. 1 細胞于96孔板每孔接種1 X 104個細胞，37°C下培養24小時后用PBS洗3次，加入4°C預冷 的0. 05%戊二醛（100 μ 1/孔)，于4°C固定細胞30分鐘。固定好的細胞用PBS洗3次后，用 3% BSA溶液于4°C下封閉過夜，然后用PBST緩沖液（PBS中含有0. 05%的Tween-20)洗3次。 將融合蛋白ET-tuftsin倍比稀釋加入到96孔板中，每個濃度設3個平行孔，37°C下溫育2 小時。用PBST洗3次后，加入抗His-tag單克隆抗體（1 :2500稀釋)，37°C下溫育2小時。 用PBST洗板3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG抗體（1 :2500稀釋)，37°C下溫育 2小時。用PBST洗板5次，加入TMB底物反應液(北京天根公司）（100μ1/孔)，室溫避光 反應10-30分鐘。以2mol/L的硫酸每孔100 μ 1終止反應，立即在酶標儀上測定450nm處 的吸光值。結果表明，融合蛋白ET-tuftsin對A431細胞的反應均呈陽性（圖3C)，J774A. 1 細胞表面具有Tuftsin的專一受體，ET-tuftsin對其的反應也呈陽性（圖3D)。
[0083] 實驗（二）：
[0084] 采用細胞免疫熒光法分析融合蛋白ET-tuftsin與EGFR不同表達的A431、A549、 SK-BR-3和SW1990細胞的結合活性。
[0085] 將這四種腫瘤細胞以5X104個細胞/孔的密度接種到六孔板中，37°C下培養24 小時后用PBS洗3次，加入70%甲醇于置于0°C下固定20分鐘，PBS洗3次。加入融合蛋 白ET-tuftsin(100μM/孔)，于室溫下孵育2小時或于4°C下過夜，然后PBS洗3次。加入 1:1000稀釋的抗His-tag抗體，室溫下反應2小時，PBS洗3次。加入1:50稀釋的TRITC 標記羊抗鼠 IgG (中杉金橋公司），室溫下避光反應1小時，PBS洗3次。加入1:100稀釋的 DAPI( lmg/ml )，室溫下避光反應15分鐘。PBS洗3次后于熒光顯微鏡下觀察并照相。結果如 圖所示，在這四種細胞細胞膜上均可觀察到紅色熒光，只是熒光強度不同，表明ET-tuftsin 蛋白可以與表達EGFR受體的腫瘤細胞的細胞膜結合（圖4)。
[0086] 實驗(三）：
[0087] 細胞免疫熒光法分析比較融合蛋白ET-tuftsin和蛋白LDP分別與A431細胞 (EGFR高表達)結合能力的差異。結果表明，融合蛋白ET-tuftsin可以與A431細胞膜上的 受體結合（圖5A、5B和5C)，而LDP蛋白不能與A431細胞細胞膜上的EGFR受體結合（圖 5E 和 5F)。
[0088] 實施例4融合蛋白ET-tuftsin體外吞噬實驗
[0089] 將J774A. 1以5X 104個細胞/孔接種于24孔組織培養板，37°C下過夜培養。PBS 洗3遍，無血清培養基培養此。取三個孔，每孔都加入2. 5 μ M FITC標記的BSA，然后一個 為對照孔（BSA)，另外兩孔分別加入LDP和ET-tuftsin (10 μ Μ/孔)，37°C下培養2h，于顯 微鏡下觀察并照相。結果顯示，融合蛋白ET-tuftsin作用過的細胞（圖6A)，與LDP作用過 的細胞相比（圖6B)，吞噬作用增強。
[0090] 取對數生長期的J774A. 1細胞以濃度為5 X 105個細胞/孔接種24孔組織培養板， 37°C下過夜培養。用PBS洗滌細胞3次，溫孵2小時。取三個孔，每孔都加入ΙΟμΜ FITC 標記的BSA，然后一個為對照孔(只含有FITC標記的BSA)，另外兩孔分別加入LDP (20 μ Μ/ 孔）和ET-tuftsin (20 μ Μ/孔)，每孔分別重復三次。37°C下反應2小時以上加入lml用 PBS配制的臺盼藍溶液（120 μ g/ml)淬滅熒光5分鐘。PBS洗三遍，用胰酶消化，1，OOOrpm 離心5分鐘收集細胞，加入500 μ 1反應緩沖液（PBS+2%FBS)，所有的反應管均用200目尼龍 網過濾后用流式細胞儀測定突光強度。計算吞噬倍數利用公式：fold phagocytic index= (F蛋白_F_對照）/ (FBSA-F陰性對照)。如圖所示，融合蛋白ET-tuftsin具有明顯的促進吞噬細 胞J774A. 1吞噬的作用（圖6C)。
[0091] 實施例5CCK-8試劑盒檢測ET-tuftsin融合蛋白體外對腫瘤細胞的殺傷活性
[0092] 取對數生長期的皮膚鱗癌細胞A431和肺癌細胞A549細胞，以每孔3000個細 胞的密度接種于96孔板，37 °C下培養24h后加入不同濃度的融合蛋白ET-tuf tsin或 LDP-tuftsin (采用常規方法獲得的LDP與Tuftsin的融合蛋白，序列為SEQ ID NO: 12)或 LDP或Tuftsin (Sigma)，每濃度設置3個平行孔。孵育24h后，每孔加入20 μ L CCK-8溶 液繼續培養lh。酶標儀測定450nm處的吸光度（A45CI)。實驗設置無藥對照組和無細胞空白 組，按下面公式計算細胞的存活率并計算出IC50值：
[0093] 細胞抑制率=100-(加藥組A45(l值一空白組A45(l值）八對照組六 45(|值一空白組八45。 值）X100%。
[0094] 結果表明，與 LDP-tuftsin、LDP 和 Tuftsin 相比，ET-tuftsin 蛋白對 A431 腫 瘤細胞抗增殖作用最明顯，1〇〇μ M ET-tuftsin蛋白對鱗癌A431細胞的抑制率為67%， LDP-tuftsin為52%，而LDP蛋白只有20% (圖7A);與力達輔基蛋白相比，ET-tuftsin蛋 白對A549腫瘤細胞抑制率為54%，LDP-tuftsin為50%，LDP蛋白只有45% (圖7B)。因此 ET-tuftsin蛋白對EGFR高表達A431細胞株抗增殖作用比A549明顯；LDP-tuftsin比力達 輔基蛋白的抗腫瘤活性高，而ET-tuftsin蛋白又比LDP-tuftsin高。促吞噬肽（Tuftsin)融 合蛋白LDP-tuftsin和ET-tuftsin都具有明顯的抑制腫瘤細胞A431和A549增殖的作用， 但是含促吞噬肽的融合蛋白比不含吞噬肽的LDP效果好，含有靶向分子Ec的ET-tuftsin 比沒有祀向的融合蛋白LDP-tuftsin效果好。
[0095] 實施例6融合蛋白ET-tuftsin對人鱗癌A431裸鼠移植瘤的生長抑制作用
[0096] 取體重為18-22g的雌性BALB/c裸鼠5只，將人鱗癌A431細胞接種于裸鼠腋 窩皮下，每只接種1X10 7個細胞。待瘤塊長至足夠大小時，將其在無菌生理鹽水中剪成 2 X 2 X 2mm3的小塊，用套管針將瘤塊分別移植到裸鼠右腋窩皮下，用火膠棉將切口粘住。待 瘤塊長至100mm 3大小時，將裸鼠按照瘤塊大小和體重進行分組，使每組瘤塊大小平均值為 100mm3,且各組體重平均值接近，每組6只裸鼠。當腫瘤體積為100mm 3時，將等摩爾的融合 蛋白 Ec-LDP-Hr (參見郭曉芳，Clin Cancer Res 2010;16:2085-2094. )、LDP-tuftsin、LDP 和Tuftsin分別通過尾靜脈給藥，每只裸鼠注射200 μ 1，對照組不做任何處理。第一次給藥 后的第7天，按照相同的劑量再次給藥一次。實驗期間每3天測量一次腫瘤直徑和體重，根 據公式V=ab 2/2計算腫瘤體積（a :腫瘤長徑，b :腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線，觀察體重變 化。實驗第30天處死動物，分別稱量腫瘤的重量，計算抑瘤率。結果見表1。
[0097] 表1融合蛋白ET-tuftsin對人鱗癌A431的腫瘤生長抑制作用
[0098]

【權利要求】
1. 一種抗腫瘤融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一級氨基酸序列結構： EGFR特異性靶向寡肽-連接肽1-力達霉素輔基蛋白-連接肽2-(促吞噬肽）η ; 其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ ID Ν0:1所示的氨基酸序列，所述力達霉素 輔基蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述促吞噬肽具有SEQ ID NO:3所示的氨 基酸序列；并且，n=l-3。
2. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述連接肽1為（GGGGS)2 ;所述連接 肽 2 為 〇；GGGS)2。
3. 根據權利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，n=l，所述融合蛋白具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列； 優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
4. 根據權利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，n=2,所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列； 優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
5. 根據權利要求1至4中任一項所述的融合蛋白的編碼基因。
6. 根據權利要求5所述的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因具有SEQ ID N0:6所示 的核苷酸序列； 優選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
7. -種抗腫瘤強化融合蛋白，其特征在于，所述強化融合蛋白為根據權利要求1至4中 任一項所述的融合蛋白與力達霉素發色團組裝而成。
8. 根據權利要求7所述的強化融合蛋白，其特征在于，所述強化融合蛋白通過包括以 下步驟的方法組裝而成：將根據權利要求1或2所述的融合蛋白與力達霉素發色團以1:3 的分子比混合，于4°C下避光緩慢晃動反應12?16個小時。
9. 一種抗腫瘤藥物，其特征在于，所述藥物以根據權利要求1至4中任一項所述的融合 蛋白和/或根據權利要求7或8所述的強化融合蛋白為活性成分。
10. 根據權利要求9所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述抗腫瘤藥物用于治療或預防 鱗癌、肺癌或乳腺癌，優選鱗癌。
11. 根據權利要求1至4中任一項所述的融合蛋白或根據權利要求7或8所述的強化 融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用途。
12. 根據權利要求11所述的用途，其特征在于，所述抗腫瘤藥物用于治療或預防鱗癌、 肺癌或乳腺癌，優選鱗癌。
【文檔編號】C12N15/62GK104151432SQ201310178116
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月14日 優先權日:2013年5月14日
【發明者】劉文娟, 甄永蘇, 劉秀均, 李毅, 張勝華 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所