Sacs基因突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了分離的核酸、分離的多肽、篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法、篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的系統以及用于篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的試劑盒。其中，該分離的核酸即SACS突變體，與SEQ?ID?NO：1相比具有c.1229delT突變，或者c.5840C>G突變。通過檢測這些突變體在生物樣品中是否同時存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感痙攣性共濟失調病。
【專利說明】SACS基因突變體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及SACS基因突變體及其應用。具體地，本發明涉及分離的核酸、分離的多肽、篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法、篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的系統以及用于篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的試劑盒。
【背景技術】
[0002]遺傳性疫攣性共濟失調(spasticataxia of the Charlevoix-Saguenay type,SACS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳的神經退行性疾病，以進行性小腦功能障礙，伴反射亢進痙攣狀態的錐體束征及伴肌萎縮的感覺運動性周圍神經病為臨床表現。SACS病多在1-5歲發病，最初臨床表現為行走能力較同齡兒童推遲，步態不穩和頻繁跌倒，在發病早中期，構音障礙和痙攣性截癱是其主要的臨床表現，隨著病情的發展，下肢的周圍神經病變逐漸明顯，錐體束征逐漸被日益嚴重的周圍神經病變所掩蓋，在疾病的后期?？煽吹竭h端肌萎縮、弓形足和槌狀趾，而下肢的病理征甚至會被這些癥狀所掩蓋，部分患者可伴發有輕度的智力發育障礙或精神行為異常。病情進展相對緩慢，在發病30-40年后，多數患者需要做輪椅。頭顱MRI可顯示小腦蚓部萎縮，神經電圖和神經活檢顯示嚴重的軸性神經病變伴隨輕度的脫髓鞘，感覺神經纖維往往較運動神經纖維損傷嚴重，肌肉活檢常可看到組織總線粒體DNA的缺失。
[0003]現階段，尋找致病基因對疾病診斷或治療意義重大。目前已知SACS為痙攣性共濟失調病的致病相關基因，且已發現多個致病基因位點，但仍存在著相當一部分未知致病基因位點。
[0004]因而，目前對痙攣性共濟失調病的研究仍有待深入。
【發明內容】
[0005]本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠有效篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法。
[0006]本發明是基于發明人的下列工作而完成的:發明人通過高通量外顯子組測序聯合候選基因突變驗證的方法確定了痙攣性共濟失調病的致病基因上的新突變。
[0007]根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的核酸。根據本發明的實施例，與SEQ ID N0:1相比，該核酸具有c.1229delT突變，或者c.58400G突變。根據本發明的實施例，發明人確定了 SACS基因突變體，這些新突變體與痙攣性共濟失調病的發病密切相關，從而通過檢測這些新突變體在生物樣品中是否同時存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感痙攣性共濟失調病。
[0008]根據本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的多肽。根據本發明的實施例，與SEQ ID NO:2相比，該分離的多肽具有p.Leu410X突變，或者p.Prol947Arg突變。通過檢測生物樣品中是否同時表達上述多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易感痙攣性共濟失調病。
[0009]根據本發明的第三方面，本發明提出了一種篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:從生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT和c.5840C>G的復合雜合突變，是所述生物樣品易感痙攣性共濟失調病的指示。通過根據本發明實施例的篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法，可以有效地篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品。
[0010]根據本發明的第四方面，本發明提出了一種篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的系統。根據本發明的實施例，該系統包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT和c.58400G的復合雜合突變，判斷所述生物樣品是否易感痙攣性共濟失調病。利用該系統，能夠有效地實施前述篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品。
[0011]根據本發明的第五方面，本發明提出了一種用于篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒含有:適于檢測SACS基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述SACS基因突變體具有c.1229delT和c.58400G的復合雜合突變。利用根據本發明的實施例的試劑盒，能夠有效地篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品。
[0012]根據本發明的第六方面，本發明還提出了一種構建體。根據本發明的實施例，該構建體包含前面所述的分離的核酸。需要說明的是，“構建體包含前面所述的分離的核酸”表示，本發明的構建體包含與SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT突變的SACS基因突變體的核酸序列，或者包含與SEQ ID N0:1相比具有c.5840C>G突變的SACS基因突變體的核酸序列，或者同時包含上述兩種SACS基因突變體的核酸序列。由此，利用本發明的構建體轉化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用作痙攣性共濟失調病相關研究的模型。
[0013]根據本發明的第七方面，本發明還提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該重組細胞是通過前面所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。根據本發明的一些實施例，本發明的重組細胞，能夠有效地用作痙攣性共濟失調病相關研究的模型。
[0014]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0016]圖1:顯示了根據本發明一個實施例的篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的系統及其組成部分的示意圖，其中，
[0017]A為根據本發明實施例的篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的系統的示意圖，
[0018]B為根據本發明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0019]C為根據本發明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0020]圖2:顯示了根據本發明一個實施例的SACS患者家系的家系圖譜；
[0021]圖3:顯示了根據本發明一個實施例，圖2所示SACS患者家系內的兩名患者及其父母的SACS基因c.1229delT突變位點的Sanger測序驗證峰圖；
[0022]圖4:顯示了根據本發明一個實施例，圖2所示SACS患者家系內的兩名及其父母的SACS基因c.58400G突變位點的Sanger測序驗證峰圖；
[0023]圖5:顯示了圖2所示SACS患者家系中患者I小腦萎縮的頭部磁共振診斷圖。
【具體實施方式】
[0024]下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0025]SACS基因突變體
[0026]根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的核酸。根據本發明的實施例，與SEQ ID N0:1相比，該核酸具有c.1229delT突變，或者c.58400G突變。需要說明的是，本發明的分離的核酸編碼SACS突變體，也可以稱為“編碼SACS突變體的核酸”，即該核酸可以理解為與編碼SACS突變體的基因相對應的核酸物質，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與SACS的編碼基因相對應的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據本發明的一個具體示例，前面所述的編碼SACS突變體的核酸為DNA。根據本發明的實施例，發明人確定了 SACS基因的新突變體，這些突變體與痙攣性共濟失調病的發病密切相關，從而通過檢測上述突變體在生物樣品中是否同時存在，可以有效地檢測生物樣品是否易感痙攣性共濟失調病，也可以通過檢測這些突變體在生物體中是否同時存在，可以有效地預測生物體是否易感痙攣性共濟失調病。
[0027]對于本發明說明書和權利要求書中，提及核酸，本領域技術人員應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權利要求書中，雖然多數情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0:1，實際包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0028]這些編碼SACS突變體的核酸，是本申請的發明人通過高通量外顯子組測序聯合候選基因突變驗證的方法，確定的痙攣性共濟失調病的致病基因上的新突變，并且在現有技術中并未見到SACS基因上的c.1229delT和c.58400G的復合雜合突變與痙攣性共濟失調病相關的報道。
[0029]野生型SACS基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示:
【權利要求】
1.一種分離的核酸，其特征在于， 與SEQ ID N0:1相比，所述核酸具有c.1229delT突變，或者c.5840C>G突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2.一種分離的多肽，其特征在于， 與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有p.Leu410X突變，或者p.Prol947Arg突變， 任選地，所述多肽是由權利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與SEQ ID N0:1相比具有c.1229delT和c.58400G的復合雜合突變，是所述生物樣品易感痙攣性共濟失調病的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液、皮膚、毛發和肌肉的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉錄反應，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進一步包括: 針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果， 任選地，采用選自Hiseq2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構建核酸測序文庫進一步包括: 利用SACS基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增；以及 針對所得到的擴增產物，構建所述核酸測序文庫， 任選地，針對c.1229delT突變，所述SACS基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:4-5所示的核苷酸序列；針對c.58400G突變，所述SACS基因外顯子特異性引物具有如SEQID NO:6-7所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的系統，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與SEQ ID NO:1相比具有c.1229delT和c.58400G的復合雜合突變，判斷所述生物樣品是否易感痙攣性共濟失調病， 任選地，所述核酸提取裝置進一步包括: RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉錄單元，所述反轉錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對所述RNA樣本進行反轉錄反應，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
7.根據權利要求6所述的系統，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括: 文庫構建單元，所述文庫構建單元用于針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果， 任選地,所述文庫構建單元進一步包括: PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有SACS基因外顯子特異性引物，以便利用SACS基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，針對c.1229delT突變，所述SACS基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:4-5所示的核苷酸序列；針對c.58400G突變，所述SACS基因外顯子特異性引物具有如SEQID NO:6-7所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
8.一種用于篩選易感痙攣性共濟失調病的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測SACS基因突變體的試劑，其中 與SEQ ID NO:1相比，所述SACS基因突變體具有c.1229delT和c.58400G的復合雜合突變， 任選地，所述試劑為核酸探針或引物。
9.一種構建體，其特征在于，包含權利要求1所述的分離的核酸。
10.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過權利要求9所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。
【文檔編號】C12M1/34GK104178486SQ201310188366
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月20日 優先權日:2013年5月20日
【發明者】沈璐, 詹自雄, 王俊嶺, 唐北沙, 戴梅枝, 管李萍, 王俊 申請人:中南大學湘雅醫院, 深圳華大基因科技有限公司