Aagab基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了AAGAB基因突變體及其應(yīng)用，具體涉及分離的編碼AAGAB突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法，篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的系統(tǒng)，用于篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的試劑盒，構(gòu)建體以及重組細(xì)胞。其中，該分離的編碼AAGAB突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有選自下列的至少一種突變：c.552_554TAG>AT、C.535+1G>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。通過檢測(cè)該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。
【專利說明】AAGAB基因突變體及其應(yīng)用
[0001]優(yōu)先權(quán)信息
[0002]本申請(qǐng)請(qǐng)求2013年5月23日向中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的、專利申請(qǐng)?zhí)枮?01310234269.1的專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，并且通過參照將其全文并入此處。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及AAGAB基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離編碼AAGAB突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法，篩選遺憾I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的系統(tǒng)，用于篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的試劑盒，構(gòu)建體以及重組細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0004]點(diǎn)狀掌跖角化病(PPPK ；0MIM =148600)是一種以不規(guī)則分布于掌跖的大量的角化性斑塊為特征的罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為雙手掌與足跖部位的圓形或卵圓形、較硬的黃色或淡黃色角質(zhì)丘疹，若去除角質(zhì)丘疹后，局部可留有火山口樣的凹坑，可以伴有甲變形，典型的點(diǎn)狀皮損可以融合成塊，可能與遭受連續(xù)性高壓有關(guān)，一般足跖部位皮疹比掌部較大，少數(shù)患者也可不僅累及掌跖部位，其他部位如膝部、手足背部、肘部也可受累。其中，I型點(diǎn)狀掌妬角化癥(Punctate palmoplantar keratoderma typeI，PPKP1)，又稱為點(diǎn)狀掌跖角化病Buschke-Fischer-Brauer型，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、并且具有高度遺傳異質(zhì)性。
[0005]現(xiàn)階段，尋找致病基因?qū)膊≡\斷或治療意義重大。雖然目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)PPKPl的致病基因，涉及較多致病突變，但仍存在著相當(dāng)一部分未知的致病基因及致病位點(diǎn)。
[0006]因而，目前對(duì)I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的研究仍有待深入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法。
[0008]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作完成的:發(fā)明人通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序聯(lián)合候選基因突變驗(yàn)證的方法確定了 I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的新的致病基因——AAGAB基因，并發(fā)現(xiàn)了六個(gè)AAGAB基因上的治病突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼AAGAB突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 AAGAB基因的新突變體，該突變體與I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測(cè)該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Phel84Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Serll8Lysfs*3 和 p.Argl61*。通過檢測(cè)生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:從所述生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T是所述生物樣品易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的指示。通過根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法，可以有效地篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該系統(tǒng)包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T，判斷所述生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實(shí)施前述篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒含有:適于檢測(cè)AAGAB基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，該AAGAB基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的編碼AAGAB突變體的核酸。需要說明的是，“構(gòu)建體包含前面所述的分離的編碼AAGAB突變體的核酸”表示，本發(fā)明的構(gòu)建體包含與SEQ ID NO:1相比具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T的AAGAB基因突變體的核酸序列。由此，利用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞獲得的重組細(xì)胞，能夠有效地用于篩選治療I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的藥物。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明還提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該重組細(xì)胞是通過前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利用本發(fā)明的重組細(xì)胞，能夠有效地篩選治療I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的藥物。
[0016]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0018]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的系統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，
[0019]圖1A為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，
[0020]圖1B為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0021]圖1C為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0022]圖2-圖9依次顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的I型點(diǎn)狀掌跖角化癥患者家系FamiIy1-Family8 的家系圖；
[0023]圖10-圖15依次顯示了實(shí)施例2中檢測(cè)獲得的I型點(diǎn)狀掌跖角化癥患者的AAGAB基因的突變位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0025]AAGAB基因突變體
[0026]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼AAGAB突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和c.481C>T。在本文中所使用的表達(dá)方式“編碼AAGAB突變體的核酸”，是指與編碼AAGAB(即P34蛋白)突變體的基因相對(duì)應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與AAGAB突變體的編碼基因相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，前面所述的編碼AAGAB突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 AAGAB基因的新突變體，這些新突變體與I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測(cè)該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥，也可以通過檢測(cè)這些突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測(cè)生物體是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。
[0027]對(duì)于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，提及核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)際包括互補(bǔ)雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實(shí)際上也公開了與之互補(bǔ)的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0:1，實(shí)際包括其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測(cè)另一條鏈，反之亦然。
[0028]該編碼AAGAB突變體的核酸，是本申請(qǐng)的發(fā)明人通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序聯(lián)合候選基因突變驗(yàn)證的方法確定的I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的新的致病基因AAGAB的突變體。該致病基因及上述的致病突變位點(diǎn)在現(xiàn)有技術(shù)中并未被提到。
[0029]其中，野生型AAGAB基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列:
[0030]ATGGCTGCTGGCGTACCCTGTGCGTTAGTCACCAGCTGCTCCTCCGTCTTCTCAGGAGACCAGCTGGTCCAACATATCCTTGGAACAGAAGATCTTATTGTGGAAGTGACTTCCAATGATGCTGTGAGATTTTATCCCTGGACCATTGATAATAAATACTATTCAGCAGACATCAATCTATGTGTGGTGCCAAACAAATTTCTTGTTACTGCAGAGATTGCAGAATCTGTCCAAGCATTTGTGGTTTACTTTGACAGCACACAAAAATCGGGCCTTGATAGTGTCTCCTCATGGCTTCCACTGGCAAAAGCATGGTTACCTGAGGTGATGATCTTGGTCTGCGATAGAGTGTCTGAAGATGGTATAAACCGACAAAAAGCTCAAGAATGGTGCATCAAACATGGCTTTGAATTGGTAGAACTTAGTCCAGAGGAGTTGCCTGAGGAGGATGATGACTTCCCAGAATCTACAGGAGTAAAGCGAATTGTCCAAGCCCTGAATGCCAATGTGTGGTCCAATGTAGTGATGAAGAATGATAGGAACCAAGGCTTTAGCCTTCTCAACTCATTGACTGGAACAAACCATAGCATTGGGTCAGCAGATCCCTGTCACCCAGAGCAACCCCATTTGCCAGCAGCAGATAGTACTGAATCCCTCTCTGATCATCGGGGTGGTGCATCTAACACAACAGATGCCCAGGTTGATAGCATTGTGGATCCCATGTTAGATCTGGATATTCAAGAATTAGCCAGTCTTACCACTGGAGGAGGAGATGTGGAGAATTTTGAAAGACTCTTTTCAAAGTTAAAGGAAATGAAAGACAAGGCTGCGACGCTTCCTCATGAGCAAAGAAAAGTGCATGCAGAAAAGGTGGCCAAAGCATTCTGGATGGCAATCGGGGGAGACAGAGATGAAATTGAAGGCCTTTCATCTGATGAAGAGCACTGA(SEQ ID NO:1)，
[0031]其編碼的蛋白質(zhì)具有如下所示的氨基酸序列:
[0032]MAAGVPCALVTSCSSVFS ⑶ QLVQHILGTEDLIVEVTSNDAVRFYPWTIDNKYYSADINLCWPNKFLVTAEIAESVQAFVVYFDSTQKSGLDSVSSWLPLAKAWLPEVMILVCDRVSEDGINRQKAQEWCIKHGFELVELSPEELPEEDDDFPESTGVKRIVQALNANVWSNVVMKNDRNQGFSLLNSLTGTNHSIGSADPCHPEQPHLPAADSTESLSDHRGGASNTTDAQVDSIVDPMLDLDIQELASLTTGG⑶VENFERLFSKLKEMKDKAATLPHEQRKVHAEKVAKAFWMAIGGDRDEIEGLSSDEEH(SEQ ID NO:2)。
[0033]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的AAGAB基因突變體與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG和 c.481C>T,即相對(duì)于野生型AAGAB基因，本發(fā)明的AAGAB基因突變體發(fā)生下列的至少一種突變:其cDNA的第552位堿基到554位堿基由TAG突變?yōu)锳T(c.552_554TAG>AT)，第535位堿基往后推一個(gè)堿基處由G突變?yōu)锳(C.535+lG>A，剪切位點(diǎn)突變)，第 755 到 756 位堿基之間插入了 AAGCCAGTCT10 個(gè)堿基(c.755_756insAAGCCAGTCT),第725位堿基從T突變?yōu)镚 (c.725T>G)，第352位堿基到355位堿基之間缺失了TCTG4個(gè)堿基(c.352_355delTCTG),第481位堿基從C突變?yōu)門。由此，其所編碼的產(chǎn)物與野生型的AAGAB相比，具有相應(yīng)的突變:p.Phel84Leufs*6 (c.552_554TAG>AT)、p.Leu252Leufs*14 (c.755_756insAAGCCAGTCT)、ρ.Leu242* (c.725T>G)、p.Serll8Lysfs*3(c.352_355delTCTG)和p.Argl61* (c.481C>T),即上述突變是由于AAGAB基因的相應(yīng)突變而引起的。具體地，P.Phel84LeufS*6突變表示:第184位氨基酸處由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔笸?個(gè)變?yōu)榻K止子密碼；p.Leu252Leufs*14突變表示:第252位氨基酸處開始發(fā)生改變(252密碼子處依然為亮氨酸)，后推14位堿基突變?yōu)榻K止子；p.Leu242*突變表示--第242位氨基酸處由亮氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子；P.Serl 18Lysf s*3突變表示:第118位氨基酸處由絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔笸?位突變?yōu)榻K止密碼子；p.Argl61*突變表示:第161位氨基酸處由精氨酸直接突變?yōu)榻K止密碼子。其中，c.535+lG>A對(duì)應(yīng)的蛋白突變，是一個(gè)剪切位點(diǎn)突變，其后面的氨基酸變異無法預(yù)知。
[0034]AAGAB基因編碼一種由315個(gè)氨基酸組成的銜接素結(jié)合蛋白p34(在本文中有時(shí)也稱為“AAGAB”)，α-和Y -銜接蛋白是兩種可溶性配體復(fù)合體ΑΡ-1/ΑΡ-2的組成成分，而ρ34蛋白通常以配體的方式與α-和Y-銜接蛋白的ΝΗ2端相結(jié)合，從而通過與ΑΡ-1/ΑΡ-2結(jié)合來引導(dǎo)可溶性配體到達(dá)細(xì)胞膜的位置。另外AP-2通常還發(fā)揮一個(gè)EGFR信號(hào)的配體作用，此通路在形成胞內(nèi)小泡系統(tǒng)中發(fā)揮一個(gè)重要作用。有研究表明在HaCaT細(xì)胞系中對(duì)AAGAB基因進(jìn)行敲除可以使得EGFR信號(hào)表達(dá)升高20倍，p34蛋白的缺失可以導(dǎo)致與AP-2的結(jié)合受到抑制從而減少EGFR蛋白轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)小泡重新回到細(xì)胞表面。通過這個(gè)機(jī)制，p34蛋白在表皮角質(zhì)細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用。因而，從機(jī)制方面，也可以證明發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即AAGAB的突變會(huì)引起I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。但是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的致病新基因AAGAB以及上述的致病突變位點(diǎn)并未見報(bào)道。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與野生型AAGAB相比，該分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Phel84Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Serll8Lysfs*3 和 p.Argl61*,即該突變是由于 AAGAB基因的 c.552_554TAG>AT、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T突變的至少一種而引起的。具體地，p.Phel84Leufs*6突變表示:第184位氨基酸處由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔笸?個(gè)變?yōu)榻K止子密碼；p.Leu252Leufs*14突變表示:第252位氨基酸處開始發(fā)生改變(252密碼子處依然為亮氨酸)，后推14位堿基突變?yōu)榻K止子；P.Leu242*突變表示:第242位氨基酸處由亮氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子；p.Serl 18Lysfs*3突變表示:第118位氨基酸處由絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔笸?位突變?yōu)榻K止密碼子；P.Argl61*突變表示--第161位氨基酸處由精氨酸直接突變?yōu)榻K止密碼子。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該多肽是由前述分離的編碼AAGAB突變體的核酸編碼的。通過檢測(cè)生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥，也可以通過檢測(cè)這些多肽在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測(cè)生物體是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:
[0037]從所述生物樣品提取核酸樣本。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，生物樣品的類型并不受特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生物樣品AAGAB是否存在突變的核酸樣本即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，生物樣品可以為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種，優(yōu)選外周血。由此，可以方便地進(jìn)行取樣和檢測(cè)，從而能夠進(jìn)一步提高篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，這里所使用的術(shù)語“核酸樣本”應(yīng)做廣義理解，其可以是任何能夠反映生物樣品中MGAB是否存在突變的樣本，例如可以是從生物樣品中直接提取的全基因組DNA，也可以是該全基因組中包含AAGAB編碼序列的一部分，可以是從生物樣品中提取的總RNA，也可以是從生物樣品中提取的mRNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述核酸樣本為全基因組DNA。由此，可以擴(kuò)大生物樣品的來源范圍，并且可以同時(shí)對(duì)生物樣品的多種信息進(jìn)行確定，從而能夠提高篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，針對(duì)采用RNA作為核酸樣本，從生物樣品提取核酸樣本可以進(jìn)一步包括:從生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選RNA樣本為mRNA ；以及基于所得到的RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所得到的cDNA樣本構(gòu)成核酸樣本。由此，可以進(jìn)一步提高利用RNA作為核酸樣本篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的效率。
[0038]接下來，在得到核酸樣本之后，可以對(duì)核酸樣本進(jìn)行分析，從而能夠確定所得到核酸樣本的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，確定所得到核酸樣本的核酸序列的方法和設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以通過測(cè)序方法，確定核酸樣本的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用于進(jìn)行測(cè)序的方法和設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用第二代測(cè)序技術(shù)，也可以采用第三代以及第四代或者更先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以利用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一種對(duì)核酸序列進(jìn)行測(cè)序。由此，結(jié)合最新的測(cè)序技術(shù),針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)可以達(dá)到較高的測(cè)序深度，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高，因而能夠利用這些測(cè)序裝置的高通量、深度測(cè)序的特點(diǎn)，進(jìn)一步提高對(duì)核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)分析的效率。從而，能夠提高后續(xù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)的精確性和準(zhǔn)確度。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，確定核酸樣本的核酸序列可以進(jìn)一步包括:首先，針對(duì)所得到的核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫；以及對(duì)所得到的核酸測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，可以采用選自HiSeq2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一種對(duì)所得到的核酸測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以對(duì)核酸樣本進(jìn)行篩選，富集AAGAB外顯子，該篩選富集可以在構(gòu)建測(cè)序文庫之前，構(gòu)建測(cè)序文庫過程中，或者構(gòu)建測(cè)序文庫之后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，針對(duì)核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫進(jìn)一步包括:利用AAGAB外顯子特異性引物，對(duì)核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及針對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫。由此，可以通過PCR擴(kuò)增，富集AAGAB外顯子(尤其是第3、5、6、8號(hào)外顯子)，從而能夠進(jìn)一步提高篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，AAGAB外顯子特異性弓丨物的序列不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，這些AAGAB外顯子特異性引物(針對(duì)AAGAB的第3、5、6、8號(hào)外顯子)具有SEQ ID NO:5_12所示的核苷酸序列:
[0039]

【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼AAGAB突變體的核酸，其特征在于，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、c.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T, 任選地，所述核酸為DNA。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO:2相比，所述分離的多肽具有選自下列的至少一種突變:p.Phel84Leufs*6、p.Leu252Leufs*14、p.Leu242*、p.Serll8Lysfs*3 和p.Argl61*。
3.一種篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和c.481C>T，是所述生物樣品易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的指示， 任選地，所述生物樣本為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進(jìn)一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進(jìn)一步包括: 針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫；以及 對(duì)所述核酸測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一種對(duì)所述核酸測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序， 任選地,針對(duì)所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測(cè)序文庫進(jìn)一步包括: 利用AAGAB基因外顯子特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 針對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測(cè)序文庫， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:5-12所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T,判斷所述生物樣品是否易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥， 任選地，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括:RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括: 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫；以及 測(cè)序單元，所述測(cè)序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，用于對(duì)所述核酸測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果， 任選地,所述文庫構(gòu)建單元進(jìn)一步包括: PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有AAGAB基因外顯子特異性引物，以便利用所述特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO:5-12所示的核苷酸序列， 任選地，所述測(cè)序單元包括選自HISEQ2000、SOLiD,454和單分子測(cè)序裝置的至少一種。
8.一種用于篩選易患I型點(diǎn)狀掌跖角化癥的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測(cè)AAGAB基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述AAGAB基因突變體具有選自下列的至少一種突變:c.552_554TAG>AT、C.535+lG>A、c.755_756insAAGCCAGTCT、c.725T>G、c.352_355delTCTG 和 c.481C>T, 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地,所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO:5-12所示的核苷酸序列。
9.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的編碼AAGAB突變體的核酸。
10. 一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞是通過權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而獲得的。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104178489SQ201310264083
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月23日
【發(fā)明者】張學(xué)軍, 王俊, 楊森, 肖若, 孫良丹, 張青, 高敏, 崔紅宙, 王文俊 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 深圳華大基因科技有限公司