專利名稱：一種檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Id1 mRNA表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒，具體來說是一種檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Idl mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)瘤是起源于膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35. 26%—60. 96%。WHO于2008年公布按死亡率順序排位，惡性膠質(zhì)瘤是34 歲以下腫瘤患者的第2位死亡原因，是35 54歲患者的第3位死亡原因。在全球，每年惡性腦膠質(zhì)瘤無情地奪去18 60萬中青年人的寶貴生命。目前治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法是外科切除后再輔以放射治療和口服化療藥。但是對于GBM患者，其總體生存期為14.6 個月，而無進(jìn)展生存期只有7. 9個月。腫瘤組織中基因的檢測有利于進(jìn)一步從分子機(jī)制上對膠質(zhì)瘤進(jìn)行分型、診斷及預(yù)后判斷。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中基因水平是其進(jìn)行認(rèn)識膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的一個重要指標(biāo)。腫瘤組織中特異性基因mRNA的定量測定，有利于腫瘤的早期診斷，治療方案的確定以及預(yù)后的判斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測外周血中微量腫瘤細(xì)胞已成為可能并被嘗試。實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程。目前常用的Taqman熒光探針為寡核昔酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測不到熒光；在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5’ -3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。在PCR擴(kuò)增過程中，每個循環(huán)結(jié)束后檢測一次熒光強(qiáng)度，整個反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條工作曲線，根據(jù)該曲線可對未知模板進(jìn)行定量分析。實時熒光定量PCR技術(shù)是一種能夠準(zhǔn)確定量mRNA的檢測方法，通過檢測腫瘤特異性基因mRNA的表達(dá)以判斷循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在。Idl (DNA結(jié)合抑制蛋白)蛋白屬于helix-loop-helix (HLH)蛋白家族。Idl蛋白通過形成無活性的異二聚體，從而阻止bHLH家族轉(zhuǎn)入因子介導(dǎo)的細(xì)胞分化。并且阻止DNA在E boxes (CANNTG) ,N boxes (CACNAG)，或Ets (GGAA/T)等位點與bHLH蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。Idl蛋白在功能上慢參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長、分化、凋亡與血管生成。 一般的，Idl的mRNA的高表達(dá)出現(xiàn)在分化不全或者是胚胎細(xì)胞組織內(nèi)。Idl蛋白在惡性腫瘤的的發(fā)生中起著潛在的“扳機(jī)”樣作用，并且是一個潛在的癌基因。Idl在腫瘤中的作用是參與腫瘤細(xì)胞的分化、增生、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促血管生成及參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。當(dāng)Idl 基因的調(diào)節(jié)失衡，就會促使腫瘤的發(fā)生。(8J. D. Norton, ID helix-loop-helix proteins in cell growth, differentiation and tumorigenesis, J.Cell Sci. 113 (2000), pp. 3897-3905. View Record in Scopus | Cited By in Scopus (329)。)Idl 在 GBM 中的蛋白表達(dá)是升高的，GBM患者的Idl mRNA表達(dá)亦明顯上調(diào)。K-M總體生存分析發(fā)現(xiàn)Idl基因
3的拷貝數(shù)(copy number)值越高，GBM患者的預(yù)后越差。Idl的mRNA表達(dá)越高，預(yù)后越差。 cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，Idl的表達(dá)越高，死亡危險度升高(p < 0. 05)。而無進(jìn)展生存期(PFS) 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Idl與腫瘤的復(fù)發(fā)成正相關(guān)。故Idl在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中起到一個惡性相關(guān)的因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Idl mRNA表達(dá)量的試劑盒，要解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有合適的手段檢測檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Idl mRNA表達(dá)量的技術(shù)問題。本發(fā)明一種檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Idl mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括兩個引物和探針，一個引物的序列如SEQ ID NO :1所示，另外一個引物的序列如SEQ IDNO :2所示，所述的探針的序列如SEQ ID NO 3所示。進(jìn)一步的，所述試劑盒中還包括進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR所需的試劑。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA結(jié)合抑制蛋白Idl mRNA表達(dá)量中的應(yīng)用。發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的Idl mRNA的表達(dá)量與診斷及預(yù)后相關(guān)。 在Idl表達(dá)高的病例組中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存時間是縮短的，而在Idl表達(dá)較低一組中，患者的生存時間較前者是延長的。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中Idl的mRNA水平可以作為對于患者生存時間預(yù)測的一個生化指標(biāo)。本發(fā)明所提供的試劑盒可準(zhǔn)確定量待測標(biāo)本中人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA結(jié)合抑制蛋白mRNA表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中，可對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中 Idl mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行定性及定量分析，對判斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者治療效果及動態(tài)觀察病情具有重要意義，本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。


圖I為標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果。圖2為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I 一種檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本的Idl mRNA表達(dá)量的試劑盒的制備試劑盒中各組分為(一)細(xì)胞裂解液I ; (二)細(xì)胞裂解液II ;(三)RNA洗滌緩沖液I ;(四)RNA洗滌緩沖液II ;(五)無RNA酶的水；(六)RNA分離柱；(七)收集管； (八)PCR管；(九)DNA酶I儲存液；(十)反轉(zhuǎn)錄緩沖液；(i^一 ) dNTP混合物；(十二)逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液；(十三)PCR反應(yīng)液和探針；(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶((UNG酶)儲存液；(十五)標(biāo)準(zhǔn)品；(十六)對照品(包括陽性對照品和陰性對照品)。上述各組分的組成或制備如下(一)細(xì)胞裂解液I溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)0. lmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、0. lmol/L氯化鈉和O. 05mol/L氯化鎂，溶劑是水。細(xì)胞裂解液I在25°C條件下，pH值為7. 6。(二)細(xì)胞裂解液II溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)3mol/L異硫氰酸肌、2mol/L鹽酸肌、O. 3mol/L醋酸鈉、 O. 2%十二烷基硫酸鈉，溶劑是水。細(xì)胞裂解液II在25°C條件下，pH值為5. 2。(三)RNA洗滌緩沖液I溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)0. 2mol/L醋酸鈉、O. lmol/L氯酸鈉、O. lmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，溶劑是水。RNA洗滌緩沖液I在25°C條件下，pH值為7.6。(四)RNA洗滌緩沖液11溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)1. 2mol/L檸檬酸鈉、O. 5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，溶劑是水。RNA洗滌緩沖液II在25°C條件下，pH值為7. 5.(五)無RNA酶的水向去離子水中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)(購自Biobasic公司)，至終濃度為 O. 05%，22-25°C放置10-12小時后，121 °C高壓滅菌20分鐘，22_25°C放置備用。(六)RNA分離柱購于安徽優(yōu)晶生物工程有限公司。(七)收集管購于安徽優(yōu)晶生物工程有限公司。(八)PCR管購于美國Applied Biosystems (ABI)公司。(九)DNA酶I儲存液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50mmol/L三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、25mmol/L三輕甲基氨基甲烷一乙酞、12. 5mmol/L氯化鎂、5. 5mmol/L氯化鈣、25%甘油、O. 5U/ul DNA酶I。溶劑是水。DNA酶I儲存液在25 °C條件下，pH值為7. 5。(十)反轉(zhuǎn)錄緩沖液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)9.lumol/L Oligo (dT) 12_8(TaKaRa)、3. 6U/ulRNA 酶抑制劑、72. 7mmol/L 二硫蘇糖醇(Invitrogen)、182mmol/L三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、 273mmol/L氯化鉀、llmmol/L氯化鎂，溶劑是水。反轉(zhuǎn)錄緩沖液在25°C條件下，pH值為8. 3。( ^^一 ) dNTP 混合物含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽一水溶液，25°C條件下，pH值為7. 0-7. 5，四種 dNTP濃度終濃度均為10mmol/L。如dATP為脫氧腺苷三磷酸，磷酸上的三個氫中的一個或兩個被鈉所取代，便形成了鈉鹽。其他幾種也是如此，即dNTP是以鈉鹽形式存在的。(十二)逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鈉、0. lmmol/L 乙二胺四乙酸、I. 0mmol/L 二硫蘇糖醇(Invitrogen)、50 % 甘油、0. 01 % Nonidet p_40, 200U/ul逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen),溶劑是水。逆轉(zhuǎn)錄酶在25°C條件下,pH值為 7. 5。(十三)PCR反應(yīng)液和探針I(yè)，PCR 反應(yīng)液
溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)18. 5mmol/L三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、2. 78mmol/L氯化鎂、92. 6mmol/L 氯化鉀、O. 37a mol/L 上下游引物、O. lU/ulTaq 酶(TaKaRa)、400nmol/L dATP,400nmol/L dCTP, 400nmol/L dGTP, 400nmol/L dTTP，溶劑是水。PCR反應(yīng)液在25 °C條件下，pH值為8. 3。上述引物為Pl (上游引物)5，-gacatgaacggctgttactc-3' (SEQ ID NO 1),P2(下游引物)5，-ggttccaacttcggattc-3' (SEQ ID NO :2)。引物可溶于TE溶液中(TE溶液的組成為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸， lmmol/L乙二胺四乙酸,水)。2、探針探針序列為5，-FAM-accttcagttggagctgaactc-TAMRA-3'(SEQ ID NO:3)。探針可溶于TE溶液中(TE溶液的組成為lOmmol/L三羥甲基氨基甲烷一鹽酸， lmmol/L乙二胺四乙酸，水)，探針的濃度為2u mol/L。上述引物和探針是以Idl全長cDNA序列為模板，使用AB工7000型實時熒光定量 PCR儀隨機(jī)軟件分析TaqMan引物和探針位點，同時考慮Idl基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合得到的。上述引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)儲存液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50%甘油、30mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、 150mmol/L氯化鈉、I. 0mmol/L 乙二胺四乙酸、I. 0mmol/L二硫蘇糖醇(Invitrogen),0. 05% Tween20, lU/ul尿嘧啶DNA糖基化酶，溶劑是水。UNG酶儲存液在25°C條件下，pH值為7. 5.(十五)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品為終濃度為2X108拷貝數(shù)/I. I的pMD 18_Idll21重組質(zhì)粒，TE溶液溶解 (TE溶液的組成為lOmmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，lmmol/L乙二胺四乙酸，水)。標(biāo)準(zhǔn)品中插入的Idl片段的DNA序列如序列表中SEQ ID NO 4所示。I、細(xì)胞總RNA的提取I)將人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤u87細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基(Gibe。公司)按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。2)將培養(yǎng)的細(xì)胞用0. 25%胰蛋白酶(質(zhì)量百分含量)消化，IOOOrpm離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到I. 5mL離心管中，每管約1X106個細(xì)胞。3)提取細(xì)胞總RNA，具體過程如下①往沉淀的細(xì)胞中加入650ul細(xì)胞裂解液II (向細(xì)胞裂解液II中加入2_巰基乙醇，加入量為每ImL細(xì)胞裂解液II加入20ul濃度為14. 5mol/L的2-巰基乙醇，分裝2-巰基乙醇要在通風(fēng)櫥下進(jìn)行)，漩渦振蕩充分混勻。②再加入650ul的70%乙醇，漩渦振蕩混勻。③把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分離柱內(nèi)， IOOOg離心I分鐘，棄去流出液體并繼續(xù)進(jìn)行步驟③的操作。④向DNA酶I儲存液管中加入400ul無RNA酶的水，混勻、短暫離心收集，吸取45ul 該液體直接加到RNA分離柱濾膜上，室溫放置15分鐘。⑤吸取700ul RNA洗滌緩沖液I加入到RNA分離柱上洗滌柱子，IOOOOg離心I分鐘，棄去2mL收集管。⑥將RNA分離柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500ul經(jīng)稀釋的RNA洗滌緩沖液II (RNA洗滌緩沖液II在使用前，每3mL加入12mL無水乙醇)，IOOOOg離心I分鐘，棄
去流出液，該收集管可重復(fù)使用。⑦再用500ul的RNA洗滌緩沖液II洗滌柱子，離心并棄去流出液。然后12000g 離心I分鐘，甩干RNA分離柱基質(zhì)。⑧把柱子轉(zhuǎn)移到無RNA酶的I. 5ml離心管，加入50ul無RNA酶的水，確保加入的無RNA酶的水直接加在柱基質(zhì)上，IOOOg離心I分鐘，洗脫RNA。將裝有RNA溶液的離心管置于冰盒上，備用。2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將dNTP混合物及逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液加入反轉(zhuǎn)錄緩沖液中配制成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 (dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液、反轉(zhuǎn)錄緩沖液的體積比為2 I 11)，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，使用后剩余的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液可于20°C冰箱中保存。反轉(zhuǎn)錄體系為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3. 5ul、總RNA溶液4. Oul、無RNA酶的水2. 5ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為4201，15分鐘，951，5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,取出離心管置于冰盒上。3，PCR 擴(kuò)增用TaKaRa公司的普通PCR擴(kuò)增試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)體系為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5ul，IOXPCR緩沖液5. Oul，dNTP混合物4. Oul，上、下游引物(P1,P2)各 2. Oul，Taq 酶 O. 5ul、水 31.5ul。PCR反應(yīng)條件為先94°C、3分鐘再94°C、30秒，60°C，45秒，72°C、50秒，共35個循環(huán)，最后72 °C、7分鐘。4，Idl擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得I)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切取含121bp目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠，用紙巾擦千后，切碎，稱重，按照IOOmg = IOOul的比例確定膠的體積。2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自上海英俊生物技術(shù)有限公司)回收擴(kuò)增產(chǎn)物①按照試劑盒說明書中的比例在回收膠中加入DE-A液，60°C加熱至完全熔化。②加入O. 5倍體積于DE-A液的DE-B液，混勻；加入異丙醇，使其終濃度為20%。③將上述液體轉(zhuǎn)入制備管中，5500rpm離心I分鐘,棄濾液。④加入O. 5mL緩沖液Wl后，5500rpm離心I分鐘,棄濾液。⑤加入O. 7mL緩沖液W2, 5500rpm離心I分鐘,棄濾液。⑥再加入O. 7mL緩沖液W2, 5500rpm離心I分鐘，棄濾液;12000rpm,離心I分鐘，
以甩千濾膜基質(zhì)。⑦將制備管置于新的I. 5mL離心管中，在濾膜中央加入25ul水，室溫靜置I分鐘后，12000rpm,離心I分鐘洗脫DNA。5，Idl的克隆及鑒定I)重組載體的構(gòu)建①IOul 體系中，加入 Iul T 載體(pMD18-T Vector) (TaKaRa)，4ulDNA 樣品，加入 5u I連接緩沖液(100mmol/L三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、15mmol/L氯化鎂、I. Ommol/L三磷酸腺苷、20mmol/L 二硫蘇糖醇(Invitrogen)、lU/ulDNA連接酶。連接緩沖液在25°C條件下， pH值為7.5.), 16°C反應(yīng)14小時。②取5ul連接產(chǎn)物，加入到IOOul大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，混勻后冰浴40 分鐘，置于42°C水中熱休克90秒，冰浴2分鐘。③加入無抗生素的LB培養(yǎng)基400ul,于37°C搖床上以150rpm的速度混合振搖45 分鐘后，將離心管中液體均勻地涂布于LA平板上，37°C平放20分鐘后，倒置培養(yǎng)12小時。2)重組載體的鑒定①觀察LA平板上的菌落，隨機(jī)挑取長得較好的菌落，分別轉(zhuǎn)至裝有5mLLA培養(yǎng)基的大試管中，編號后置37°C搖床中，250rpm，振搖8-14小時左右，至OD6tltl ^ O. 4。②取I. 5mL培養(yǎng)物至離心管中，4°C，IlOOOrpm離心30秒，棄盡上清液。③IOOul 預(yù)冷的裂解液 I (500mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris. Cl (ρΗ8· O, 25。。)， 10mmol/LEDTA(pH8. O, 25 °C )，水)重懸沉淀，劇烈振蕩混勻后加入200ul新配制的裂解液II (200mmol/l NaOH, I % SDS,水)，混勻后，冰浴3分鐘，再加入150ul預(yù)冷的裂解液 III (3mol/L醋酸鉀；pH5. 2，25°C )，顛倒混勻后冰浴3-5分鐘；4°C，IlOOOrpm離心5分鐘后將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。④加入等體積的酚/氯仿(I 1)，振蕩后V C，IlOOOrpm離心2分鐘，再將上清
轉(zhuǎn)移至另一離心管。⑤加入1/10體積的3M NaAc溶液和2. 5倍無水乙醇，混勻后，室溫靜置10分鐘， 4°C, IlOOOrpm離心10分鐘后棄上清。⑥加入ImL 70%乙醇，振蕩漂洗后4°C，IlOOOrpm離心2分鐘；棄去上層液體。⑦加入少量無水乙醇，4°C, IlOOOrpm離心2分鐘，棄去乙醇后，室溫倒置10分鐘， 加入30ul蒸餾水溶解質(zhì)粒DNA。⑧取適量的質(zhì)粒DNA作為模板，在引物Pl和P2的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出151bp DNA片段的為陽性克隆質(zhì)粒，從而篩選出目的菌落。3) Idl擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定①質(zhì)粒的大量抽提A)取ImL含目的菌落的菌液，加入到30mL LA培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至OD6tltl約為 O. 6。B)取25mL上述菌液接種至300mLLA培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)10-14小時，然后VC, 4500rpm, 20分鐘離心收菌。C)用 200mL預(yù)冷的STE(10mmol/L Tris-HCl (PH8. O, 25°C ), O. Imol/LNaCI, lmmol/ L EDTA(PH8. 0，25°C )，水)重懸菌體，4°C，4500rpm，20 分鐘離心收菌。D)加入 9mL Solution I (500mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris. Cl (pH8. 0, 25°C ), IOmmoI/L EDTA (pH8. 0，25°C )，水)，混勻，再加入 ImL 用 IOmmoI/L Tris-HCl (ρΗ8· O)新鮮配制的溶菌酶(10mg/mL),再加入 IOmL新鮮配制的 Solution II (200mmol/l NaOH, I % SDS, 水)，輕輕混勻5-7次，室溫靜置5分鐘。E)加入 7. 5mL 冰冷的 SolutionIII (3mol/L 醋酸鉀；pH5. 2，25°C )，輕輕混勻，冰浴 10分鐘；4°C，IlOOOrpm離心10分鐘，取上清。F)加入2/3體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘，IlOOOrpm離心10分鐘，棄上清。G)用70%乙醇洗滌沉淀，8000rpm，15分鐘離心回收，用2mL TE溶解沉淀。H)加入2mL 5mol/L的LiCl，混勻，IOOOOg離心10分鐘，棄去上清。I)用70%乙醇洗滌沉淀，棄上清，盡量控干液體，室溫靜置至干燥。J)加入300ul TER，溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管中，37' C水浴1-2小時。K)加入 300ul I. 6mol/L NaCl (含 13%聚乙二醇)，混勻，4°C，12000rpm 離心 15 分鐘，棄上清。L)250ulTE(pH8. O)溶解沉淀，分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。M)取上清，加入60ull0mol/LNH4Ac及2倍體積的無水乙醇(或95%乙醇)，混勻，4。。，12000g離心5分鐘，棄上清。N)120ul75%乙醇洗滌沉淀，4°C，12000g離心10分鐘，棄上清，盡量控干液體，室
溫靜置至干燥。O)加入IOOul三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度計下檢測質(zhì)粒的濃度和純度。②質(zhì)粒的序列測定對含有目的基因片段的陽性克隆質(zhì)粒用美國Applied Biosystems公司的377測序儀進(jìn)行序列測定，結(jié)果重組載體中的插入片段Idl具有序列表中SEQ ID NO 4的DNA序列，將該重組載體命名為pMD 18-Idll21。將pMD 18_Idll21作為標(biāo)準(zhǔn)品。③將上述抽提得到的質(zhì)粒pMD 18-Idll21用TE溶液溶解(TE溶液的組成為 lOmmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，lmmol/L乙二胺四乙酸，水)至終濃度為2X108拷貝數(shù)
/ulo將上述各組分分裝，組合為10人份的試劑盒，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解液 I I瓶(30mL/瓶)、細(xì)胞裂解液II I瓶(IOmL/瓶)、RNA洗滌緩沖液I I瓶(IOmL/瓶)、 RNA洗滌緩沖液II I瓶(3mL/瓶)、無RNA酶水I瓶(4mL/瓶)、RNA分離柱、收集管、PCR 管、DNA酶I儲存液I管(120ul/管)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液I管(33ul/管)、dNTP混合物I管 (6. Oul/管)、逆轉(zhuǎn)錄酶I管(3. Oul/管)，PCR反應(yīng)液I管(251. 75ul/管)、UNG酶儲存液 I管(4. 75ul/管)、探針I(yè)管(28. 5ul/管)、標(biāo)準(zhǔn)品I管(loul/管)實施例2、人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA結(jié)合抑制蛋白基因mRNA表達(dá)量的檢測用實施例I制備的10人份的試劑盒檢測下述實驗組和對照組標(biāo)本中的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA結(jié)合抑制蛋白基因mRNA表達(dá)量。實驗組6例病理診斷確診的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者一、標(biāo)本檢測I)取出組織，在液氮中研磨成粉末2)待液氮揮發(fā)干,立即加入Trizol,每IOOmg組織中加Iml Trizol,融化后用加樣槍反復(fù)吸吹，使樣品充分裂解，移入I. 5ml離心管中，室溫靜置3 5分鐘。3)加入0. 2ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15秒，在15_30°C放置2_3分鐘，然后離心12，OOOXg, 15minutes, 2-8°C。離心后分成三層，下面的紅色為酹_氯仿相，一個中間層，一面是無色的水相。RNA只存在于水相中。水相占總TRIZOL的60%。4)RNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中，加入0. 5ml異丙醇，靜置 IOminutes, 15_30°C,然后離心12, OOOXg, IOminutes, 2_8°C。離心前可以在管的側(cè)壁和底部看到絮狀膠樣沉淀，這就是RNA沉淀。5) RNA洗滌去上清，加入Iml 75 %乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心 7,500Xg,5minutes,2-8°C。6)RNA再溶解去上清，置真空或空氣中5_10分鐘，干燥RNA沉淀，(不能在真空中離心干燥)。注意不能將RNA沉淀完全干燥，這樣會極大地降低它的溶解度。部份溶解的 RNA 樣品其 A260/280ratio <1.6。7)用無RNase水或O. 5% SDS溶液重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10 分鐘，55-60 V。測濃度后-20 V保存。8)測濃度取2 μ I儲存液加入另一個EP管中，再加入98 μ I無RNase水，離心混勻，以無 RNase 水作空白對照，測 0D260/280 值。IOD = 40 μ g RNA。0D260/280 值在 I. 8-2. O 視為純度很高。一般濃在1000ng/ml較準(zhǔn)。濃度太高要稀釋以后再測定。9) RNA鑒定甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA完整性和DNA污染情況。四、熒光定量PCRI、實驗組樣品RNA的反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3. 5ul、總RNA溶液5. . Oul、無RNA酶的水I. 5ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C、15分鐘，95°C、5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物取出置于冰盒上。得到實驗組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。2、標(biāo)準(zhǔn)品的處理將標(biāo)準(zhǔn)品貯存液(2X108拷貝數(shù)/ul)梯度稀釋為 2X107，2X106，2X105，2X104，2X103， 2X102,2X101 拷貝數(shù)/ul。3，熒光定量PCR①β -actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3 μ I按 10倍稀釋(加水27 μ I并充分混勻)為IO10,依次稀釋至109、IO8、107、IO6、105、IO4,以備用。②反應(yīng)體系如下標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系序號反應(yīng)物劑量I SYBR Green I 染料 10 μ I2陽性模板上游引物F O. 5 μ I3陽性模板下游引物R O. 5 μ I4 dNTP O. 5 μ I5 Taq 酶 I μ I6 6 陽性模板 DNA 5 μ I7 ddH20 32. 5 μ I8 總體積 50 μ I輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反應(yīng)體系序號反應(yīng)物劑量I SYBR Green I 染料 10 μ I2內(nèi)參照上游引物F O. 5μ I
3內(nèi)參照下游引物R O. 5μ I4 dNTP O. 5 μ I5 Taq 酶 I μ I6 待測樣品 cDNA5yl7 ddH20 32. 5 μ I8 總體積 50 μ I輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為93°C 2分鐘，然后 93 0C I分鐘，55°C 2分鐘，共40個循環(huán)。五、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)品突光定量PCR檢測結(jié)果如圖I所示。橫坐標(biāo)為PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù),縱坐標(biāo)為檢測器檢測到的熒光值，圖中曲線從左至右分別代表起始模板數(shù)為1X108，1X107， IXlO6. IXlO5, IXlO4，IXlO3, IX102 拷貝數(shù)。根據(jù)檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。橫坐標(biāo)為模板稀釋度，縱坐標(biāo)為Ct值。六、檢測結(jié)果選中上述所有樣品檢測孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相應(yīng)分析，得出待測樣品的起始模板數(shù)((M)。每毫升樣本中Idl mRNA的拷貝數(shù)N = M X 6. 6。6例臨床確診的腦腺癌患者檢測結(jié)果均為陽性，具體結(jié)果如表I所示。患者編號性別年齡標(biāo)本Idl mRNA值(拷貝數(shù)/毫升全血)
權(quán)利要求
1.一種檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Idl mRNA表達(dá)量的試劑盒，其特征在于包括兩個引物和探針，其中一個引物的序列如SEQ ID NO :1所示，另外一個引物的序列如SEQ ID NO :2所示，所述的探針的序列如SEQ ID NO 3所示。
2.如權(quán)利要求I所述的一種檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IdlmRNA表達(dá)量的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR所需的試劑。
3.權(quán)利要求I或2所述的一種檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IdlmRNA表達(dá)量的試劑盒在檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Idl mRNA表達(dá)量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Id1 mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括兩個引物和探針，一個引物的序列如SEQIDNO1所示，另外一個引物序列如SEQIDNO2所示，所述的探針的序列如SEQIDNO3所示。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA結(jié)合抑制蛋白Id1mRNA表達(dá)量中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的試劑盒可準(zhǔn)確定量待測標(biāo)本中人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DNA結(jié)合抑制蛋白Id1mRNA表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中，可對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的外周血中Id1mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行定性及定量分析，對判斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者治療效果及動態(tài)觀察病情具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102586458SQ20121006779
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者蘭津, 邱永明 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院