溶菌酶—曲拉通聯合破碎醋酸桿菌提取乙醛脫氫酶的方法
【專利摘要】一種溶菌酶—曲拉通聯合破碎醋酸桿菌提取乙醛脫氫酶的方法，屬于從菌體細胞中提取乙醛脫氫酶的方法。利用溶菌酶和曲拉通聯合破碎細胞的方法，先用溶菌酶破壞菌體的細胞壁，再采用曲拉通把乙醛脫氫酶從膜上解離下來，高效破碎細胞、較好地保持乙醛脫氫酶活性；取醋酸桿菌濕菌體，加入含溶菌酶的Tris-HCl緩沖溶液，37℃保溫；再加入曲拉通X-100溶液，搖勻，置室溫下反應，收集上清液，即得乙醛脫氫酶粗酶液。此法工藝簡單，條件溫和，不需特殊的儀器設備，不僅可以很好地破碎細胞，分離膜結合酶，而且還可使乙醛脫氫酶保持較高的活性，具有廣闊的推廣應用前景。
【專利說明】溶菌酶一曲拉通聯合破碎醋酸桿菌提取乙醛脫氫酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從菌體細胞中提取乙醛脫氫酶的方法，特別是一種溶菌酶一曲拉通聯合破碎細胞提取乙醛脫氫酶的方法。
【背景技術】
[0002]乙醒脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中，在輔酶I存在的條件下，它催化包括乙醇在內的某些一級或二級醇、醛和酮的脫氫反應。在人類和其他許多動物體內，線粒體乙醛脫氫酶能轉化對生物體有害的醇類，所以在細胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到了高度關注。同時，乙醛脫氫酶在分子生物學以及與其相關疾病的檢測方面也多有應用。
[0003]由于乙醛脫氫酶在自然界含量極少，從動植物體內提取的成本非常高，而微生物發酵的生產周期短，培養基價格低廉，酶制劑可以實現大規模、低成本的工業化生產，因此從微生物細胞中提取ALDH并制成酶制劑具有廣闊的市場前景。
[0004]醋酸桿菌(Acetobacter)為醋酸產生菌，醋酸發酵即是通過結合于其細胞膜上的將乙醇氧化成乙醛的乙醇脫氫酶(ADH)和將乙醛再氧化成醋酸的乙醛脫氫酶(ALDH)來完成。因此，醋酸桿菌是乙醛脫氫酶的良好來源，獲取乙醛脫氫酶需首先需對細胞進行破碎，使酶液釋放出來，因此，尋找一種既能高效破碎醋酸桿菌細胞，又能有效維持AIDH活性的方法非常必要。
[0005]目前，從微生物菌體細胞中提取乙醛脫氫酶采用的都是單一破碎方法，機械破碎法破碎效果較好，但酶活較低；反復凍融法耗時長、易造成酶失活，且冰柜要求高，成本高；超聲波破碎法產生的化學自 由基團及瞬間產生的高溫易使酶變性失活。酶溶法通過生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解，專一性強，條件比較溫和，對于生物活性分子的損傷較少。其中，破碎細菌主要采用溶菌酶，其通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β -1, 4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解；化學方法多采用表面活性劑、有機溶劑、抗生素、金屬螯合劑等化學藥品，通過改變細胞壁或膜的通透性從而使內含物有選擇地滲透出來。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種溶菌酶一曲拉通聯合破碎醋酸桿菌提取乙醛脫氫酶的方法，解決目前的機械破碎法的酶活較低、超聲波破碎法的酶變性失活的問題。
[0007]本發明所采取的技術方案如下:一種溶菌酶一曲拉通聯合破碎醋酸桿菌提取乙醛脫氫酶的方法，利用溶菌酶和曲拉通聯合破碎細胞的方法，先用溶菌酶破壞菌體的細胞壁，再采用曲拉通把乙醛脫氫酶從膜上解離下來，高效破碎細胞、較好地保持乙醛脫氫酶活性；
具體步驟如下:
(I)濕菌體的獲得:取醋酸桿菌發酵液，3000 r/min離心20min,將收集的濕菌體用蒸懼水洗漆2-3次,每次洗漆完,于3000r/min離心IOmin,傾去上清液；
(2)溶菌酶破碎菌體，取處理好的濕菌體，每克濕菌體加入IOmL含7mg/mL溶菌酶的緩沖溶液，所述的緩沖溶液為PH 8.0、20mmoI/L的Tris-HCl ;混勻，于37°C水浴鍋中保溫80min,中間振搖3次；
(3)曲拉通破碎菌體:每克濕菌體加入2mL10%的曲拉通X-100溶液，混勻，置室溫下反應8min ；
(4)乙醛脫氫酶粗酶液的獲得:將以上處理過的菌體溶液于12000r/min離心15 min,收集上清液，即為乙醛脫氫酶粗酶液。
[0008]有益效果，由于采用了上述方案，利用曲拉通的非離子表面活性劑，具親水端和疏水端，將膜蛋白從細胞膜上解離下來，達到提取膜蛋白的作用，曲拉通法大大降低了膜結合酶的分離難度，從而有利于細胞膜結合酶乙醛脫氫酶的提取。所得的乙醛脫氫酶粗酶液，經檢測其蛋白質含量為76.293Pg/mL，乙醛脫氫酶活為0.502U/mL ;而溶菌酶法所得蛋白質含量為64.989Pg/mL，乙醛脫氫酶活為0.406 U/mL ；曲拉通法所測蛋白質含量為71.076μδ/mL,乙醛脫氫酶活為0.404U/mL。可見，采用溶菌酶-曲拉通聯合破碎法后，細胞破碎程度和所得乙醛脫氫酶活都有了顯著提高。解決了目前的機械破碎法的酶活較低、超聲波破碎法的酶變性失活的問題，達到了本發明的目的。
[0009]優點:工藝簡單，條件溫和，不需特殊的儀器設備，不僅可以很好地破碎細胞，分離膜結合酶，而且還可使酶保持較高的活性，使得提取所得乙醛脫氫酶酶活較高。
【具體實施方式】
[0010]實施例1:利用溶菌酶和曲拉通聯合破碎細胞的方法，先用溶菌酶破壞菌體的細胞壁，再采用曲拉通把乙醛脫氫酶從膜上解離下來，高效破碎細胞、較好地保持乙醛脫氫酶活性；
取醋酸桿菌發酵液200mL，對醋酸桿菌發酵液進行3000 r/min離心20min，棄去上清得到菌體沉淀，將收集的濕菌體用蒸懼水洗漆2-3次,每次洗漆完,于3000r/min離心IOmin,傾去上清液。取處理好的濕菌體lg，加入含7mg/mL溶菌酶的pH8.0、20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液10mL，搖勻， 將搖勻后的混合液放在37°C水浴鍋中保溫80min，中間振搖3次。再加入2mL 10%曲拉通X-100溶液，置室溫下反應8min，12000 r/min離心15min，收集上清液，此即為提取的乙醛脫氫酶粗酶液。
【權利要求】
1.一種溶菌酶一曲拉通聯合破碎醋酸桿菌提取乙醛脫氫酶的方法，其特征是:利用溶菌酶和曲拉通聯合破碎細胞的方法，先用溶菌酶破壞菌體的細胞壁，再采用曲拉通把乙醛脫氫酶從膜上解離下來，高效破碎細胞、較好地保持乙醛脫氫酶活性；具體步驟如下: (1)濕菌體的獲得:取醋酸桿菌發酵液，3000r/min離心20min,將收集的濕菌體用蒸懼水洗漆2-3次,每次洗漆完,于3000r/min離心IOmin,傾去上清液； (2)溶菌酶破碎菌體，取處理好的濕菌體，每克濕菌體加入IOmL含7mg/mL溶菌酶的緩沖溶液，所述的緩沖溶液為PH 8.0、20mmoI/L的Tris-HCl ;混勻，于37°C水浴鍋中保溫80min,中間振搖3次； (3)曲拉通破碎菌體:每克濕菌體加入2mL10%的曲拉通X-100溶液，混勻，置室溫下8min ； (4)乙醛脫氫酶粗酶液的獲得:將經溶菌酶-曲拉通聯合破碎過的菌體溶液于12000r/min離心15 min，收集上清液 ，即為乙醛脫氫酶粗酶液。
【文檔編號】C12R1/02GK103468654SQ201310264620
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年6月28日 優先權日:2013年6月28日
【發明者】李文, 王陶, 何廣會 申請人:徐州工程學院