專利名稱：一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的方法
技術領域：
本發明涉及酵母中乙醛脫氫酶的制備技術領域，具體是一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的方法。
背景技術：
乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中，在輔酶I存在的條件下，它催化某些醛和酮的脫氫反應。在人類和其他許多動物體內， 線粒體乙醛脫氫酶能把對生物體有害的醛類轉化。人體由腸道吸收攝入的乙醇，主要在肝臟內代謝。乙醇進入體內后，首先在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下使乙醇脫氫轉化為乙醛， 然后在由乙醛脫氫酶(ALDH)的催化作用下，使乙醛被氧化生成乙酸，乙酸通過三羧酸循環 (TCA)分解為(X)2和水，并釋放能量生成ATP。人體中，一般都存在前一種酶，而且數量基本是相等的。但缺少后一種酶的人就比較多，在亞洲地區，50%的人缺少ALDH。ALDH的缺少， 使乙醇不能被完全分解為水和CO2,以乙醛的形式繼續留在體內。乙醛是毒性很強的物質， 可以共價結合微粒體蛋白形成乙醛蛋白絡合物，抑制肝細胞合成蛋白的排出，最終造成人體酒精性肝病的發生。而且乙醛還在體內通過黃嘌呤氧化酶轉變為超氧化合物，導致膜脂質過氧化生成丙二醛和壬烯，它們可以進一步促進肝細胞釋放因子，破壞細胞膜。當乙醛在體內累積過多時，會使人酒后產生臉紅、惡心、嘔吐、全身出汗、肌肉抽搐等癥狀，嚴重時會導致休克。乙醛在體內是潛在的致癌物質，能引起體內口腔、食道、腸道、肝臟癌型。因此， 乙醛在ALDH的催化作用下氧化分解至關重要。ALDH由于存在特殊的催化作用，在社會生產和日常生活中的應用將日益廣泛。現有技術中，制備ALDH遇到的一個問題是用研磨和色譜柱技術從動植物細胞中分離提取，費用高、純化產率低、ALDH含量少，難以大規模生產。在制備ALDH遇到的另一個問題是現有的商品ALDH主要是從動物的肝臟、胰腺或肝細胞線粒體中分離提取，資源有限且價格昂貴，極大地阻礙了這一產品的應用價值。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的方法。該方法使用超聲波破碎法來破碎雪峰干酵母細胞得到粗酶液ALDH，并用硫酸銨沉淀和kphadex G-75分離純化粗酶液ALDH，可以得到純化倍數較高、活力較大、分子量分布在57kDa左右的ALDH，所得產品可以應用于一般食品生產、醫療領域以及基因工程當中， 特別適用于解酒產品的開發。實現本發明目的所采用的技術方案包括
一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的制備方法，包括如下步驟
(1)將雪峰干酵母加入水中混勻，在30°C 40°C的水浴中孵育10mirT20min，再高速離心后取沉淀即得濕酵母；其中雪峰干酵母的重量與水的體積比為59Γ15% ；
(2)將該濕酵母加入濃度為0.05mol/L、pH為7. 5^8. 5的磷酸鹽緩沖液中配制成菌懸液，將該菌懸液超聲波破碎后，離心，收集上清液，即為粗酶液；其超聲波破碎的條件為處理量為15mL 25mL、溫度1°C 8°C、超聲功率為250W 350W、每次超聲時間廣4s、間隔時間廣8s、總的超聲時間l(T20min ；濕酵母的重量與磷酸鹽緩沖液的體積比為15°/Γ25% ；
(3)將飽和度為30%飛0%的硫酸銨加入上述所得的粗酶液中，離心，取其上清液，再將飽和度為659Γ85%的硫酸銨加入該上清液中，離心，取其沉淀，并向該沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全溶解后，分離，即可得到所需的乙醛脫氫酶酶。所述步驟(1)中雪峰干酵母的重量與水的體積比為89Γ12%。所述步驟(1)中雪峰干酵母孵育的水浴溫度為33°C 37°C，孵育時間為 13min 17min。所述步驟(2)中濕酵母的重量與磷酸緩沖液的體積比為189Γ22%。所述超聲波破碎的處理量為18m廣22mL。所述磷酸緩沖液的pH值為7. 8 8. 2。
所述超聲波破碎的溫度為2。C~6。C。所述超聲波破碎的功率為280W 320W。所述每次超聲波破碎的時間為廣3s、間隔時間為廣5s、總時間為12 18min。所述步驟(4 )中粗酶液經兩次分級沉淀的硫酸銨飽和度分別為359Γ55%和 709^80%。由于一般酵母的細胞壁較厚，ALDH容易受外部極端環境影響而失去活性，因此篩選出對ALDH活力影響小的酵母細胞破碎方法是解決問題的關鍵。破碎酵母細胞壁除有反復凍融法、化學滲透法、研磨法、超聲破碎法等，其中超聲破碎法是利用超聲波的空化效應、機械效應將酵母的細胞壁破碎，這一方法與其他方法相比，對細胞破碎效果好，對ALDH活力影響小的特點。本發明的關鍵是超聲破碎雪峰干酵母細胞。超聲破碎是一種利用超聲波的空化效應和機械效應達到有效破碎酵母細胞釋放ALDH的目的，配合降溫措施可較有效保存ALDH 的活力。本發明與現有技術相比，具有以下優點和有益效果
1.本發明中使用的酵母為雪峰干酵母，為面包酵母，可食用，并且易培養，周期短，價格低廉，有利于降低生產成本。2.本發明用超聲波破碎雪峰干酵母釋放ALDH，從而提高了細胞破碎效果，有效保存了 ALDH的活力，提高了酵母利用率。3.本發明制取的ALDH的品質可達到或超過國內同類產品，提取ALDH后的酵母仍可以作為他用如制飼料、提蛋白等，既提高了酵母的利用價值，又提供了一種具有自主知識產權的ALDH的制取方法。
具體實施例方式為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，但是本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。實施例1
第一步取一定量的雪峰干酵母按8% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育15min,制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質量體積比20%(W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH7. 5)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時間3s、間隙時間Is、總時間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min,收集上清液，即為ALDH粗酶液，經檢測ALDH的活力達到0. 46U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 lOmin，收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH7. 5)，將沉淀溶解，經檢測 ALDH的比活力達到1. 03U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, ρΗ7· 5)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經測定ALDH的比活力達到 1. MU/mg，經電泳測定和標準品有共同的條帶，并且測定的ALDH分子量為57kDa左右。實施例2
第一步取一定量的雪峰干酵母按10% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質量體積比20% (W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH8. 0)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時間3s、間隙時間Is、總時間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min,收集上清液，即為ALDH粗酶液，經檢測ALDH的活力達到0. 48U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 lOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH8. 0)，將沉淀溶解，經檢測 ALDH的比活力達到1. 07U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, ρΗ8· 0)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經測定ALDH的比活力達到 1. 27U/mg，經電泳測定和標準品有共同的條帶，并且測定的ALDH分子量為56kDa左右。實施例3
第一步取一定量的雪峰干酵母按12% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質量體積比20% (W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH8. 5)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時間3s、間隙時間Is、總時間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min,收集上清液，即為ALDH粗酶液，經檢測ALDH的活力達到0. 50U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 lOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH8. 5)，將沉淀溶解，經檢測ALDH的比活力達到1. 09U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, pH8. 5)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經測定ALDH的比活力達到 1. 30U/mg，經電泳測定和標準品有共同的條帶，并且測定的ALDH分子量為57kDa左右。實施例4
第一步取一定量的雪峰干酵母按14% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質量體積比20% (W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH7. 5)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時間3s、間隙時間Is、總時間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為ALDH粗酶液，經檢測ALDH的活力達到0. 45U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 IOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH7. 5)，將沉淀溶解，經檢測 ALDH的比活力達到1. 03U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, pH7. 5)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經測定ALDH的比活力達到 1. 22U/mg，經電泳測定和標準品有共同的條帶，并且測定的ALDH分子量為56kDa左右。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將雪峰干酵母加入水中混勻，在30°C 40°C的水浴中孵育10mirT20min，再高速離心后取沉淀即得濕酵母；其中雪峰干酵母的重量與水的體積比為59Γ15% ；(2)將該濕酵母加入濃度為0.05mol/L、pH為7. 5^8. 5的磷酸鹽緩沖液中配制成菌懸液，將該菌懸液超聲波破碎后，離心，收集上清液，即為粗酶液；其超聲波破碎的條件為處理量為15mL 25mL、溫度1°C 8°C、超聲功率為250W 350W、每次超聲時間廣4s、間隔時間廣8s、總的超聲時間l(T20min ；濕酵母的重量與磷酸鹽緩沖液的體積比為15°/Γ25% ；(3)將飽和度為30%飛0%的硫酸銨加入上述所得的粗酶液中，離心，取其上清液，再將飽和度為659Γ85%的硫酸銨加入該上清液中，離心，取其沉淀，并向該沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全溶解后，分離，即可得到所需的乙醛脫氫酶酶。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中雪峰干酵母的重量與水的體積比為89Γ12%。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中雪峰干酵母孵育的水浴溫度為33°C 37°C，孵育時間為13mirTl7min。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中濕酵母的重量與磷酸緩沖液的體積比為18% 22%。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎的處理量為18m廣22mL。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液的PH值為7.8 8. 2。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎的溫度為2V 6°C。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎的功率為^0W 320W。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，每次超聲波破碎的時間為廣3s、間隔時間為廣5s、總時間為12 18min。
10.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中粗酶液經兩次分級沉淀的硫酸銨飽和度分別為35% 55%和70% 80%。
全文摘要
本發明公開了一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的制備方法，包括如下步驟將雪峰干酵母加入水中，孵育，得濕酵母并加入磷酸鹽緩沖液中配制成菌懸液，將該菌懸液超聲波破碎后，離心，收集上清液，即為粗酶液；將飽和度為30%~60%的硫酸銨加入上述所得的粗酶液中，離心，取其上清液，再將飽和度為65%~85%的硫酸銨加入該上清液中，離心，取其沉淀，并向該沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全溶解后，分離，即可得到所需的乙醛脫氫酶酶。本發明突破了乙醛脫氫酶來源的局限性，實現了原料的來源廣、價格低廉和易培養，具有產品活性高、產品純度高和反應過程簡單可控的優點。
文檔編號C12N9/02GK102533684SQ201210005420
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者吳暉, 賴富饒, 陳貴川 申請人:華南理工大學