大豆轉基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明是檢測用品領域內的一種大豆轉基因檢測試劑盒，由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重PCR引物組合，各對引物為Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS、P35S和大豆內源基因序列Lectin，膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列和一組陽性對照探針序列，分別為Pat探針、Bar探針、Cry1Ab探針、Cry105探針、EPSPS探針、P35S探針、Lectin探針和Positive探針，引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5’端帶生物素標志（biotin）的Tag引物。本發明克服了現有技術費時費力成本高的缺陷，提供的大豆轉基因檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉。
【專利說明】大豆轉基因檢測試劑盒
所屬【技術領域】
[0001]本發明涉及檢測用品領域，具體為一種大豆轉基因檢測試劑盒。
【背景技術】 [0002]轉基因玉米和轉基因大豆是目前全球最主要的轉基因糧食作物。轉基因大豆是最早商業化種植，推廣應用速度最快的轉基因糧食作物。自從1996年被批準商業化生產以來,截至2008年種植面積已達到6580萬公頃，占全球大豆總種植面積的69%,占全球轉基因作物的53%。由于轉基因產品在全球市場中的大量涌現，其環境和食品安全問題也引起國際性的高度關注。各國相繼制定并出臺了相應的法律法規，對轉基因作物的環境釋放和產品銷售采取嚴格的管理措施。目前已有超過40個國家要求對轉基因生物及其產品實施標識管理。我國于2001年5月23日發布了國務院第304號令《農業轉基因生物安全管理條例》，實現了對轉基因生物的規范管理，并于2002年3月20日起施行《農業轉基因生物標識管理辦法》，要求對包括轉基因玉米和轉基因大豆在內的5類轉基因生物及其產品進行標識。因此，快速、準確、靈敏、廉價和相應通量的轉基因產品檢測技術是非常關鍵的。轉基因產品的檢測技術主要包括基于蛋白的檢測方法和基于核酸的檢測方法。酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫試紙條和Western雜交等方法是目前主要的基于蛋白的檢測方法，其共同特點是需要通過一定的處理步驟從樣品中釋放出目標蛋白(抗原)，然后利用抗體特異性的結合抗原蛋白，最后通過酶標或金屬標偶聯抗體與抗原抗體復合物結合，從而產生可檢測的信號，該類方法的缺點是檢測靈敏度相對較低，并且需要制備高特異性抗體，同時檢測容易受到多種因素的影響，出現假陽性。而基于核酸的檢測方法是目前最普遍、最準確的轉基因檢測技術，檢測方法主要包括PCR (聚合酶鏈式反應)技術和基于分子雜交的基因芯片技術。目前仍以PCR技術應用最為廣泛，其常用的技術方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR等方法。普通定性PCR方法檢測效率低，尤其檢測多基因對象時更加費時費力；巢式PCR雖然提高了檢測的靈敏度，但同樣存在檢測效率的問題；多重PCR方法可以在一個反應中同時檢測多個基因，但常規的電泳檢測結果很難判斷，容易出現假陽性和假陰性結果；熒光定量PCR方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測儀器。基因芯片也是常用的轉基因產品檢測技術，目前一般采用玻璃片作為固相支持物，實驗過程需要相應的點樣儀和芯片識讀儀，同樣成本較高。因此研發一種快速、方便、靈敏、廉價、可視化和高通量的檢測方法將具有非常好的應用前景。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是為了克服現有技術費時費力成本高的缺陷，提供一種操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉的大豆轉基因檢測試劑盒。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
本發明的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重PCR引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下:Pat:正向引物:TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物:GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar:正向引物:GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物:GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
CrylAb:正向引物:CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物:CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cryl05:正向引物:ACTCGATCAGGTACAATGCCA
反向引物:GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS:正向引物:GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物:TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S:正向引物:AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物:GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Lectin:正向引物:CAGCAATATCCTCTCCGATGTG
反向引物:AGGATCAATGTTACTGCTAGCGTG ；
膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列和`一組陽性對照(Positive)探針序列，7組探針序列和陽性對照探針序列`的堿基序列5’ -3’如下:
Pat 探針:GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT GTGGCTGGTATTGCTT
Bar 探針:ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC TACATCGAGACAAGCAC
CrylAb 探針:GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT TTGGTCCATCTCAATG
Cryl05 探針:GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS 探針:ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S 探針:CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT GACGCACAATCCCAC
Lectin 探針:CTCGACATACCTGGGGAATCGCATGACGTGCTTTCTTGGTC TTTTGCTTCCAATTTGCC
Positive 探針:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAGo
[0005]上述方案中，所述引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5’端帶生物素標志(biotin)的Tag引物，其堿基順序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3，。
[0006]上述方案中，所述大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX_Taq聚合酶(Polymerase)和5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA的堿基順序為biotin-5’ -CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
[0007]上述方案中，所述大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩沖液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB )顯色液。
[0008]上述方案中，所述預雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉(SDS)和10XDenhardt’ s 液，其中，SSC 為 0.75M 氯化鈉，0.075M 檸檬酸鈉，Denhardt’ s 液為 1%Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白(BSA);雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉(SDS)，5XDenhardt’ s液，50%重量百分比去離子甲酰胺和IOOug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液I為2XSSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉(SDS)，洗液2為0.5X SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉(SDS)，洗液 3 為 100 mM (毫摩爾 / 升)Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl，洗液 4 為 100mMTris-HCl, PH9.5,100 mMNaCl和100 mM MgCl2 ;封閉液為3%重量百分比牛血清白蛋白(BSA)7IOO mMTris-HCl, PH7.5,150 mMNaCl ;四甲基聯苯胺顯色液由四甲基聯苯胺顯色液A液和四甲基聯苯胺顯色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基聯苯胺顯色液A液為200mM檸檬酸鈉，PH5.4,0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液為3%重量百分比的H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液。
[0009]上述方案中，所述支持膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
[0010]本發明的大豆轉基因檢測試劑盒采用多重PCR擴增的方法擴增目標序列。多重PCR擴增技術原理是將多對引物放到同一個反應管中進行PCR擴增，達到同時擴增2種或兩種以上目標DNA序列的目的。試劑盒采用了 7重PCR擴增體系擴增目標序列，包括五種常見轉基因序列？&18&1'、(>7認13、071054?5?5，一個外源啟動子序列P35S和大豆內源基因序列 Lectin。
·[0011]本發明采用非對稱PCR擴增技術(asymmetric PCR)用以提高檢測靈敏度。非對稱PCR擴增技術原理是在PCR擴增過程中采用不等量的正向引物和反向引物(或是擴增延伸條件不同的正向引物和反向引物)，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA，該單鏈DNA可以有效的和固定在支持膜上的探針雜交，從而提高檢測靈敏度。
[0012]本發明在多重PCR擴增同時進行非對稱PCR擴增，采用的技術方案是在多重PCR反向引物的5’端添加5’端帶生物素標志的Tag序列，同時在PCR反應體系中添加過量的5’端帶生物素標志的Tag引物，Tag引物的喊基順序與上述Tag序列的喊基順序相同，該Tag引物Tm值(解鏈溫度)比多重PCR正向引物Tm值高l(Tl5°C，用于非對稱PCR階段擴增單鏈DNA。在整個PCR擴增過程中，首先采用低退火溫度(55飛(TC )進行多重PCR反應，其擴增產物主要是雙鏈DNA，之后提高退火溫度(65飛8°C)，使正向引物不能結合到模板上，只有Tag引物和反向引物可以結合到模板上并延伸擴增，從而產生大量5’端帶生物素標志的單鏈DNA，該單鏈DNA用于接下來的膜芯片雜交檢測。
[0013]本發明采用基于反向斑點雜交的可視化膜芯片技術進行轉基因的分子雜交檢測，其工作原理是首先將針對各個轉基因序列的單鏈探針按順序排列固定于支持膜表面的特定區域，再將待測的多重PCR產物與其雜交，這樣PCR產物中的轉基因序列單鏈DNA就會和支持膜上的探針雜交，經洗滌去除未結合的DNA樣品，由于待測PCR產物的DNA上帶有生物素標志，結合了待測DNA的探針點就偶聯上了生物素標志物，再經過相應的顯色反應就能讀取對應的雜交信號，這樣一張膜芯片上就可以同時檢測多個轉基因目標序列。
[0014]本發明提供一種多指標檢測大豆轉基因的可視化膜芯片試劑盒，其中待檢測的目標序列包括常見的大豆的轉基因序列Pat、Bar、CryIAb> Cryl05、EPSPS、外源啟動子序列P35S和大豆內源基因Lectin。通過該試劑盒的檢測，可以快速準確的判斷待檢大豆產品中是否含有上述轉基因序列，適合于轉基因大豆產品的大規模篩查。
[0015]本發明的有益效果是:1)操作簡單，經過一次樣本前處理，單管PCR擴增，單芯片雜交就可以同步檢測樣本中多種轉基因序列，具有平行分析和多重判斷的特點；2)檢驗對象完備，包含了當前常見的轉基因序列，并且可以很方便的加入新的檢測序列；3)系統在多重PCR擴增過程同時進行了非對稱PCR擴增，提高了系統的靈敏度和準確性；4)試劑盒采用了可視化膜芯片的檢測方式，提高了系統的檢測通量，并且檢測結果可以直接用肉眼判斷，方便，快捷；5)試劑盒操作簡單，經濟，無需特殊的昂貴儀器，適用于轉基因大豆的大規模檢測。
[0016]因此，本發明克服了現有技術費時費力成本高的缺陷，提供的大豆轉基因檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發明用于檢測轉基因大豆品系GTS40-3-2的雜交結果圖，其中圖1A為芯片結果模式圖，圖1B為轉基因大豆品系GTS40-3-2的檢測結果圖。
[0018]圖2為本發明用于檢測轉基因大豆品系A2704-12的雜交結果圖，其中圖2A為芯片結果模式圖，圖2B為轉基因大豆品系A2704-12的檢測結果圖。
[0019]圖3為本發明用于檢測非轉基因大豆品系ZZH015的雜交結果圖，其中圖3A為芯片結果模式圖，圖3B為非轉基因大豆品系ZZH015的檢測結果圖。
[0020]附圖中，Pat:草丁膦乙酰CoA轉移酶，Bar:草丁膦乙酰轉移酶基因，CrylAb:蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白crylA(b)基因，Cryl05:蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白cryl05基因，EPSPS:莽草酸羥基乙酰轉移酶，P35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子，Lectin:大豆凝集素基因，Positive:陽性對照，Barcode:膜芯片條碼。
具體實施例
[0021]下面結合附圖及實施例進一步詳述本發明，但本發明不僅限于所述實施例。
[0022]實施例一
本例的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，引物組合為7重PCR引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下:
Pat:正向引物:TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物:GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar:正向引物:GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物:GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
Cry I Ab:正向引物:CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物:CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cryl05:正向引物:ACTCGATCAGGTACAATGCCA反向引物:GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS:正向引物:GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物:TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S:正向引物:AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物:GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Lectin:正向引物:CAGCAATATCCTCTCCGATGTG
反向引物:AGGATCAATGTTACTGCTAGCGTG ；
膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列和一組陽性對照(Positive)探針序列，7組探針序列和陽性對照探針序列的堿基序列5’ -3’如下:
Pat 探針:GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT GTGGCTGGTATTGCTT
Bar 探針:ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC TACATCGAGACAAGCAC
CrylAb 探針:GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT TTGGTCCATCTCAATG
Cryl05 探針:GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS 探針:ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S 探針:CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT GACGCACAATCCCAC
Lectin 探針:CTCGACATACCTGGGGAATCGCATGACGTGCTTTCTTGGTC TTTTGCTTCCAATTTGCC
Positive 探針:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC GAGTGTCCAAAGTACCAGo
[0023]支持膜為硝酸纖維素膜。
[0024]通過相應的多重PCR引物設計，采用固相亞磷酰胺三酯法合成得到上述7重PCR組合引物。根據多重PCR擴增產物設計檢測探針，采用固相亞磷酰胺三酯法合成探針，探針合成時同時合成陽性探針(positive probe)和對應的5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸(positive oligo)單鏈DNA, 5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA的堿基順序為biotin-5’-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCAC
TGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3，。
[0025]將支持膜裁成1.2cmX 1.8cm的膜條，裁好的膜于雙蒸水中浸泡15min,再用15 X SSC浸泡15min，取出，置于濾紙上，60°C烘1.5 hour，膜條降溫到室溫后，將探針(5uM)順序點在膜上，每個探針重復點樣兩次，以驗證檢測結果的可重復性，點樣樣式見圖1A，膜條晾干后80°C烘2小時以固定探針，處理好的膜芯片室溫保存。
[0026]按照北京康為世紀生物科技有限公司新型植物基因組DNA提取試劑盒(NuCleanPlantGen DNA Kit, CW0531)的說明提取轉基因大豆品系GTS40-3-2的大豆基因組DNA，每30mg初始樣本經抽提后用50ul ddH20 (雙蒸水)溶解基因組DNA，并用紫外分光光度計將DNA溶液稀釋至同一質量濃度(50ng/ul)。
[0027]PCR擴增的反應體系如下所示: ddH20: 50ul
10XPCR Buffer: 5ul
dNTP (2.5mM each): 5ul
PCR 引物(20 μ M): 0.5ul each
EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul): 0.5ul
提取的大豆基因組DNA (約50ng/ul): 2ul
對上述反應體系進行PCR循環擴增，PCR循環條件如下所示，反應過程由預變性、多重PCR循環組成，條件分別為:
預變性:溫度95°C，時間10分鐘。
[0028]多重PCR循環:30個循環組成:
變性:溫度95°C，時間45秒。
[0029]退火:溫度55 °C，時間30秒。
[0030]延伸:溫度72 °C，時間30秒。
·[0031]最后延伸:溫度72°C，時間10分鐘。
[0032]然后進行膜芯片斑點雜交檢測，膜條于42°C預雜交液(5XSSC，0.1% SDS’10XDenhardt’ S)中預雜交I小時，之后將膜條放于2ml雜交液(5XSSC，0.1% SDS,5 XDenhardt’s，50% 去離子甲酰胺，100ug/ml 酵母 tRNA)中 42°C，I 小時。取 40ul 多重 PCR產物加入Iul陽性寡核苷酸單鏈DNA(IOuM)，10(TC水浴變性5分鐘后置于冰上，之后加入2ml 雜交液中，42°C雜交 16 小時。洗液 1(2XSSC，0.1% SDS)、洗液 2(0.5XSSC，0.1% SDS)42°C各洗膜條兩次，每次10分鐘。將膜條置于封閉液(3%BSA，100 mMTris-HCl, PH7.5，150mMNaCl)中37°C封閉30分鐘，之后將膜條放到酶聯液(用封閉液1:5000稀釋鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶)中37°C，30分鐘。用洗液3 (100 mM Tris-HCl, PH7.5，150 mMNaCl)、洗液 4 (100 mM Tris-HCl，PH9.5，100 mMNaCl, 100 mMMgCl2)各漂洗膜條 3 次，每次 5 分鐘，之后將膜條放入TMB顯色液(IOOmM檸檬酸鈉PH5.4，0.lmg/ml四甲基聯苯胺TMB，1:1600體積比的H202 (3%))中，避光顯色10-15分鐘，依照雜交點的顯色情況判定結果。
[0033]本例中所用輔料和配液為外購或自配，百分比為重量百分比。
[0034]實施例二
本例的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5’端帶生物素標志(biotin)的Tag引物，其堿基順序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3，。
[0035]支持膜為尼龍膜。
[0036]PCR擴增的反應體系如下所示: ddH20: 50ul
10XPCR Buffer: 5ul dNTP (2.5mM each): 5ul PCR 引物(20 μ M): 0.5ul each Tag primer (20 μ M): 3.5ulEX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul): 0.5ul
提取的大豆基因組DNA (約50ng/ul): 2ul
對上述反應體系進行PCR循環擴增，PCR循環條件如下所示，反應過程由預變性、多重PCR循環I和非對稱PCR循環2組成，條件分別為:
預變性:溫度95°C，時間10分鐘。
[0037]多重PCR循環1:30個循環組成:
變性:溫度95°C，時間45秒。
[0038]退火:溫度55 °C，時間30秒。
[0039]延伸:溫度72 °C，時間30秒。
[0040]非對稱PCR循環2:25個循環組成:
變性:溫度95°C，時間45秒。
[0041 ] 退火:溫度65 °C，時間30秒。
[0042]延伸:溫度72 °C，時間30秒。
[0043]最后延伸:溫度72°C，時間10分鐘。
[0044]檢測結果如圖1B所示。
[0045]其余同實施例一。
[0046]實施例三
本例的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA的堿基順序為biotin-5’ -CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3，。
[0047]提取的大豆基因組DNA為轉基因大豆品系A2704-12，檢測結果如圖2B所示。
[0048] 其余同實施例二。
[0049]實施例四
本例的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩沖液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB)顯色液。
[0050]提取的大豆基因組DNA為非轉基因大豆品系ZZH015，檢測結果如圖3B所示。
[0051]其余同實施例二。
[0052]實施例五
本例的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩沖液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB)顯色液，其中，預雜交液為5XSSC,0.1% SDS和10XDenhardtJ s ;雜交液為5XSSC,0.1% SDS，5XDenhardt’ S，50%去離子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液I:2 X SSC 和 0.1% 505，洗液2:0.5父55(:和0.1% 505，洗液3:100 mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl，洗液4:100 mM Tris-HCl, PH9.5,100 mM NaCl 和 100 mM MgCl2 ;封閉液為 3% BSA,100 mM Tris-HCl，PH7.5，150 mM NaCl ;四甲基聯苯胺顯色液分別為四甲基聯苯胺顯色液A液:200mM檸檬酸鈉PH5.4，0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液:3% H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液，使用前A液B液等量混合配成四甲基聯苯胺顯色液。[0053]支持膜為硝酸纖維素膜。
[0054]提取的大豆基因組DNA為轉基因大豆品系GTS40-3-2，檢測結果如圖1B所示。
[0055]其余同實施例二。
[0056]實施例六
本例的大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，其中，多重PCR擴增試劑一管600ul，每48ul試劑可檢測一個DNA樣本，每48ul擴增體系構成如下:10XPCR Buffer(Takara) 5ul，dNTP (2.5mM each) 5ul，7 對多重 PCR 引物(20 μ Μ) 0.5uleach, Tag primer(20 μ M) 3.5ul, EX-Taq Polymerase(Takara, 5U/ul) 0.5ul,ddH20加至48ul。每一樣本檢測需要吸取48ul擴增試劑，加入2ul待檢測基因組DNA (約50ng/ul) ο
[0057]陽性寡核苷酸單鏈DNA(IOuM) —管15ul。
[0058]預雜交液(5XSSC，0.1% SDS，lOXDenhardt’s)—瓶 30ml。雜交液(5XSSC,0.1%SDS, 5 XDenhardt’ s, 50% 去離子甲酸胺，100ug/ml 酵母 tRNA) 一瓶 30ml。
[0059]洗液I (2X SSC, 0.1% SDS) 10 倍濃縮液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。洗液2 (0.5XSSC, 0.1% SDS) 10 倍濃縮液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。
[0060]封閉液/ 酶聯液(3%BSA，100 mM Tris-HCl, PH7.5，150 mMNaCl) 一瓶 60ml。鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶(lmg/ml) —管5ul，使用前用封閉液1:5000稀釋成酶聯液。
[0061]洗液3 (100 mM Tris-HCl, PH7.5，150 mMNaCl) 10 倍濃縮液一瓶 18ml，使用前加162ml ddH20。洗液 4 (100 mM Tris-HCl, PH9.5,100 mMNaCl, 100 mM MgCl2) 10 倍濃縮液一瓶 18ml，使用前加 162ml ddH20`。
[0062]TMB顯色液A液(200mM檸檬酸鈉PH5.4，0.2mg/ml四甲基聯苯胺TMB)—瓶15ml。TMB顯色液B液(1:800體積比的H2O2 (3%)) 一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB顯色液。
[0063]提取的大豆基因組DNA為轉基因大豆品系A2704-12，檢測結果如圖2B所示。
[0064]其余同實施例五。
【權利要求】
1.一種大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重聚合酶鏈式反應(PCR)引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下: Pat:正向引物:TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT 反向引物:GGCCCAGCGTAAGCAATACC Bar:正向引物:GGGGATCTACCATGAGCCCA 反向引物:GGCTCGGTACGGAAGTTGAC CrylAb:正向引物:CGACATCTCCTTGTCCTTGAC 反向引物:CTCAATTTGCACCAGGAATGC Cryl05:正向引物:ACTCGATCAGGTACAATGCCA 反向引物:GCATCTGTTAGGCTCTCCAC EPSPS:正向引物:GCGCGATCATACGGAAAAGAT 反向引物:TCGATGACTTGGCCGGTGAG P35S:正向引物:AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA 反向引物:GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG Lectin:正向引物:CAGC·AATATCCTCTCCGATGTG 反向引物:AGGATCAATGTTACTGCTAGCGTG ； 膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列和一組陽性對照(Positive)探針序列，7組探針序列和陽性對照探針序列的堿基序列5’ -3’如下: Pat 探針:GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT GTGGCTGGTATTGCTT Bar 探針:ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC TACATCGAGACAAGCAC CrylAb 探針:GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT TTGGTCCATCTCAATG Cryl05 探針:GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC TGCCCAATCTCCCATTG EPSPS 探針:ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC GCCTGGAAGGCCGCGGC P35S 探針:CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT GACGCACAATCCCAC Lectin 探針:CTCGACATACCTGGGGAATCGCATGACGTGCTTTCTTGGTC TTTTGCTTCCAATTTGCC Positive 探針:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC GAGTGTCCAAAGTACCAGo
2.根據權利要求1所述的大豆轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5’端帶生物素標志(biotin)的Tag引物，其堿基順序如下所示: Tag 引物:biotin-5，-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3，。
3.根據權利要求1或2所述的大豆轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA的堿基順序為biotin-5’ -CTGGTACTTTGGAC
ACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3，。
4.根據權利要求3所述的大豆轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述大豆轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為IOXPCR緩沖液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB)顯色液。
5.根據權利要求4所述的大豆轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述預雜交液為5XSSC,0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉和10XDenhardtJ s液，其中，SSC為0.75M氯化鈉，0.075M檸檬酸鈉，DenhardtJ s液為1% Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt’ s，50%重量百分比去離子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液I為2 X SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，洗液2為0.5 X SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，洗液3為100 mM (毫摩爾/升)Tris-HCl, PH7.5，150 mMNaCl，洗液4為100 mMTris-HCl,PH9.5,100 mMNaCl和100 mM MgCl2 ;封閉液為3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mMTris-HCl, PH7.5,150 mMNaCl ;四甲基聯苯胺顯色液由四甲基聯苯胺顯色液A液和四甲基聯苯胺顯色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基聯苯胺顯色液A液為200mM檸檬酸鈉，PH5.4,0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液為3%重量百分比的H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液。
6.根據權利要求1所述的大豆轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述支持膜為硝酸纖維素膜或尼 龍膜。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589782SQ201310271815
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】黃廣平, 王勇強, 秦子蘇 申請人:黃廣平