抗炎蛋白tipe2在制備治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了新型抗炎蛋白（免疫調(diào)控分子）TIPE2在制備治療動脈粥樣硬化性相關疾病的藥物中的應用。本發(fā)明還公開了一種表達TIPE2的重組腺病毒。本發(fā)明利用TIPE2的重組腺病毒實現(xiàn)在ApoE-/-小鼠體內(nèi)高效穩(wěn)定持續(xù)表達TIPE2抗炎蛋白，發(fā)揮抑制動脈粥樣斑塊的形成作用，對以動脈粥樣硬化為病理學基礎的急性冠脈綜合征、心絞痛、腦中風、血栓形成、血管閉塞、腦缺血等疾病起到有效的預防與治療作用，有效改善患者的生存質(zhì)量及疾病預后，為臨床上有效防治動脈粥樣硬化的形成及相關性疾病開辟了一條前景非常廣闊的新途徑，同時為以動脈粥樣硬化斑塊形成為病理學基礎的相關疾病的新藥開發(fā)提供了新的方向及依據(jù)。
【專利說明】抗炎蛋白TIPE2在制備治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用 【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高表達新型抗炎蛋白TIPE2的重組腺病毒及其應用，特別是涉及TIPE2作為新型的防治動脈粥樣硬化治療藥物的應用。
【背景技術】
[0002] 急性心肌梗死、心源性粹死等急性冠脈綜合癥(acute coronary syndromes, ACS)是嚴重危害人類生命健康的世界性疾病，且發(fā)病率逐年增高，其病理生理基礎是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊的形成與破裂。動脈粥樣硬化是一種病因復雜、病變發(fā)展緩慢、以局部或全身性炎癥和免疫反應為特點的慢性疾病。包括單核/巨噬細胞、淋巴細胞、平滑肌細胞等在內(nèi)的大量與免疫相關的細胞參與并形成了一系列免疫反應機制，破壞了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，導致動脈粥樣硬化的發(fā)生【參見:1.[Peter Libby, Paul M.Ridkerand Attilio Maser1.1nflammation and Atherosclerosis.Circulation.2002;105:1135-1143.2.Guido Stoll and Martin Bendszus.1nflammation and Atherosclerosis:NovelInsights Into Plaque Formation and Destabilization.Stroke.2006;37:1923-1932.3.Goran K.Hansson.1nflammation，Atherosclerosis, and Coronary Artery Disease.NEngl J Med.2005;352:1685-1695.】。因而目前研究認為，炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化的整個病變過程，包括動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展及破裂【參見LibbyP，OkamotoYj RochaVZj Folco E.1nflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice.Circulation Journal.2010;74 (2):213 - 220.van Leuven SI，F(xiàn)ranssen R，KasteleinJJj Levi M，Stroes ESGj Tak PP.Systemic inflammation as a risk factor foratherothrombosis.Rheumatology.2008; 47 (I): 3 - 7.】。針對免疫反應的抗炎策略是防治動脈硬化形成與發(fā)展、干預疾病轉(zhuǎn)歸的有效方案。
[0003]TIPE2，即腫瘤壞死因子 α 誘導蛋白 8-2 (Tumor Necrosis Factor- a InducedProtein-8-like 2，TNFAIP8L-2)，2002 年從實驗性自身免疫腦脊髓炎(ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis, EAE)小鼠模型的異常表達基因中篩選而出，并由本申請發(fā)明人所在課題組主要研究人員、以及長期合作伙伴賓西法尼亞大學的陳有海教授實驗室于2008年研究鑒定其為新型免疫負調(diào)控分子【1.Carmodyj R.J.，etal.Genomic scaleprofiling of autoimmune inflammation in the central nervous system:the nervousresponse to inf lammation[J].J Neuroimmuno1.2002，133 (1-2):95-107.2.Sun, H.，eta1.TIPE2，a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintainsimmune homeostasis [J].Cell.2008，133(3):415-26.】。研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2 屬于腫瘤壞死因子 α 誘導蛋白 8 (Tumor necrosis factor- a -1nduced protein-8，TNFAIP8，ΤΙΡΕ)家族，選擇性表達于胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等淋巴組織及炎癥組織，及具有分泌功能的組織細胞、泌尿生殖細胞等【參見:Zhang，G.，et al.Tissue-specific expression of TIPE2 providesinsights into its function [J].Mol Immunol.2010，47 (15): 2435-42.】。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2 通過抑制 MAPK (Mitogen-activated protein kinase)和 NF-κ B (Nuclearfactor-kappa B)信號通路的活化發(fā)揮負性調(diào)控固有免疫和適應性免疫，是一個新型的抗炎蛋白[參見:Sun, H.，et al.TIPE2, a negative regulator of innate and adaptiveimmunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008，133(3):415-26.】。TIPE2基因缺失在小鼠表現(xiàn)為漸進性多器官炎癥【參見:Sun，H.，et al.TIPE2, a negativeregulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008, 133(3):415-26.】，在人類組織細胞內(nèi)的表達異常與乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染、自身免疫性疾病有關【參見1:Xi，W.，et al.Roles of TIPE2 in Hepatitis BVirus-1nduced Hepatic Inflammation in Humans and Mice.Mol Immunol, 2011;48 (9-10):1203-1208.2:LiD.，et al.Down-regulation of TIPE2 mRNA expression in peripheralblood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus.Clinical Immunology 2009;133:422-427.】。本發(fā)明以炎癥為切入點，以動物模型、細胞模型系統(tǒng)地研究了 TIPE2在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用與機制，發(fā)現(xiàn)TIPE2通過抑制巨噬細胞介導的炎癥反應發(fā)揮抗動脈粥樣斑塊形成作用，繼而采用高表達TIPE2的重組腺病毒研究了 TIPE2對動脈斑塊形成的治療作用。 [0004]腺病毒載體應用于基因治療的載體，具有明顯的優(yōu)越性:宿主范圍廣，不整合到宿主基因組中，無插入突變，只感染分裂期細胞，對人的安全性高；能進行有效增殖，體外擴增可以獲得高滴度的重組病毒，是目前基因治療的最佳工具。本發(fā)明經(jīng)過研究證實，炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展與破裂的整個過程，而TIPE2作為一種新型抗炎蛋白，具有抑制動脈粥樣斑塊形成的作用，因此本研究利用重組腺病毒實現(xiàn)TIPE2蛋白在體內(nèi)的持續(xù)高表達表達，從而發(fā)揮抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)有技術，針對炎癥反應在動脈粥樣硬化形成中的重要作用，本發(fā)明要解決的主要問題是提供一種能夠有效抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的重組腺病毒介導的TIPE2抗炎蛋白，并且進一步提供了該抗炎蛋白作為有效防治動脈粥樣硬化斑塊形成的治療藥物的應用。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0007]免疫負調(diào)控分子(抗炎蛋白)TIPE2,即TNFAIP8L2 (tumor necrosis factoralpha-1nduced protein 8_like2, GeneID:69769),其 CDS 序列[NM-027206]如下所不:
[0008]Atggctggtcggtccgtggcgcatctctttatcgacgagaccagcagcgaggtgctagacgagctttaccgcgtgtccaaagaatacacgcacagccggcccaaggcacagcgggtgatcaaagacctcatcaaggtagcggttaaagtggctgtgctgcaccgcagtggctgctttggccctggggagctggctctggctacacgatttcgtcagaagctacggcagggcgccatgaccgcacttagcttcggtgaggtggacttcacctttgaggctgccgtgctagcaggtctgctcgtcgagtgccgggacattctgctggagctggtggagcaccacctcacacccaagtcacatgaccgcatcaggcacgtgtttgatcactactctgaccccgacctgctggctgccctctatgggcctgacttcactcagcaccttggcaagatctgtgatgggctccggaagctgctggacgagggcaagctctga,如序列表中序列 I 所示。
[0009]本發(fā)明所述的TIPE2基因編碼翻譯的氨基酸序列[NP-081482]如下:
[0010]MesfsskslalqaekkllskmagrsvahlfidetssevldelyrvskeythsrpkaqrvikdlikvavkvavlhrsgcfgpgeIalatrfrqklrqgamtalsfgevdftfeaavlaglIvecrdi IIelvehhltpkshdrirhvfdhysdpdllaalygpdftqhlgkicdglrklIdegkl,如序列表中序列 2 所不。
[0011]構(gòu)建TIPE2重組腺病毒的詳細描述:
[0012]根據(jù)GeneID:69769提供的基因序列設計引物，PCR擴增TIPE2全長cDNA，兩端設計BamHI和XhoI酶切位點，回收載體和目的片段，酶連獲得pRK5_TIPE2質(zhì)粒，測序證實連接正確(測序結(jié)果圖2)。
[0013]BamHI 和 XhoI 雙酶切 pRK5_TIPE2 質(zhì)粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭質(zhì)粒(該質(zhì)粒是現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)質(zhì)粒)，回收TIPE2目的片段及穿梭載體，酶連獲得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒；之后用限制性內(nèi)切酶1-Ceu I和1-Sce I雙酶切pADxsi骨架質(zhì)粒(該質(zhì)粒是現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)質(zhì)粒)與pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒，并將目的片段與PADxsi酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5CI進行細菌內(nèi)同源重組，篩選后的陽性克隆大量擴增獲得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重組腺病毒質(zhì)粒。
[0014]PacI酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒后，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染覆蓋率80%左右的包裝細胞HEK293細胞，3-5d后，出現(xiàn)明顯噬斑。待大約90%的細胞出現(xiàn)細胞病變時，收集細胞，反復凍融3次后離心收集上清，繼續(xù)感染HEK293細胞，擴增病毒，收集病毒液純化后于液氮保存。TCID 50法測定病毒滴度【參見=Vedtofte L，Bodvarsdottir T B, Karlsen A E, et al.Developmental biology of the Psammomysobesus pancreas: cloning and expression of the Neurogenin-3 gene [J].JHistochemCytochem，2007，55(l):97 — 104.】。
[0015]上述TIPE2重組腺病毒具有雙CMV啟動子，可同時獨立高效表達TIPE2蛋白和GFP,既可以通過檢測GFP熒光強度評判TIPE2的表達情況及觀察療效，又不影響TIPE2蛋白的生物學活性。
[0016]動物實驗表明，上述高表達TIPE2蛋白的重組腺病毒能夠有效抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成并對動脈粥樣硬化起到有效治療作用。因此，免疫調(diào)控分子TIPE2有望開發(fā)為防治動脈粥樣硬化斑塊形成并在斑塊形成后發(fā)揮治療作用的新藥物。
[0017]上述高表達TIPE2蛋白的重組腺病毒作為其它以動脈粥樣硬化斑塊形成為病理學基礎的心腦血管疾病的預防和治療性藥物應用，如急性冠脈綜合征、心絞痛、腦中風、血栓形成、血管閉塞、腦缺血等疾病。
[0018]進一步地，本發(fā)明推廣到TIPE2蛋白、由TIPE2衍生的肽等一切與TIPE2相關的產(chǎn)物在上述所述疾病中的應用。
[0019]藥理實驗及結(jié)果證明:
[0020]實驗用小鼠為SPF級ApoE+，8-10周齡，體重18_22g，飼養(yǎng)環(huán)境嚴格按照SPF級執(zhí)行。
[0021]治療實驗方案1.TIPE2預防ApoE+小鼠模型動脈粥樣斑塊形成的實驗
[0022]8-10周齡的ApoE+先高脂喂養(yǎng)I周后，隨機分為實驗組和對照組:實驗組每只小鼠尾靜脈注射I X IO9Pfu重組TIPE2腺病毒，對照組則注射表達GPF的對照腺病毒，每間隔2周重復一次給藥，連續(xù)給藥4次，整個過程中均高脂喂養(yǎng)，即高脂喂養(yǎng)9周后，過量戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，灌洗固定后分離主動脈 根部及腹主動脈。主動脈根部用于制作5 μ m冰凍切片進行HE染色、油紅O染色，腹主動脈用于大體油紅O染色，以檢測TIPE2對動脈粥樣斑塊形成的抑制作用。[0023]治療實驗方案2.TIPE2重組腺病毒對已形成的ApoE+小鼠動脈粥樣斑塊的抑制作用
[0024]8-10周齡的ApoE+先高脂喂養(yǎng)I周后，0.8%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取仰臥位固定小鼠四肢及頭部，碘伏消毒后頸正中矢狀切口，小心分離頜下腺，暴露出左側(cè)頸動脈。用玻璃針小心分離附著其上的迷走神經(jīng)，之后取左側(cè)頸動脈外放置外鞘管(外鞘管以硅膠管為原料，置于75%酒精中消毒滅菌，內(nèi)徑0.30mm，長約3mm)，手術線扎住防止外鞘管脫落。頜下腺復位后縫合切口。小鼠于SPF級環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)，并持續(xù)高脂喂養(yǎng)。
[0025]構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成模型6周(高脂喂養(yǎng)第7周)后，將小鼠隨機分為實驗組和對照組:向?qū)嶒灲M小鼠尾靜脈注射I X IO9Pfu的TIPE2重組腺病毒，對照組則注射表達GPF的對照腺病毒，并在2周后(高脂喂養(yǎng)第9周)加強給藥一次，高脂喂養(yǎng)第10周處理小鼠取材:過量戊巴比妥鈉處死小鼠，灌洗固定后分離左側(cè)頸動脈、主動脈根部及腹主動脈。頸動脈及主動脈根部制作5 μπι冰凍切片進行HE染色、油紅O染色，腹主動脈進行大體油紅O染色以檢測ΤΙΡΕ2對動脈粥樣硬化的治療效果。
[0026]利用本發(fā)明所述的高表達ΤΙΡΕ2的重組腺病毒及治療實驗方案I的結(jié)果表明:本發(fā)明所述的ΤΙΡΕ2重組腺病毒可以在小鼠體內(nèi)高表達(見圖7，圖13)，并能有效抑制ApoE+小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成，延緩脂質(zhì)在主動脈根部、主動脈弓、腹主動脈的堆積，即對斑塊的形成有很好的預防效果；治療實驗方案2的結(jié)果表明:本發(fā)明所述的ΤΙΡΕ2重組腺病毒不僅可以有效預防斑塊的形成，而且能夠有效抑制已形成的粥樣斑塊的進一步發(fā)展，從而抑制血管閉塞及動脈粥樣硬化的進一步惡化。因此，抗炎蛋白ΤΙΡΕ2將在制備防治臨床上抑制并治療動脈粥樣硬化的藥物中有重大的應用價值，具有極其廣闊的開發(fā)應用前景。
[0027]本發(fā)明利用ΤΙΡΕ2的重組腺病毒實現(xiàn)體內(nèi)持續(xù)高表達ΤΙΡΕ2抗炎蛋白，發(fā)揮抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的作用(圖4-圖9)，同時對已形成的粥樣斑塊起到有效治療作用(圖10-圖17)。本發(fā)明為 臨床上有效防治動脈粥樣硬化相關疾病開辟了一條前景非常廣闊的新途徑，為新型藥物的開發(fā)奠定了良好的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:質(zhì)粒pRK5的物理圖譜。
[0029]圖2:小鼠TIPE2基因pRK5表達載體測序圖譜，箭頭所指為TIPE2序列。
[0030]圖3:實驗技術路線圖。
[0031]圖4:治療實驗方案I主動脈根部HE染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0032]圖5:治療實驗方案I主動脈根部斑塊大小統(tǒng)計結(jié)果分析。
[0033]圖6:治療實驗方案I主動脈根部油紅O染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0034]圖7:治療實驗方案I主動脈根部自發(fā)熒光示TIPE2或GFP的表達，其中A為對照組GFP的表達，B為TIPE2治療組。
[0035]圖8:治療實驗方案I主動脈弓、腹主動脈大體油紅O染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。[0036]圖9:治療實驗方案I主動脈弓、腹主動脈大體油紅O染色結(jié)果統(tǒng)計分析。
[0037]圖10:治療實驗方案2主動脈根部HE染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0038]圖11:治療實驗方案2主動脈根部斑塊大小統(tǒng)計結(jié)果分析。
[0039]圖12:治療實驗方案2主動脈根部油紅O染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0040]圖13:治療實驗方案2主動脈根部自發(fā)熒光示TIPE2或GFP的表達，其中A為對照組，B為TIPE2治療組。
[0041]圖14:治療實驗方案2主動脈弓、腹主動脈大體油紅O染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0042]圖15:治療實驗方案2主動脈弓、腹主動脈大體油紅O染色結(jié)果統(tǒng)計分析
[0043]圖16:治療實驗方案2頸動脈HE染色結(jié)果，其中A為對照組斑塊，B為TIPE2治療后的斑塊。
[0044]圖17:治療實驗方案2頸動脈自發(fā)熒光情況，其中A為對照組，B為TIPE2治療組。【具體實施方式】
[0045]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0046]實施例1:小鼠TIPE2基因pRK5表達載體構(gòu)建
[0047](I)小鼠TIPE2基因CDS區(qū)獲取
[0048]PCR引物設計:
[0049]根據(jù)引物設計原則，設計了小鼠TIPE2基因CDS區(qū)擴增引物，并分別在引物上下游分別加上BamHl及Xhol的酶切位點，以方便后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建。另外，在上游引物酶切位點與起始密碼子ATG之間添加利于轉(zhuǎn)錄的Kozak’ s序列。具體引物序列如下:
[0050]mTIPE2BamHlF:5’ -ATTATTGGATCCGCCACCATGGAGTCCTTCAGCTCAAAGA-3’ ；
[0051]mTIPE2XholR: 5’ -ATTATTCTCGAGTCAGAGCTTGCCCTCGTCCAGC-3’ ；如序列表中序列 3、4所示。
[0052](2)小鼠TIPE2基因CDS區(qū)序列擴增
[0053]用2 X TaqPCRMix產(chǎn)品，以逆轉(zhuǎn)錄自C57BL/6J小鼠腹腔巨噬細胞總RNA的cDNA為模板，采用PCR擴增法獲取小鼠TIPE2基因⑶S區(qū)片段，反應體系為50 μ L，如表1所示。
[0054]表1
[0055]
【權(quán)利要求】
1.抗炎蛋白TIPE2在制備治療動脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:所述動脈粥樣硬化性疾病是以動脈粥樣硬化斑塊形成為病理學基礎的心腦血管疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述動脈粥樣硬化性疾病包括急性冠脈綜合征、心絞痛、腦中風、血栓形成、血管閉塞、腦缺血等疾病。
4.一種表達TIPE2的重組腺病毒，其特征在于:是通過以下制備方法得到的: BamH I and Xho I 雙酶切 pRK5_TIPE2 質(zhì)粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭質(zhì)粒，回收TIPE2目的片段及穿梭載體，酶連獲得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒；之后用限制性內(nèi)切酶1-Ceu I和1-Sce I雙酶切pADxsi骨架質(zhì)粒與pShuttle-GFP-CMV_TIPE2質(zhì)粒，并將目的片段與PADxsi酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α進行細菌內(nèi)同源重組，篩選后的陽性克隆大量擴增獲得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重組腺病毒質(zhì)粒； Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染覆蓋率80%的包裝細胞HEK293細胞，3-5d后，出現(xiàn)明顯噬斑；待90%的細胞出現(xiàn)細胞病變時，收集細胞上清，反復凍融3次以后離心收集上清，繼續(xù)感染HEK293細胞，擴增病毒，收集病毒液純化后于液氮保存。
5.權(quán)利要求以4所述的表達TIPE2的重組腺病毒的制備方法，其特征在于:步驟如下: BamH I and Xho I 雙酶切 pRK5_TIPE2 質(zhì)粒及 pShuttle_GFP_CMV 穿梭質(zhì)粒，回收TIPE2目的片段及穿梭載體，酶連獲得pShuttle-GFP-CMV-TIPE2質(zhì)粒；之后用限制性內(nèi)切酶1-Ceu I和1-Sce I雙酶切pADxsi骨架質(zhì)粒與pShuttle-GFP-CMV_TIPE2質(zhì)粒，并將目的片段與PADxsi酶連，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α進行細菌內(nèi)同源重組，篩選后的陽性克隆大量擴增獲得pADxs1-GFP-CMV-TIPE2重組腺病毒質(zhì)粒； Pac I酶切線性化重組腺病毒 質(zhì)粒后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染覆蓋率80%的包裝細胞HEK 293細胞，3-5d后，出現(xiàn)明顯噬斑；待90%的細胞出現(xiàn)細胞病變時，收集細胞上清，反復凍融3次以后離心收集上清，繼續(xù)感染HEK 293細胞，擴增病毒，收集病毒液純化后于液氮保存。
6.權(quán)利要求以4所述的表達TIPE2的重組腺病毒在制備預防動脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應用。
7.權(quán)利要求以4所述的表達TIPE2的重組腺病毒在制備治療動脈粥樣硬化性疾病的藥物中的應用。
8.權(quán)利要求以4所述的表達TIPE2的重組腺病毒在制備防治心腦血管疾病的藥物中的應用。
9.以權(quán)利要求4所述的表達TIPE2的重組腺病毒為基礎的TIPE2蛋白、由TIPE2衍生出的一系列肽、基因產(chǎn)物在制備防治心腦血管疾病的藥物中的應用。
10.以權(quán)利要求4所述的表達TIPE2的重組腺病毒為基礎的TIPE2蛋白、由TIPE2衍生出的一系列肽、基因產(chǎn)物在制備治療以動脈粥樣硬化斑塊形成為病理學基礎的心腦血管疾病中的應用。
【文檔編號】C12N15/861GK103463620SQ201310317259
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】劉素俠, 邵潔, 章桂忠 申請人:山東大學