一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的試紙條按照連接順序依次包括樣品墊，膠體金墊，硝酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平臺(tái)使用的PVC底板，所述膠體金墊是由吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃纖維素膜組成，所述硝酸纖維素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗體包被的質(zhì)控線以及兔抗PEDV?S蛋白多克隆抗體包被的檢測(cè)線，其中，所述的抗PEDV單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC?C201392的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的試紙條，具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并且操作簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)技術(shù)人員特殊培訓(xùn)，無(wú)需特殊設(shè)備，檢測(cè)成本低，檢測(cè)快速，只需5～10分鐘即可讀取結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的的試劑，尤其涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的試紙條，本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性腹瀉病毒(PEDV)是豬流行性腹瀉(PED)的病原體。主要危害仔豬，患病哺乳仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉和嘔吐癥狀，新生仔豬感染后常發(fā)生嚴(yán)重失水和死亡，斷奶豬和育肥豬患病后出現(xiàn)4?6天水樣腹瀉，康復(fù)后生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，育肥后期體重出現(xiàn)減損。由于該病病程短，傳播快，致使該病在我國(guó)以及世界各國(guó)的傳播非常廣泛，每年都造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]豬流打性腹丨與病毒的王要結(jié)構(gòu)蛋白包括N蛋白、M蛋白、S蛋白、sM蛋白，其中S蛋白暴露于病毒粒子外表面，具有較高的保守性、特異性。目前檢測(cè)PEDV常用的方法主要包括:病毒分離鑒定法，免疫熒光檢測(cè)法，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)法，PCR檢測(cè)法等方法。
[0004]病毒分離鑒定法是通過(guò)流行病學(xué)、病變和癥狀可做初步判斷，進(jìn)一步確診需要實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)鑒定病毒，分離鑒定病毒一般可采用乳豬接種試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。該方法是目前較為通用的方法，其特點(diǎn)是準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，但是需要時(shí)間較長(zhǎng)，且結(jié)果誤差較大，人力物力花費(fèi)較大，不適應(yīng)實(shí)際應(yīng)用中快速檢測(cè)的需要。免疫熒光檢測(cè)，通過(guò)熒光素標(biāo)記二抗的結(jié)合，將信號(hào)進(jìn)行放大，通過(guò)熒光顯微鏡觀察鑒定，這在一定程度上提高了檢測(cè)的靈敏度，但是免疫熒光法中常因?yàn)闊晒饪贵w不夠穩(wěn)定，且判定主觀性較強(qiáng)，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，同時(shí)，該方法需要熒光顯微鏡等特殊設(shè)備，所以應(yīng)用時(shí)有許多局限性。ELISA法是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，是一種可以做定性或半定量檢測(cè)的快速檢測(cè)方法，已發(fā)展了間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA和阻斷ELISA等，雖然在一定程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間，但仍然需要專門(mén)的儀器(如酶標(biāo)儀)，操作過(guò)程仍較復(fù)雜。PCR檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)設(shè)計(jì)PEDV基因組上保守序列的引物，再通過(guò)PCR擴(kuò)增，進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)方法靈敏度高，結(jié)果可靠，但測(cè)定方法繁瑣、費(fèi)時(shí)，效率低、成本高，常受到樣品中糞便自身的成分和糞便中其他細(xì)菌、病毒干擾，需要有專門(mén)的檢測(cè)設(shè)備，同時(shí)操作人員需要經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，難以普及。
[0005]免疫層析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)易快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是以膠體金為標(biāo)記物的快速免疫結(jié)合試驗(yàn)，抗原、抗體在NC膜上進(jìn)行反應(yīng)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果直觀、無(wú)須儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，操作人員不需要進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)即可操作，減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條及其制備方法。[0007]為了達(dá)到所述的目的本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段:
[0008]本發(fā)明的一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條，如圖1所示，所述試紙條按照連接順序依次包括樣品墊，膠體金墊，硝酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平臺(tái)使用的PVC底板，所述硝酸纖維素膜與膠體金墊之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與吸水紙之間有搭接，所述膠體金墊是由吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃纖維素膜組成，所述硝酸纖維素膜上具有山羊抗鼠IgG包被的質(zhì)控線，以及兔抗PEDV S蛋白多克隆抗體包被的檢測(cè)線，樣品墊提供了待測(cè)樣品加入的位置。其中，所述的抗PEDV單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞命名為雜交瘤細(xì)胞株OT7，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心，其菌種保藏編號(hào)為:CCTCC C201392.，保藏日期為2013年7月6日。
[0009]在本發(fā)明中，通過(guò)雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法驗(yàn)證，表明:1.本發(fā)明的抗PEDV單克隆抗體具有較高的靈敏性，最小病毒檢出量約為10_5個(gè)TCID50，與RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度一致；2.該單克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性，通過(guò)對(duì)引起豬病毒性腹瀉的常見(jiàn)病原體豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，均為發(fā)生交叉反應(yīng)；3.該單克隆抗體具有較好的檢測(cè)穩(wěn)定性，通過(guò)比較相同批次和不同批次間的檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異不顯著；4.該單克隆抗體對(duì)不同地區(qū)的PEDV都可以較好的檢出，通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)三個(gè)不同地區(qū)的發(fā)病豬場(chǎng)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，因此可用于豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)。
[0010]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的PEDFV S蛋白多克隆抗體是通過(guò)以下方法制備:將純化的PEDV S蛋白，分別經(jīng)3次免疫家兔后采取抗血清。多克隆抗體經(jīng)辛酸-飽和硫酸按法粗提，再經(jīng)proteinA親和層析柱純化,經(jīng)測(cè)定抗體純度達(dá)到95%。
[0011]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體是通過(guò)以下方法制備:用純化的小鼠IgG免疫山羊，獲得高免血清后，純化得到山羊抗小鼠IgG多克隆抗體血清(山羊抗鼠二抗)。
[0012]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的質(zhì)控線是通過(guò)將山羊抗鼠IgG多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在硝酸纖維素膜上得到的；所述的檢測(cè)線是通過(guò)將兔抗PEDV S蛋白多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在在硝酸纖維素膜上得到的；檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔0.5cm。
[0013]進(jìn)一步的，優(yōu)選的，將包被后的硝酸纖維素膜于含1% (w/w)BSA,0.2% (v/v)Tween20、pH5.4 的 0.05mol/L Tris-HCl 溶液中室溫封閉 10_60min，再用 0.05moI/LNaH2PO3漂洗兩次后，4 °C干燥備用。
[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的膠體金墊是通過(guò)以下方法制備得到:
[0015](I)將所有玻璃器皿清洗干凈，然后浸泡在洗液中24h ;取出后用自來(lái)水沖洗8遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干后將玻璃容器浸泡于含有5% (w/v)的二氯二鉀硅烷的氯仿溶液中Imin，然后用去離子水沖洗，再干燥備用；
[0016]其中，所述的洗液按照以下方法制備:重鉻酸鉀lOOOg，濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml，混勻；
[0017](2)向步驟(I)處理后的玻璃器皿中加入0.01% (w/w)氯金酸溶液IOOmL,在磁力攪拌器上攪拌加熱，迅速加入2.5mLl% (w/w)檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱煮沸5-10min，溶液顏色逐漸由深藍(lán)色轉(zhuǎn)為橙紅色，色澤鮮艷，停止煮沸，并回流至體積為100ml，然后用電鏡鏡檢，制備的膠體金溶液的金顆粒大小一致，均勻，顆粒直徑為20nm，4°C密閉避光保存?zhèn)溆茫?br> [0018](3)用0.lmol/L的K2CO3將步驟(2)的膠體金溶液的pH值調(diào)至pH5.2，在避光條件下放到搖床上緩慢震蕩，取純化的抗PEDV單克隆抗體逐滴加入至終濃度為0.125mg/ml,繼續(xù)震蕩30min，靜置lOmin，加入BSA作為穩(wěn)定劑，使其終濃度達(dá)到1% (w/w)，再緩慢震蕩30min,得到金標(biāo)單抗溶液；
[0019](4)將金標(biāo)單抗溶液以4°C、2000r/min離心IOmin除去其中的膠體金聚合物,然后取上清，再以4°C, 12000r/min離心60min,可見(jiàn)離心物分為3層，上清液含有尚未結(jié)合的單抗，最下面的深黑色斑點(diǎn)即為尚未結(jié)合的膠體金顆粒聚合物，中間呈紫紅色的絮狀沉淀即為結(jié)合良好的金標(biāo)單抗復(fù)合物；
[0020](5)收集紫紅色絮狀沉淀，用與步驟(4)第一次離心后取得上清的相同體積的含1% (w/w) BSA 的 IOmmoI/L pH5.2PBS 懸浮，4°C避光保存?zhèn)溆茫?br> [0021](6)先將玻璃纖維膜浸泡在pH5.2含3%(w/w)BSA、0.1%(v/v)Tween_80 的0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4°C過(guò)夜干燥備用；按每條玻璃纖維膜的大小為0.7cm寬X7cm長(zhǎng)計(jì)算，將0.7ml膠體金探針均勻噴灑在玻璃纖維上，在室溫下烘干。
[0022]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的免疫膠體金試紙條在制備檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒試劑中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的試劑條可以直接采取發(fā)病豬的糞便作為檢測(cè)樣品，取少量糞便溶解在ImLl.00.1mol/mL PBS中，取50 y L溶液即可進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0024]結(jié)果判斷:陽(yáng)性結(jié)果，質(zhì)控線、檢測(cè)線均呈現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明有PEDV存在。陰性結(jié)果，檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色條帶，質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色條帶，說(shuō)明樣本中沒(méi)有PEDV存在。如果檢測(cè)線、質(zhì)控線均不出現(xiàn)紅色條帶或僅有檢測(cè)線出現(xiàn)紅色條帶，則說(shuō)明產(chǎn)品失效。
[0025]本發(fā)明與目前常見(jiàn)檢測(cè)方法比較具有下列優(yōu)點(diǎn):
[0026]本發(fā)明制備的抗PEDV單克隆抗體，經(jīng)特性試驗(yàn)表明，該單抗具有靈敏性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
[0027]本發(fā)明的檢測(cè)PEDV的免疫膠體金試紙條，具有特異性強(qiáng)，與常見(jiàn)引起豬腹瀉的病毒無(wú)反應(yīng)；穩(wěn)定性好，批次內(nèi)和批次間制備的膠體金試紙條都有很好的檢出效果。
[0028]本發(fā)明的免疫膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)單，克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法中對(duì)樣品進(jìn)行反復(fù)凍融，離心的復(fù)雜的前期處理工藝，對(duì)技術(shù)人員無(wú)需特殊培訓(xùn)，無(wú)需特殊設(shè)備要求檢測(cè)成本低。
[0029]本發(fā)明的免疫膠體金試紙條檢測(cè)快速，只需5?10分鐘即可讀取結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為試紙條正視圖及正面各區(qū)段說(shuō)明；
[0031]1.PVC底板、2.吸水紙、3.質(zhì)控線、4.檢測(cè)線、5.硝酸纖維素膜、6.膠體金墊、7.樣
品塾；
[0032]圖2為試紙條側(cè)視圖及各區(qū)段說(shuō)明；
[0033]1.PVC底板、2.吸水紙、3.質(zhì)控線、4.檢測(cè)線、5.硝酸纖維素膜、6.膠體金墊、7.樣
品塾；[0034]圖3為試紙條檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明；
[0035]圖4為利用本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)與PCR檢測(cè)方法靈敏度的比較結(jié)果；
[0036]A為利用本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行雙抗體夾心ELISA檢測(cè)的結(jié)果；B為RT-PCR對(duì)不同滴度病毒的檢測(cè)結(jié)果；
[0037]M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I:2倍稀釋，2:22倍稀釋，3:23倍稀釋，4:24倍稀釋，5:25倍稀釋，6:26倍稀釋，7:27倍稀釋，8:28倍稀釋，9:29倍稀釋
[0038]圖5為膠體金免疫層析試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果；
[0039]1.試紙條對(duì)TGEV檢測(cè)結(jié)果；2.試紙條對(duì)CRSV檢測(cè)結(jié)果；3.試紙條對(duì)PPV檢測(cè)結(jié)果;
[0040]圖6為膠體金試紙條重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果；
[0041]1、2分別兩個(gè)批次制備的膠體金試紙條分別對(duì)PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)；
[0042]圖7為雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果；
[0043]1.2.雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果3.4.雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)陰性樣品的檢測(cè)結(jié)果；
[0044]圖8為對(duì)應(yīng)于圖7的采用本發(fā)明的免疫膠體金試紙進(jìn)行檢測(cè)的符合度檢測(cè)結(jié)果。
[0045]1.免疫膠體金對(duì)陰性樣品的檢測(cè)結(jié)果；2.免疫膠體金對(duì)陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果。 【具體實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0047]實(shí)施例1PEDV S蛋白抗原制備
[0048]1、重組大腸桿菌pGEX-6P_Ps420/DH5a的構(gòu)建
[0049]以陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T_PPs420為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物Ps420與表達(dá)載體pGEX-6P-l連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。將構(gòu)建的陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌DH5 a中，選單克隆。具體制備方法記載在《中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)》2009年07期，題為“豬流行性腹瀉病毒S基因片段的原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性” 一文中。
[0050]2、將重組大腸桿菌？6￡乂-6?-?8420/1)冊(cè)0，接種于液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 u g/mL)中，230r/m, 37°C培養(yǎng)12h活化。將活化菌體按1:100的比例接種于液體培養(yǎng)基的三角瓶中(含氨節(jié)青霉素50ii g/mL)，230r/m，37°C培養(yǎng)，待培養(yǎng)至150min時(shí)加入IPTG至其終濃度為0.61mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)150min時(shí)結(jié)束誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析目的帶表達(dá)后，進(jìn)行大量上樣，用KCl染液染色，將目的條帶切下，碾碎后用PBS反復(fù)凍融，使蛋白溶于其中，將反復(fù)凍融的膠粒離心，取上清適量，加等量SDS上樣緩沖液，充分混勻，煮沸5分鐘，以誘導(dǎo)后菌體為對(duì)照，在12%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分析純化結(jié)果。
[0051]實(shí)施例2抗PEDV單克隆抗體的制備
[0052]1、雜交瘤細(xì)胞的制備[0053]將PEDV VERO細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次后，以IOOOrpm離心，出去細(xì)胞碎片。取離心上清，加入PEG-6000溶解，3500rpm離心60min，棄上清取沉淀以STE溶解。在超速離心管內(nèi)自上至下依次加入病毒溶液和30%，45%，60%的蔗糖溶液，IO5g離心5h，取病毒層溶液，去蔗糖后通過(guò)紫外分光光度測(cè)定病毒溶液濃度。
[0054]取純化的PEDV病毒，分3次免疫Balb/C小鼠，免疫劑量Img/次，免疫間隔14d，取免疫后小鼠的脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得能夠穩(wěn)定分泌抗PEDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)western-blotting、免疫突光鑒定獲得單克隆抗體。經(jīng)測(cè)定,次單克隆抗體特異性高、分泌穩(wěn)定，亞類為IgGl。
[0055]所述的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株OT7，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心，其菌種保藏編號(hào)為:CCTCCC201392.，保藏日期為2013年7月6日。
[0056]2、單克隆抗體的大量制備及提純:
[0057]取若干只6-8周齡健康BABL/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只滅菌石蠟油作為致敏齊IJ，10日后再向腹腔注入105個(gè)生長(zhǎng)良好的菌種保藏編號(hào)為CCTCC C201392雜交瘤細(xì)胞，12-15日后小鼠腹部腫脹，收取腹水，以4°C，3000r/min離心15min，取離心后上清用微孔濾膜過(guò)濾，除去較大的凝塊及脂肪滴，再以4°C、10000r/min離心15min除去細(xì)胞殘?jiān)靶☆w粒物質(zhì)。首先采用辛酸-飽和硫酸按法對(duì)腹水進(jìn)行粗提，向ImL腹水中加入2mL的乙酸緩沖液(0.06mol/L、PH5.0)，用鹽酸調(diào)PH至4.5，在室溫?cái)嚢柘略?0min內(nèi)逐滴加入33 y L辛酸，4°C靜置2h, 12000r/min離心30min,棄沉淀取上清,在上清中加入1/10體積的0.1mol/L PB (PH7.4,8.5%NaCI)，并用 lmol/L 的 NaOH 調(diào) PH 至 7.4，在 4°C 冰浴下于 30min 內(nèi)加入
0.277g/ml的硫酸按，至45%飽和度，靜置Ih以上，4°C下12000r/min離心30min，棄上清，沉淀溶于0.0lmoI/LPB, PH7.0，對(duì)100倍的上述PB于4°C透析過(guò)夜，0.5mol/L氯化鋇溶液檢測(cè)不出BaS04。然后采用蛋白G (GEHealthCare公司)親和層析方法進(jìn)一步純化單抗,經(jīng)測(cè)定抗體純度達(dá)到95%。
[0058]3、單克隆抗體特性檢測(cè)
[0059]3.1靈敏性實(shí)驗(yàn)
[0060]將PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行2倍比稀釋，利用本發(fā)明所得到的單克隆抗體通過(guò)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)驗(yàn)證建本發(fā)明所述單克隆抗體的靈敏度，根據(jù)結(jié)果可知利用本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，其最小病毒檢出滴度為:10_5_4，結(jié)果如圖4A所示。將相同滴度的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物再通過(guò)提取病毒基因組RNA，進(jìn)行RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，其最小病毒檢出量為:10_5_4，結(jié)果如表4B所示。說(shuō)明利用本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)和采用R T-PCR的方法進(jìn)行的檢測(cè)具有相同的檢測(cè)靈敏度。
[0061]3.2特異性檢測(cè)
[0062]以能夠引起仔豬病毒性腹瀉的常見(jiàn)病原體TGEV、PPV、PRV、CSFV作為檢測(cè)原采用本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果如表I所示，結(jié)果表明本發(fā)明的單克隆抗體不與TGEV, PPV、PRV、CSFV反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性。
[0063]表I雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述試紙條按照連接順序依次包括樣品墊，膠體金墊，硝酸纖維素膜，吸水紙及位于下方的作為組裝平臺(tái)使用的PVC底板，所述硝酸纖維素膜與膠體金墊之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與吸水紙之間有搭接，所述膠體金墊是由吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃纖維素膜組成，所述硝酸纖維素膜上包被有山羊抗鼠IgG多克隆抗體包被的質(zhì)控線，以及兔抗PEDVS蛋白多克隆抗體包被的檢測(cè)線，樣品墊提供了待測(cè)樣品加入的位置； 其中，所述的抗PEDV單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其菌種保藏編號(hào)為=CCTCC C201392。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述的質(zhì)控線是通過(guò)將山羊抗鼠IgG多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在硝酸纖維素膜上得到的；所述的檢測(cè)線是通過(guò)將兔抗PEDV S蛋白多克隆抗體以lmg/ml的濃度包被在在硝酸纖維素膜上得到的；檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔0.5cm。
3.如權(quán)利要求2所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，將包被后的硝酸纖維素膜于含 1% (w/w) BSA,0.2% (v/v) Tween20、pH5.4 的 0.05mol/L Tris-HCl 溶液中室溫封閉10-60min，再用0.05mol/L NaH2PO3漂洗兩次后，4°C干燥備用。
4.如權(quán)利要求1所述 的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述的膠體金墊是通過(guò)以下方法制備得到: (1)將所有玻璃器皿清洗干凈，然后浸泡在洗液中24h;取出后用自來(lái)水沖洗8遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干后將玻璃容器浸泡于含有5% (w/v)的二氯二鉀硅烷的氯仿溶液中l(wèi)min，然后用去離子水沖洗,再干燥備用； 其中，所述的洗液按照以下方法制備:重鉻酸鉀lOOOg，濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml，混勻； (2)向步驟(I)處理后的玻璃器皿中加入0.01%(w/w)氯金酸溶液IOOmL,在磁力攪拌器上攪拌加熱，迅速加入2.5mLl% (w/w)檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱煮沸5-10min，溶液顏色逐漸由深藍(lán)色轉(zhuǎn)為橙紅色，色澤鮮艷，停止煮沸，并回流至體積為100ml，然后用電鏡鏡檢，制備的膠體金溶液的金顆粒大小一致，均勻，顆粒直徑為20nm，4°C密閉避光保存?zhèn)溆茫? (3)用0.lmol/L的1(20)3將步驟(2)的膠體金溶液的pH值調(diào)至pH5.2，在避光條件下放到搖床上緩慢震蕩，取純化的抗PEDV單克隆抗體逐滴加入至終濃度為0.125mg/ml，繼續(xù)震蕩30min，靜置lOmin，加入BSA作為穩(wěn)定劑，使其終濃度達(dá)到1% (w/w),再緩慢震蕩30min，得到金標(biāo)單抗溶液； (4)將金標(biāo)單抗溶液以4°C、2000r/min離心IOmin除去其中的膠體金聚合物,然后取上清，再以4°C, 12000r/min離心60min,可見(jiàn)離心物分為3層,上清液含有尚未結(jié)合的單抗,最下面的深黑色斑點(diǎn)即為尚未結(jié)合的膠體金顆粒聚合物，中間呈紫紅色的絮狀沉淀即為結(jié)合良好的金標(biāo)單抗復(fù)合物； (5)收集紫紅色絮狀沉淀，用與步驟(4)第一次離心后取得上清的相同體積的含1%(w/w) BSA的10mmol/L pH5.2PBS懸浮，4°C避光保存?zhèn)溆茫? (6)先將玻璃纖維膜浸泡在pH5.2 含 3% (w/w)BSA,0.1% (v/v)Tween-80 的 0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4°C過(guò)夜干燥備用；按每條玻璃纖維膜的大小為0.7cm寬X 7cm長(zhǎng)計(jì)算，將0.7ml膠體金探針均勻噴灑在玻璃纖維上，在室溫下烘干。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的免疫膠體金試紙條在制備檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒試劑中的應(yīng)用。
6.一種穩(wěn)定分泌抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其菌種保藏編號(hào)為:CCTCCC201392。
7.抗豬流行性腹瀉病毒的單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求6所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
8.權(quán)利要求7所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)豬 流行性腹瀉病毒試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK103454419SQ201310317343
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月22日
【發(fā)明者】李一經(jīng), 唐麗杰, 喬薪瑗, 尹紀(jì)元, 王鏨彧 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)