一種固氮基因簇及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種固氮基因簇，包含nifB，nifH，nifD，nifK，nifE，nifN，nifX，moeB，nifV9個基因，是目前發現的較小的能夠完成固氮功能的基因簇。本發明還提供了含有上述固氮基因簇基因的表達載體及含有該載體的基因工程菌，本發明的固氮基因簇可以在大腸桿菌中完成固氮過程，得到的基因工程菌具有較高的固氮能力，且能夠解除銨氧對固氮影響。本發明提供的固氮基因簇可用于制備轉基因農作物，提高農作物的生物固氮能力。
【專利說明】一種固氮基因簇及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地，涉及一種具有固氮能力的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB 及其應用。
【背景技術】
[0002]氮是生物生存所必需的重要元素之一。在生物界動物、植物不能直接利用大氣中的氮氣，只能利用化合態氮。但某些微生物可以直接利用占大氣近80 %的氮氣，具有將氮氣轉化成氨的能力即生物固氮。它們能通過體內一種具有特殊催化能力的蛋白質即固氮酶的活動，把空氣中的氮轉化為植物能吸收利用的含氮化合物。植物從土壤中吸取這些養料用以合成蛋白質，動物又從植物那里攝取蛋白質和其他必需的成分來延續自己的生命活動。由此可見，世界上各種含氮化合物包括蛋白質在內，其最初來源都是空氣中的氮，而且都是通過微生物的固氮活動把它轉變為有效氮素。所以生物固氮構成了自然界整個氮素循環的重要環節，并直接關系到植物、動物以至人類的生存。
[0003]生物固氮是個十分復雜的生理生化過程，涉及到固氮酶的生物合成、組裝、酶催化、調控等等一系列生化過成。固氮酶系統在結構上和催化機理方面都是相當復雜的，要形成一個具有活性的固氮酶復合體，需要許多基因來編碼。肺炎克氏桿菌(Klebesielapneumoniae) 21個固氮基因在染色體上以基因簇的形式存在，全長大約24kb。21個基因構成 8 個轉錄單位:nifJC, nifHDKTY, nifENX, nifUSVff, nifZM, nifF, nifLA 和 nifBQ。固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501染色體上有56個與固氮相關基因以基因簇的形式存在，棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的nif基因位于兩個不相鄰的基因族，nifHDKTYENXUSVffZMF 和 nifLABQ。巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)固氮相關基因主要分布在兩個基因簇:一個主要nif簇含有nifHDK、nifY、nifE、nifUS、nifff和fixABCX,另外一個nif基因簇由nifA和nifB基因組成。這些G-固氮菌的nif啟動子均屬于O 54型啟動子，其轉錄嚴格根`據銨和氧濃度受轉錄激活蛋白NifA的調控。螺旋桿菌(Heliobacterium)有 I 個 10kb、含 11 個基因的固氮基因族:nifll nif 12 nifH nifD nifKnifE nifN nifX fdx nifB nifV,丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)固氮基因族由 9 個基因組成:nifH nifll nif 12 nifD nifK nifE nifN-B nifVw nifVa ;貝氏梭狀芽胞桿菌固氮基因族有 14個基因:nifH nifll nif 12 nifD nifK nifE nifN-B fdxA nirjl nirJ2 nirDnirH nifVw nifVa ;巴氏芽抱梭菌(C.pasteurianum)固氮基因族有10個基因:nifH2 nifHlnifD nifK nifE nifN-B modA modB nifVw nifVa。
[0004]固氮類芽孢桿菌(Paenibacillus)目前報道有17個固氮菌種，其抗逆力強、耐貯藏，很多菌株除了有固氮能力外還有促生，抗生等多種能力，其具有獨特的基因類型、不一樣的固氮調控機理以及潛在的應用價值，因此研究其固氮基因簇有利于研究固氮調節機理，對得到更好、更多的轉基因材料具有重要的研究意義。

【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一株具有固氮基因簇的芽孢桿菌。
[0006]本發明的另一目的在于提供含有上述固氮基因簇的表達載體。
[0007]本發明的再一目的在于提供上述固氮基因簇的應用。
[0008]本發明提供的一株類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) 18WLY，其含有固氮基因簇nifBHDKENXV moeB。該菌株已于2013年6月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為Paenibacillus sp.，保藏號為CGMCC N0.7724。
[0009]本發明提供的固氮基因簇，其為nifBHDKENXV moeB，核苷酸序列為:
[0010](I)SEQ ID N0.10 所示，包含 nifB，nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, moeB,nifV9個基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1_9所示；*(2)SEQ ID N0.10所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或(3)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0011]所述嚴格條件為在0.1XSSC (成分為NaC10.015M，檸檬酸鈉0.0015M，PH7.0)，
0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0012]序列表中SEQ ID N0.1是由15 01個堿基對組成，編碼產物參與FeMoco輔因子的合成。SEQ ID N0.2是由867個堿基對組成，編碼固氮酶的Fe蛋白。SEQ ID N0.3是由1449個堿基對組成，編碼固氮酶的鑰鐵蛋白的a亞基。SEQ ID N0.4是由1449個堿基對組成，編碼固氮酶鑰鐵蛋白的P亞基。SEQ ID N0.5是由1362個堿基對組成，編碼產物參與FeMoco輔因子的合成。SEQ ID N0.6是由1212個堿基對組成，編碼產物參與FeMoco輔因子的合成。SEQ ID N0.7是由390個堿基對組成，編碼產物參與FeMoco輔因子的合成。SEQ ID N0.8是由1147個堿基對組成，編碼產物參與高檸檬酸鐵的合成。SEQ ID N0.9是由894個堿基對組成，編碼產物參與FeMoco輔因子的合成。SEQ ID N0.10是基因簇在整個基因組中的序列，由11039bp的核苷酸對組成。
[0013]此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。因而，本發明固氮基因簇基因基因還包括由SEQ ID N0.1-9所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼固氮相關的核苷酸序列。
[0014]可將本發明基因簇與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發明蛋白的重組表達載體，進一步將該重組表達載體導入恰當的宿主細胞中，獲得表達本發明有固氮能力的基因工程菌。
[0015]本發明提供了含有上述固氮基因簇nifBHDKENXV moeB的表達載體。
[0016]在本發明實施例中，分別將固氮基因簇插入到表達載體pUC18，pHY300PLK和pET28b上構建得到重組表達載體pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b-3，其質粒圖譜如圖7a、圖7b、圖7c所示。進一步，將這些表達載體導入到E.coli (JM109)中獲得具有固氮能力的工程菌株。因此本發明還包括含有上述表達載體的宿主細胞或宿主菌。
[0017]上述重組表達載體pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b_3分別通過以下方法構建得到: [0018]I)分別以S3和S4、SI和S2或S5和S6為引物，固氮芽孢桿菌Paenibacillussp.18WLY基因組為模板，PCR擴增固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB在目的片段；[0019]2)分別將表達載體pUC18、pHY300PLK或pET28b和步驟I)的目的片段分別用XbaI和HindII1、XbaI和BamH1、BamHI和HindIII分別雙酶切，回收酶切產物；
[0020]3)在10 ill反應體系中分別加入酶切后的表達載體pUC18、pHY300PLK或pET28bl ii I 和 7.1 目的片段(摩爾比約為 1:6)，IOXligase bufferl U 1，T4DNAIigase0.5 iil，混勻；16°C水浴連接16h，轉化感受態細胞；
[0021]4)篩選陽性克隆子，得到含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的質粒pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b-3。
[0022]在本發明的一個實施例中，利用載體PHY300PLK-2通過基因工程的方法構建得到大腸桿菌基因工程菌株78-7，其通過如下方法構建得到:
[0023]I)以SI和S2為引物，固氮芽孢桿菌Paenibacillus sp.18WLY基因組為模板，PCR擴增帶有自身啟動子的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在目的片段；所述SI的序列為:GCTCTAGAGCGGAGACTATTTCCCAAAAT ；S2 序列為 TGCGGATCCGCGTGTAATGGTTATATGAAT ；
[0024]2)將表達載體pHY300PLK和步驟I)的目的片段分別用XbaI和BamHI分別雙酶切，回收酶切產物；
[0025]3)在10 ill反應體系中分別加入酶切后的表達載體pHY300PLKl 和7.5 yl目的片段(摩爾比約為 1:6)，10Xligase bufferl u 1，T4DNA ligase0.5u 1，混勻；16°C水浴連接16h，轉化感受態細胞；
[0026]4)篩選陽性克隆子，得到含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的質粒pHY300PLK-2 ；
[0027]5)將含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB 的質粒pHY300PLK-2 電轉到E.coli JM109中，得到工程菌株78-7。
[0028]本發明提供了大腸桿菌基因工程菌株78-7在制備生物固氮微生物菌劑或生物有機肥中的應用。
[0029]本發明提供了固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在生物固氮中的用途。以及固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在制備具有固氮能力轉基因農作物中的應用。
[0030]本發明還提供了含有大腸桿菌基因工程菌株78-7的菌劑，及該菌劑在促進植物生長上的應用。本發明提供了含有大腸桿菌基因工程菌株78-7的菌劑在制備生物固氮微生物菌劑或生物有機肥中的應用。含有類芽孢桿菌18WLY的菌劑也屬于本發明的保護范圍。本發明提供了類芽孢桿菌18WLY在生物固氮中的用途。
[0031]本發明的有益效果主要體現在:提供了一株具有固氮活性的類芽孢桿菌18WLY，其含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB基因，經實驗驗證將該固氮基因簇在大腸桿菌中表達，可以使非固氮菌株獲得固氮能力，并且解除了銨根離子對生物固氮功能的調控，其對提高固氮效率、構建高效固氮工程菌株價值顯著，獲得的3株具有固氮能力的大腸桿菌78-2(pUC18), 78-7(pHY300PLK), 78-32(pET28b)，乙炔還原法測定其固氮酶活分別為為149.78、298.76、57.69nmolC2H4/ (mg protein h)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為固氮類芽孢桿菌固氮基因簇的結構圖。
[0033]圖2是固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的PCR擴增圖；其中I為引物SI，S2擴增得到的基因簇電泳條帶，2為S3，S4擴增得到的基因簇電泳條帶，3為S3，S4擴增得到的基因族電泳條帶，M為Ikb ladder marker。
[0034]圖3是表達載體pUC18-l，pHY300PLK-2, pET28b_3構建酶切瓊脂糖凝膠電泳驗證圖;其中圖 3a 為 pUC18-l 酶切電泳圖，I 為 pUC18-78/XbaI+HindI 11,2 為 nif cluser PCRproduct/XbaI+HindIII，3 為 pUC18/XbaI+HindIII ;圖 3b 為 pHY300PLK_2 酶切電泳圖，I 為nif cluser PCR product/Xbal+BamHI，2 為 pHY300PLK_78/XbaI+BamHI，3 為 pHY300PLK/Xbal+BamHI,圖 3c 為pET28b_3酶切電泳圖，I 為nif cluser PCRproduct/BamHI+Hindl 11,2為 pET28b-78/BamHI+HindIII，3 為 pET28b/BamHI+HindIII。圖 4 是工程菌株 78-2(pUC18)，78-7pHY300PLK)和78-32 (pET28b)的固氮酶活力圖，其中圖4a為利用乙炔還原法測定，圖4b為15N2標記法測定。
[0035]圖5是固氮酶活力影響圖；圖5a和圖5b分別是不同氧氣濃度和不同銨離子濃度對工程菌株78-7 (pHY300PLK)固氮酶活力影響圖。
[0036]圖6是高保真實時熒光定量PCR檢測的銨氧對工程菌株78-7 (pHY300PLK)固氮基因轉錄水平的影響圖。
[0037]圖7是重組載體 圖譜，其中圖7a為pUC18_l，圖7b為pHY300PLK_2，圖7c為pET28b-3的圖譜；
【具體實施方式】
[0038]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0039]若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0040]實施例1固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB克隆以及序列分析
[0041](I)固氮類芽孢桿菌全基因組序列分析
[0042]本發明完成了幾株固氮類芽孢桿菌基因組框架圖序列分析，這些固氮類芽孢桿菌株都有共同的比較完整的固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB，如圖1所示。信息學分析這9個基因可能是構成一個轉錄單元，啟動子為O 7°，這是目前發現的固氮基因數目較少的天然固氮基因簇,包含6個基本固氮基因nifBHDKEN和另外3個基因nifXVmoeB。
[0043](2)固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的擴增
[0044]本發明的類芽孢桿菌18WLY分離自北京百望山竹子根系，采用形態觀察法和16SrRNA序列測定相結合的方法，將該菌鑒定為類芽孢桿菌。該菌株18WLY于2013年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101 )，保藏編號為CGMCC N0.7724，分類名為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)。
[0045]本發明對分離得到的一個菌株Paenibacillus sp.18WLY的固氮類芽孢桿菌固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB進行了克隆，根據其基因組框架序列分析結果，設計三對引物SI和S2, S3和S4, S5和S6 (見表I),以菌株Paenibacillus sp.18WLY基因組為模板對其固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB及其共用的啟動子進行了擴增，得到大小約為Ilkb的片段，序列如SEQ ID N0.10所示。三對引物擴增出的三個片段是一樣的，都為9個基因組成的固氮基因簇，不同的是片段的開始和末尾的酶切位點不同。并將此片段進行了膠回收純化，擴增
【權利要求】
1.一株類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) 18WLY，其保藏編號為 CGMCC N0.7724。
2.如權利要求1所述的類芽孢桿菌(Paenibacillussp.) 18WLY,其特征在于,含有一種固氮基因簇，其為nifBHDKENXV moeB。
3.一種固氮基因簇，其為nifBHDKENXV moeB，其核苷酸序列為:
(1)SEQ ID N0.10 所示，包含 nifB，nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, moeB, nifV9個基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1-9所示；或 (2)SEQ ID N0.10所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或 (3)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權利要求3所述固氮基因簇的表達載體。
5.如權利要求4所述的表達載體，其特征在于，其為pHY300PLK-2。
6.含有權利要求4-5任一所述表達載體的宿主細胞或宿主菌。
7.如權利要求6所述的宿主菌，其為大腸桿菌基因工程菌株78-7，其通過如下方法構建得到: (1)以SI和S2為引物，固氮芽孢桿菌Paenibacillussp.18WLY基因組為模板，PCR擴增帶有自身啟動子的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB在目的片段；所述SI的序列為:GCTCTAGAGCGGAGACTATTTCCCA AAAT ；S2 序列為 TGCGGATCCGCGTGTAATGGTTATATGAAT ； (2)將表達載體pHY300PLK和步驟(I)的目的片段分別用XbaI和BamHI分別雙酶切，回收酶切產物； (3)在10ill反應體系中分別加入酶切后的表達載體pHY300PLKl 和7.5 目的片段，摩爾比約為 1:6，IOXligase buffer I u 1,T4DNA ligase0.5 yl，混勻；16°C 水浴連接16h，轉化感受態細胞； (4)篩選陽性克隆子，得到含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的質粒pHY300PLK_2； (5)將含有固氮基因簇nifBHDKENXVmoeB的質粒pHY300PLK_2電轉到E.coli JM109中，得到工程菌株78-7。
8.大腸桿菌基因工程菌株78-7在制備生物固氮微生物菌劑或生物有機肥中的應用。
9.含有權利要求1所述的類芽孢桿菌18WLY的菌劑。
10.權利要求1所述的類芽孢桿菌18WLY或權利要求3所述的固氮基因簇在生物固氮中的用途。
【文檔編號】C12N15/70GK103451130SQ201310317366
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年7月25日 優先權日:2013年7月25日
【發明者】陳三鳳, 王莉瑛 申請人:中國農業大學