利用確定的細胞因子組合促進成纖維細胞轉分化為脂肪細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用確定的細胞因子組合促進成纖維細胞轉分化為脂肪細胞。組合物的起效因子為表皮生長因子、肝細胞生長因子、地塞米松、胰島素和PPARγ激動劑。本發(fā)明探索出了用于誘導非脂肪前體細胞的成纖維細胞轉分化為脂肪細胞的細胞因子組合，為了研究脂肪細胞分化提供了新的平臺，表明體內的脂肪細胞來源可能不僅有脂肪前體細胞。本發(fā)明方法誘導過程簡單，可以有效地將成纖維細胞誘導為脂肪細胞。
【專利說明】利用確定的細胞因子組合促進成纖維細胞轉分化為脂肪細胞

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞轉分化誘導細胞因子組合物及細胞轉分化的培養(yǎng)方法，特別促進成纖維細胞轉分化為脂肪細胞確定的細胞因子組合物以及使用該組合物促進成纖維細胞轉分化為脂肪細胞培養(yǎng)方法。

【背景技術】
[0002]肥胖發(fā)生的原因是當體內能量失衡，攝入的能量大于消耗的能量時，過多的能量主要以脂肪的形式儲存起來，脂肪的重量增加從而導致肥胖的發(fā)生。脂肪主要儲存在機體的脂肪組織內，脂肪組織的增多主要表現為脂肪細胞的體積變大和脂肪細胞數目的增加。但是脂肪細胞的體積是有一定限度的，不可能無限的變大，所以過多的能量儲存主要是依靠更多的新生的脂肪細胞。因此，脂肪細胞的分化便成為抑制肥胖的主要關注熱點。
[0003]小鼠的3T3-L1細胞系是目前運用最廣泛的脂肪細胞分化研究體系，公認的脂肪前體細胞系。在成脂因子IBMX，DEX和Insulin刺激下，絕大多數細胞都能夠被誘導分化為脂肪細胞。根據多年的研究，過氧化物酶體增生物激活受體Y (PPARy)是最關鍵的脂肪細胞分化轉錄因子，PPARY的敲除小鼠是胚胎致死的，由脂肪組織的缺陷造成。此外，脂肪前體細胞只需添加PPAR Y的配體也可促進其分化為脂肪細胞。CCAAT/增強子結合蛋白家族(C/EBPs)也在脂肪細胞分化中起著重要作用。C/ΕΒΡβ和C/ΕΒΡδ在分化早期能夠促進PPARy的表達，而C/ΕΒΡα能夠維持PPAR Y的表達。C/EBP a和PPAR Y —起可以直接激活許多脂肪細胞分化后的相關基因。近些年，除了 C/EBPa和PPARy外，還有很多其他的促進脂肪細胞分化的轉錄激活因子被發(fā)現，像CREB，SREBP等等。
[0004]通常認為脂肪細胞是由脂肪前體細胞分化而來，脂肪前體細胞也被認為主要存在于脂肪組織的組織干細胞微環(huán)境中，當需要新的脂肪細胞生成時，這些脂肪前體細胞便會分化為脂肪細胞，如同肌肉前體細胞，肝臟前體細胞等存在于肌肉和肝臟中。但是脂肪前體細胞的標志基因到目前為止尚未有定論，因此也一直無法完美的從體內分離出真正的脂肪前體細胞進行研究。此外，在正常動物和人類的機體內，脂肪組織主要存在于腹腔內和腹部的皮下內。但是肥胖發(fā)生后，機體各個部位都會出現脂肪組織，腎臟周圍，腸系膜周圍，各個部位的皮下內等等，同時腹腔內的脂肪組織也會急劇增重。這些證據說明可能分化為脂肪細胞的細胞可能不僅有脂肪前體細胞，在一些特定條件下，一些非脂肪前體細胞的成纖維細胞也能夠分化為脂肪細胞。
[0005]通過將非脂肪前體細胞，如成纖維細胞轉分化為脂肪細胞，可以更為清楚地了解脂肪細胞的轉分化機制，進而指導抑制肥胖藥物的開發(fā)。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于本發(fā)明所采取的技術方案是: 一種促進細胞轉分化的組合物，其起效因子為A、B、C、D和E，其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為:
A:表皮生長因子，終濃度10?30ng/ml ；
B:肝細胞生長因子，終濃度10?30ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度100?200nM ；
D:胰島素，I?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激動劑，終濃度為0.5?2 μ M。
[0007]作為本發(fā)明的進一步改進，Α、Β、C、D、E在培養(yǎng)液中的終濃度分別為:
A:表皮生長因子，終濃度20?30ng/ml ；
B:肝細胞生長因子，終濃度20?30ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度150?200nM ；
D:胰島素,5?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激動劑，終濃度為I?2 μ M。
[0008]PPARy激動劑選自噻唑烷二酮類藥物，特別的，噻唑烷二酮類藥物選自環(huán)格列酮、恩格列酮和曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮、法格列酮、達格列酮。
[0009]一種成纖維細胞轉分化誘導培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中添加有上述的組合物。
[0010]一種將成纖維細胞轉分化為脂肪細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
1)分離成纖維細胞并培養(yǎng)在培養(yǎng)液中；
2)在培養(yǎng)液中加入上述的組合物，
3)繼續(xù)培養(yǎng)，得到脂肪細胞。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明探索出了用于誘導非脂肪前體細胞的成纖維細胞轉分化為脂肪細胞的細胞因子組合，為了研究脂肪細胞分化提供了新的平臺，表明體內的脂肪細胞來源可能不僅有脂肪前體細胞。
[0012]本發(fā)明方法誘導過程簡單，可以有效地將成纖維細胞誘導為脂肪細胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是轉分化后的脂肪細胞圖；
圖2是小鼠鼠尾成纖維細胞轉分化為脂肪細胞的試驗結果；
圖3是最低和最高細胞因子濃度的細胞誘導結果圖。

【具體實施方式】
[0014]一種促進細胞轉分化的組合物，其起效因子為A、B、C、D和E，其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為:
A:表皮生長因子，用于激活細胞的STAT5信號通路，終濃度10?30ng/ml ；
B:肝細胞生長因子，用于激活細胞的STAT5信號通路，終濃度10?30ng/ml ；
C:地塞米松，用于C/EBP δ的表達，終濃度100?200ηΜ ；
D:胰島素，加速脂滴的形成，I?10 μ g/ml ；
E:PPAR Y激動劑，終濃度為0.5?2 μ M。
[0015]下面結實施例及試驗數據，進一步說明本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明選用的NIH-3T3細胞系購自美國ATCC公司。
[0017]以下實施例中所用培養(yǎng)基配方如下:
1)細胞生長培養(yǎng)基
高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)添加胎牛血清(終濃度為10 % v/v)和雙抗(青霉素和鏈霉素(Gibco)),雙抗?jié)舛葹?1% ν/ν) ο
[0018]_
2)誘導培養(yǎng)基
添加了細胞轉分化促進因子的細胞生長培養(yǎng)基；
3)油紅儲存液
0.7g油紅染料，200mL異丙醇，震蕩過夜，使用0.2 μ m過濾器過濾，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]脂肪細胞的形態(tài)鑒定-油紅染色
油紅工作液:油紅儲存液和水以6:4的比例混合,然后再室溫下靜置20分鐘后用0.22Mm濾膜過濾。
[0020]I)將分化后的細胞從培養(yǎng)箱中取出，移除全部的細胞培養(yǎng)液；
2)加入500μ1的10%的福爾馬林，在室溫下放置5分鐘；
3)移除10%的福爾馬林，加入500μ1新鮮的福爾馬林，在室溫下至少孵育I個小時；
4)移除福爾馬林，然后加入500μ1的60%異丙醇，移除60%異丙醇，讓培養(yǎng)板晾干；
5)加入500μ1油紅工作液，孵育10分鐘；
6)移除油紅工作液，立即用水洗滌，用水洗滌4次
7)移除水，完全晾干，加入100%異丙醇萃取油紅，孵育10分鐘或者更長；
8)將200μ1萃取后的異丙醇轉移到ELISA板中，500nm讀數，用于定量分析甘油三酯(TG)含量。
[0021]脂肪細胞的基因表達鑒定
RNA提取:利用Trizol法提取，具體操作如下:
1)將分化后的細胞取出，移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次，然后加入ImlTrizol，裂解30分鐘，然后轉移到EP管中；
2)加入200μ I氯仿/ml Trizol,用力振蕩混勻15秒，室溫放置3分鐘，4 °C, 12, 000g離心15分鐘；
3)溶液分成三層，品分為三層:無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機相，小心吸取上清至新的離心管；
4)加入500μ I異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，4 V，12，000 g離心10分鐘；
5)小心去除上清，加入Iml75%乙醇(DEPC水配制)，輕輕混勻，懸浮沉淀，4 °C, 7500g離心5分鐘；
6)去除上清，自然烘干5分鐘左右，加入40μ I DEPC水溶解RNA沉淀；
7)取5μ I進行電泳檢測提取RNA的質量，28S條帶亮度是18S條帶兩倍的RNA是質量較好的RNA,凝膠與電泳緩沖液需新鮮配制；
8)取2 μ I 測定 RNA 濃度，RNA 的濃度=OD260 X 稀釋倍數 Χ0.04 μ g/μ L，OD260nm/OD280nm在1.8?2.0視為抽提的RNA的純度很高。
[0022]RNA逆轉錄:利用SuperScriptTM II RT逆轉錄試劑盒合成cDNA ;
熒光實時定量 PCR:采用 Takara 公司 SYBR? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)定量PCR試劑盒，根據說明進行定量PCR反應。
[0023]反應條件:
預變性:95 V 20秒；
變性:95 °C，10秒；
退火:60 °C, 20秒；
孵育:70 °C I秒；
根據基因的表達量重復38?45個循環(huán)，65?95 °C做溶解曲線，每0.5 °C讀一次板，時間為I秒。
[0024]實施例1 NIH-3T3細胞的轉分化 ABCDE 組:
將復蘇的NIH-3T3細胞用細胞生長培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)兩次，之后進行誘導分化，以24孔板培養(yǎng)的一孔為例，細胞生長匯聚后，培養(yǎng)基更換為細胞誘導培養(yǎng)基(0.5ml),誘導培養(yǎng)基中，細胞因子的終濃度如下:
A:表皮生長因子，終濃度20ng/ml ；
B:肝細胞生長因子，終濃度20ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度10nM ；
D:胰島素,5 μ g/ml ；
E:羅格列酮，終濃度為I μΜ;
每兩天更換一次誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周。
[0025]空白對照組:
ΝΙΗ-3Τ3細胞的轉分化培養(yǎng)條件同ABCDE組，不同之處在于其未使用細胞誘導培養(yǎng)基，僅使用細胞生長培養(yǎng)基。
[0026]MDIR 誘導組:
ΝΙΗ-3Τ3細胞的轉分化培養(yǎng)條件同AB⑶E組，不同之處在于其誘導培養(yǎng)中的中添加的細胞因子如下:
培養(yǎng)條件為在細胞長滿后的開始兩天的誘導培養(yǎng)基是添加MDIR的生長培養(yǎng)基，在后面的誘導培養(yǎng)基更換為添加IR的生長培養(yǎng)基，每兩天換液一次。具體濃度如下:
IBMX (isobutylmethylxanthine, M):終濃度為 0.5mM ；
地塞米松Dexamethasone (D):終濃度為Iym;
胰島素Insulin (I):終濃度為5 μ g/ml ；
羅格列酮Rosiglitazone (R):終濃度為I μ M。
[0027]試驗結果:
培養(yǎng)兩周后，轉分化的細胞照片如圖1 A所示，從圖中可以看出，傳統(tǒng)的成脂因子MDIR不能促進非脂肪前體細胞的成纖維細胞分化為脂肪細胞(MIDR組)，而本發(fā)明的新的細胞因子組合可以促進非脂肪前體細胞的成纖維細胞ΝΙΗ-3Τ3分化為脂肪細胞(AB⑶E組)。如圖所示，在添加誘導因子14天約有50%的細胞分化。隨著誘導時間的增長，會有更多的細胞分化為脂肪細胞直至100% ； 分別檢測不同培養(yǎng)組中細胞中PPARy和aP2 mRNA的相對表達量，結果如圖1 B所示，空白對照組和MIDR誘導組中，沒有檢測到有PPAR Y和aP2表達，在AB⑶E組中，PPAR Y和aP2的表達量較大，說明該組中已經形成了較大量的脂肪細胞；
分別檢測不同培養(yǎng)組中細胞中的TG含量，結果如圖1 C所示，從圖中可以清楚地看出，空白對照組和MIDR誘導組中幾乎檢測不到TG，僅有ABCDE組中的TG量較多，說明該組中已經形成了較大量的脂肪細胞。
[0028]實施例2小鼠鼠尾成纖維細胞的轉分化
鼠尾細胞的分離和培養(yǎng):室外取小鼠的鼠尾細胞3cm，用75%酒精浸泡30s，然后轉移到添加5倍雙抗的培養(yǎng)基中，在細胞操作臺中，將鼠尾轉移到培養(yǎng)板中，然后用手術剪把鼠尾剪碎；加入37攝氏度預熱的培養(yǎng)基，5天后，可以看到有細胞貼壁，12天后，將細胞消化，鋪板到12孔培養(yǎng)板中，等待細胞匯聚。
[0029]組:
鼠尾成纖維細胞的分化:誘導分化步驟和實施例1的NIH-3T3細胞完全一致，培養(yǎng)5周并觀察。
[0030]空白對照組:培養(yǎng)步驟同實施例1的空白對照試驗。
[0031]誘導組:誘導分化步驟同實施例1的MDIR誘導試驗。
[0032]轉分化的細胞照片如圖2 A所示，從圖中可以看出傳統(tǒng)成脂因子MDIR不能促進原代非脂肪前體細胞的成纖維鼠尾細胞分化為脂肪細胞，而本發(fā)明的細胞因子組合可以促進其分化為脂肪細胞。在添加誘導因子35天約有30%的細胞分化為脂肪細胞。
[0033]分別檢測不同培養(yǎng)組中細胞中PPAR Y mRNA的相對表達量，結果如圖2 B所示，空白對照組和MIDR誘導組中，沒有檢測到有PPAR Y表達，在AB⑶E組中，PPAR Y的表達量較大，說明該組中已經形成了較大量的脂肪細胞；
分別檢測不同培養(yǎng)組中細胞中的TG含量，結果如圖2 C所示，從圖中可以清楚地看出，空白對照組和MIDR誘導組中幾乎檢測不到TG，僅有ABCDE組中的TG量較多，說明該組中已經形成了較大量的脂肪細胞。
[0034]實施例3
將復蘇的NIH-3T3細胞用細胞生長培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)兩次，之后進行誘導分化，以24孔板培養(yǎng)的一孔為例，細胞生長匯聚后，培養(yǎng)基更換為細胞誘導培養(yǎng)基(0.5ml),誘導培養(yǎng)基中，細胞因子的終濃度如下:
A:表皮生長因子，終濃度10 ng/ml ；
B:肝細胞生長因子，終濃度10 ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度100 nM ；
D:胰島素，I μ g/ml ；
E:羅格列酮，終濃度為0.5 μΜ；
每兩天更換一次誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)四周。
[0035]實施例4
將復蘇的ΝΙΗ-3Τ3細胞用細胞生長培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)兩次，之后進行誘導分化，以24孔板培養(yǎng)的一孔為例，細胞生長匯聚后，培養(yǎng)基更換為細胞誘導培養(yǎng)基(0.5ml),誘導培養(yǎng)基中，細胞因子的終濃度如下: A:表皮生長因子，終濃度30 ng/ml ；
B:肝細胞生長因子，終濃度30 ng/ml ；
C:地塞米松，終濃度200 nM ；
D:胰島素，10 μ g/ml ；
E:羅格列酮，終濃度為2 μΜ；
每兩天更換一次誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周。
[0036]實施例3和4誘導培養(yǎng)后的細胞照片如圖3所示，從圖中可以看出，兩實施例中均可以誘導出脂肪細胞。高濃度的細胞因子下，誘導的速率更快；低濃度下，也可以成功地誘導出脂肪細胞。
【權利要求】
1.一種促進細胞轉分化的組合物，其起效因子為A、B、C、D和E，其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為: A:表皮生長因子，終濃度10?30ng/ml ； B:肝細胞生長因子，終濃度10?30ng/ml ； C:地塞米松，終濃度100?200nM ； D:胰島素，I?10 μ g/ml ； E:PPAR Y激動劑，終濃度為0.5?2 μ M。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于:Α、B、C、D、E在培養(yǎng)液中的終濃度分別為: A:表皮生長因子，終濃度20?30ng/ml ； B:肝細胞生長因子，終濃度20?30ng/ml ； C:地塞米松，終濃度150?200nM ； D:胰島素，5?10 μ g/ml ； E:PPAR Y激動劑，終濃度為I?2 μ M。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特征在于=PPARy激動劑選自噻唑烷二酮類藥物。
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于:噻唑烷二酮類藥物選自環(huán)格列酮、恩格列酮和曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮、法格列酮、達格列酮。
5.一種成纖維細胞轉分化誘導培養(yǎng)液，其特征在于:所述培養(yǎng)液中添加有權利要求1?4任意一項所述的組合物。
6.一種將成纖維細胞轉分化為脂肪細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟: 1)分離成纖維細胞并培養(yǎng)在培養(yǎng)液中； 2)在培養(yǎng)液中加入權利要求1?4任意一項所述的組合物， 3)繼續(xù)培養(yǎng)，得到脂肪細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK104342401SQ201310317410
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權日:2013年7月25日
【發(fā)明者】吳東海, 聶濤, 徐愛民, 李鵬 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院