拮抗土傳病害的木霉菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物防治領域的拮抗土傳病害的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株為棘孢木霉（Trichoderma?asperellum）ZJSX5003CGMCC?No.6480。本發明的木霉菌菌株的生長速度快、產孢量大，離體對峙病原菌抑制率分別達79.79%、73.68%、72.25%，病原菌孢子存活率均為0.00%，針對黃瓜枯萎病、玉米莖腐病的活體防效分別為85.08%、66.67%，幾丁質酶酶活為4.0783U，β-1,3-葡聚糖酶酶活為0.8050U，胞外蛋白酶酶活為4.8503U，抗生性次生代謝物中起拮抗作用的聚酮類、萜烯類和羧酸類占總體比重的44.44%；本發明的木霉菌菌株具有高拮抗性、強?；缘膬烖c，應用該菌株生產的生物農藥能夠有效防治土傳病害，保證農作物、蔬菜產量的穩定增長。
【專利說明】拮抗土傳病害的木霉菌菌株
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物防治領域，涉及一株木霉菌菌株，尤其涉及一種拮抗土傳病害的木霉菌菌株。
【背景技術】
[0002]由于長時期的連年種植某一作物，造成土壤次生鹽潰化嚴重和土傳病害為害加劇，導致作物品質降低，產量下降，現已成為制約設施農業持續發展的重要障礙因子。植物土傳病害是一類重要的植物病害，引起土傳病害的病原物種類很多(真菌、細菌、線蟲、病毒)，它們通常侵染植物根部，引起植物根部乃至全株的病害，造成重大的經濟損失。其中，土傳病原真菌目前已成為農作物、蔬菜穩產、高產的主要制約因素之一。
[0003]以玉米莖腐病(Corn Stalk Rot)為例簡要概述其造成經濟損失,又稱玉米青枯病，其分布廣、危害重，世界玉米各產區均普遍發生，一般年份發病率為10~20%，嚴重時可達50%以上，導致玉米減產20~30%。引起玉米莖腐病的主要致病病原菌是腐霉菌、鐮刀菌、干腐菌、炭疽菌和細菌等。再以黃瓜枯萎病為例，又叫蔓割病、萎蔫病，是土壤傳播、根部侵入的一種維管束病害，一般發病率20%~30%，嚴重地塊達80%~90%，甚至全部毀種，嚴重影響黃瓜生產產量。因此，為了有效防治土傳病害、保證我國農作物、蔬菜產量穩定增長，必然需要進行綜合防治。其中，由于生物防治綠色無害高效而廣受政府、農莊及農戶關注，生防微生物資源研究迫在眉睫。而作為國際公認生防菌的木霉菌，近年來優選菌株的應用效果卓著，尋找高效生防能力的木霉 菌株資源非常重要。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是通過離體對峙培養測定、病原菌孢子存活率測定、盆栽接種試驗指標的篩選，提供一種新型拮抗土傳病害的木霉菌菌株，本發明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、強專化性的優點，應用該菌株生產的生物農藥，能夠有效防治土傳病害，保證農作物、蔬菜產量的穩定增長。
[0005]本發明是通過以下的技術方案實現的，
[0006]本發明涉及一種措抗土傳病咅的木霉囷囷株，所述木霉囷囷株為棘抱木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003 CGMCC N0.6480。
[0007]優選地，所述菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]優選地，所述菌株的Tefl- α序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]本發明提供的木霉菌菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101 ;本發明菌株的信息為:棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003 ;保藏號為 CGMCC N0.6480 ;保藏日期為 2012.8.28。
[0010]菌株培養特征包括:PDA上的最適合生長溫度為30°C，30°C生長48h菌落半徑約為31~47mm ;30°C黑暗條件下生長期間每隔8h給予短暫的熒光照射，菌落能夠形成5個同心輪紋結構，由密集的分生孢子組成，靠近中心部位的分生孢子為黑綠色，缺乏氣生菌絲；不產生擴散性色素，無明顯氣味；菌落反面為奶油色，有皺褶或者有纏繞結構。
[0011]菌株形態特征包括:分生孢子簇呈墊狀至半球狀，直徑為0.5~2mm，離散分布或者匯合，散布于整個菌落或者排列為2~3個同心輪紋；分生孢子聚合體為深綠色。在分生孢子簇內，分生孢子梗上的瓶梗呈現對稱分布，頂端具有兩個或多個瓶梗，瓶梗寬度為2.8~5.4 μ m，主軸頂端下面生出的初次分枝常呈對生，與主軸的夾角為近90° ;瓶梗典型地產生于初次、二次、三次分枝的頂端，較少直接產生于初次和二次分枝中部，2~3個瓶梗呈漩渦狀排列；瓶梗直、安瓿形，僅在中部稍微加粗，長度為7.1~11.3 μ m，中部寬度為
3.0~5.5 μ m，基部寬度為2.0~3.5 μ m，基部稍微有縊縮，與其母細胞夾角約為100°。分生孢子球形至亞球形或者卵圓形，大小為3.7~6.0 μ mX 3.0~5.0 μ m,沒有可見的基部脫落痕跡，有細刺結構，但有時很難觀察到。
[0012]本發明采集中國南部地區農林土壤并于4°C保藏、分離純化菌株、離體對峙病原菌抑制試驗(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)、病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)孢子存活率測定、活體接菌防效試驗，經過以上步驟反復篩選，最終選出高拮抗性、強?；缘臍⑼羵鞑『Φ哪久咕辏幪枮閆JSX5003。通過菌落及分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形態特征鑒定以及內轉錄基因間區核酸序列測定和分析，確定了該菌株的分類地位:木霉屬(Trichoderma Pers.ex Fr.),棘抱木霉(Trichoderma asperellum)。本發明也進行了該菌株的生理生化測定，包括拮抗相關酶酶活(幾丁質酶、β -1, 3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)檢測、抗生性次生代謝物提取分析，以便更好地開發利用該菌株。
[0013]本發明提供的木霉菌菌株的ITS序列如序列表中的序列I所示(Genebank序列號:JQ617302),其Tef 1-α序列如序列表中的序列2所不(Genebank序列號:JQ617305)。
[0014]本發明的有益效果如下:本發明提供的木霉菌菌株的生長速度快、產孢量大，離體對峙病原菌(尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌)抑制率分別達79.79%,73.68%,72.25%，病原菌(尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌)孢子存活率均為0.00%，針對黃瓜枯萎病、玉米莖腐病的活體防效分別為85.08%,66.67%，幾丁質酶酶活為4.0783U，β -1, 3-葡聚糖酶酶活為0.8050U，胞外蛋白酶酶活為4.8503U，抗生性次生代謝物中起拮抗作用的聚酮類、萜烯類和羧酸類占總體比重的44.44%。由上可知本發明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、強專化性的優點，應用該菌株生產的生物農藥能夠有效防治土傳病害，保證農作物、蔬菜產量的穩定增長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0016]圖1是本發明提供的ZJSX5003菌株中不同類型的抗生性次生代謝物分配比例圖?！揪唧w實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0018]本發明通過分離浙江省紹興市大頭菜蔬菜地土壤的886株野生木霉菌株，選取離體對峙尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、串珠鐮刀菌作為初篩指標，然后選取病原菌孢子存活率作為復篩指標，最后通過活體接菌防效試驗確定木霉菌菌株ZJSX5003。
[0019]實施例1、離體對峙抑菌試齡
[0020]平板對峙培養法:用滅過菌的Φ6.ι的打孔器打取培養4d左右的木霉菌和病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)菌碟，病原菌菌碟分別置于直徑90mm的培養皿平板一側，另一側接種木霉菌菌碟，兩菌碟相距4cm，并以單獨病原真菌為對照，3個重復，于28°C恒溫培養。培養5d后，采用十字交叉法分別測量處理組和對照組的病原真菌菌落直徑，分別計算出培養5d后抑制率。
[0021]菌落生長直徑(mm)=菌落直徑平均值一 6.0mm ；
[0022]菌絲生長抑制率(％)=(對照菌落生長直徑一處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑X 100。
[0023]表1菌株離體抑菌率的測定
[0024]
【權利要求】
1.一種拮抗土傳病害的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株為棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003CGMCC N0.6480。
2.如權利要求1所述的拮抗土傳病害的木霉菌菌株，其特征是，所述菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.如權利要求1所述的拮抗土傳病害的木霉菌菌株，其特征是，所述菌株的Tefl-α序列如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號】C12N1/14GK103484376SQ201310336701
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2012年9月29日
【發明者】孫瑞艷, 陳捷, 曹磊, 劉志誠, 李雅乾, 張倩月 申請人:上海交通大學