專利名稱：拮抗土傳病害的木霉菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，涉及一株木霉菌菌株，尤其涉及一種拮抗土傳病害的木霉菌菌株。
背景技術(shù)：
由于長時期的連年種植某一作物，造成土壤次生鹽潰化嚴(yán)重和土傳病害為害加劇，導(dǎo)致作物品質(zhì)降低，產(chǎn)量下降，現(xiàn)已成為制約設(shè)施農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要障礙因子。植物土傳病害是一類重要的植物病害，引起土傳病害的病原物種類很多(真菌、細(xì)菌、線蟲、病毒)，它們通常侵染植物根部，引起植物根部乃至全株的病害，造成重大的經(jīng)濟損失。其中， 土傳病原真菌目前已成為農(nóng)作物、蔬菜穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要制約因素之一。以玉米莖腐病(Corn Stalk Rot)為例簡要概述其造成經(jīng)濟損失，又稱玉米青枯病，其分布廣、危害重，世界玉米各產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，一般年份發(fā)病率為10 20%，嚴(yán)重時可達(dá)50%以上，導(dǎo)致玉米減產(chǎn)20 30%。引起玉米莖腐病的主要致病病原菌是腐霉菌、鐮刀菌、干腐菌、炭疽菌和細(xì)菌等。再以黃瓜枯萎病為例，又叫蔓割病、萎蔫病，是土壤傳播、根部侵入的一種維管束病害，一般發(fā)病率20% 30%，嚴(yán)重地塊達(dá)80% 90%，甚至全部毀種，嚴(yán)重影響黃瓜生產(chǎn)產(chǎn)量。因此，為了有效防治土傳病害、保證我國農(nóng)作物、蔬菜產(chǎn)量穩(wěn)定增長，必然需要進(jìn)行綜合防治。其中，由于生物防治綠色無害高效而廣受政府、農(nóng)莊及農(nóng)戶關(guān)注，生防微生物資源研究迫在眉睫。而作為國際公認(rèn)生防菌的木霉菌，近年來優(yōu)選菌株的應(yīng)用效果卓著，尋找高效生防能力的木霉菌株資源非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過離體對峙培養(yǎng)測定、病原菌孢子存活率測定、盆栽接種試驗指標(biāo)的篩選，提供一種新型拮抗土傳病害的木霉菌菌株，本發(fā)明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、強專化性的優(yōu)點，應(yīng)用該菌株生產(chǎn)的生物農(nóng)藥，能夠有效防治土傳病害，保證農(nóng)作物、蔬菜產(chǎn)量的穩(wěn)定增長。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種措抗土傳病咅的木霉囷囷株，所述木霉囷囷株為棘抱木霉(Trichoderma asperellum)Z JSX5003 CGMCC No. 6480。優(yōu)選地，所述菌株的ITS序列如SEQ ID NO. I所示。優(yōu)選地，所述菌株的Tefl- α序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明提供的木霉菌菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101 ;本發(fā)明菌株的信息為棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003 ;保藏號為 CGMCC No. 6480 ;保藏日期為 2012. 8. 28。菌株培養(yǎng)特征包括PDA上的最適合生長溫度為30°C，30°C生長48h菌落半徑約為31 47mm ;30°C黑暗條件下生長期間每隔8h給予短暫的熒光照射，菌落能夠形成5個同心輪紋結(jié)構(gòu)，由密集的分生孢子組成，靠近中心部位的分生孢子為黑綠色，缺乏氣生菌絲；不產(chǎn)生擴散性色素，無明顯氣味；菌落反面為奶油色，有皺褶或者有纏繞結(jié)構(gòu)。菌株形態(tài)特征包括分生孢子簇呈墊狀至半球狀，直徑為O. 5 2mm，離散分布或者匯合，散布于整個菌落或者排列為2 3個同心輪紋；分生孢子聚合體為深綠色。在分生孢子簇內(nèi)，分生孢子梗上的瓶梗呈現(xiàn)對稱分布，頂端具有兩個或多個瓶梗，瓶梗寬度為
2.8 5. 4 μ m，主軸頂端下面生出的初次分枝常呈對生，與主軸的夾角為近90° ;瓶梗典型地產(chǎn)生于初次、二次、三次分枝的頂端，較少直接產(chǎn)生于初次和二次分枝中部，2 3個瓶梗呈漩渦狀排列；瓶梗直、安瓿形，僅在中部稍微加粗，長度為7. I 11. 3 μ m，中部寬度為
3.O 5. 5 μ m，基部寬度為2. O 3. 5 μ m，基部稍微有縊縮，與其母細(xì)胞夾角約為100°。分生孢子球形至亞球形或者卵圓形，大小為3. 7 6. O μ mX 3. O 5. O μ m,沒有可見的基部脫落痕跡，有細(xì)刺結(jié)構(gòu)，但有時很難觀察到。本發(fā)明采集中國南部地區(qū)農(nóng)林土壤并于4°C保藏、分離純化菌株、離體對峙病原菌 抑制試驗(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)、病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)孢子存活率測定、活體接菌防效試驗，經(jīng)過以上步驟反復(fù)篩選，最終選出高拮抗性、強專化性的殺土傳病害的木霉菌菌株，編號為ZJSX5003。通過菌落及分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形態(tài)特征鑒定以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間區(qū)核酸序列測定和分析，確定了該菌株的分類地位木霉屬(Trichoderma Pers. ex Fr.),棘抱木霉(Trichodermaasperellum)。本發(fā)明也進(jìn)行了該菌株的生理生化測定，包括拮抗相關(guān)酶酶活(幾丁質(zhì)酶、β -I, 3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)檢測、抗生性次生代謝物提取分析，以便更好地開發(fā)利用該菌株。本發(fā)明提供的木霉菌菌株的ITS序列如序列表中的序列I所示(Genebank序列號JQ617302),其Tef I-α序列如序列表中的序列2所不(Genebank序列號JQ617305)。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供的木霉菌菌株的生長速度快、產(chǎn)孢量大，離體對峙病原菌(尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌)抑制率分別達(dá)79. 79%,73. 68%,72. 25%，病原菌(尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌)孢子存活率均為O. 00%，針對黃瓜枯萎病、玉米莖腐病的活體防效分別為85. 08%,66. 67%，幾丁質(zhì)酶酶活為4. 0783U，β -I, 3-葡聚糖酶酶活為O. 8050U，胞外蛋白酶酶活為4. 8503U，抗生性次生代謝物中起拮抗作用的聚酮類、萜烯類和羧酸類占總體比重的44. 44%。由上可知本發(fā)明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、強專化性的優(yōu)點，應(yīng)用該菌株生產(chǎn)的生物農(nóng)藥能夠有效防治土傳病害，保證農(nóng)作物、蔬菜產(chǎn)量的穩(wěn)定增長。


通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯圖I是本發(fā)明提供的ZJSX5003菌株中不同類型的抗生性次生代謝物分配比例圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過分離浙江省紹興市大頭菜蔬菜地土壤的886株野生木霉菌株，選取離體對峙尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、串珠鐮刀菌作為初篩指標(biāo)，然后選取病原菌孢子存活率作為復(fù)篩指標(biāo)，最后通過活體接菌防效試驗確定木霉菌菌株ZJSX5003。實施例I、離體對峙抑菌試齡平板對峙培養(yǎng)法用滅過菌的Φ6·ι的打孔器打取培養(yǎng)4d左右的木霉菌和病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)菌碟，病原菌菌碟分別置于直徑90mm的培養(yǎng)皿平板一側(cè)，另一側(cè)接種木霉菌菌碟，兩菌碟相距4cm，并以單獨病原真菌為對照，3個重復(fù)，于28°C恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后，采用十字交叉法分別測量處理組和對照組的病原真菌菌落直徑，分別計算出培養(yǎng)5d后抑制率。菌落生長直徑(mm)=菌落直徑平均值_6. Omm ；
菌絲生長抑制率(％)=(對照菌落生長直徑一處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑X 100。表I菌株離體抑菌率的測定
病菌抑制率(%)
菌株 ---
尖孢*刃菌串珠鋪Uj菌采谷纖刀菌
ZJSX500379.7973.68Tl. 25由表I可以看出，ZJSX5003對三株病原菌(尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌)的抑制作用較好，分別為79. 79%,73. 68%,72. 25%。實施例2、病原菌孢子存活率測定通過病原菌(尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)與生防菌孢子懸液的充分接觸作用，從活化5d的病原菌邊緣打取4片直徑5mm菌餅，將其浸入木霉菌孢懸液(IO6個/mL)中30s，然后放在鋪有3層濕濾紙的培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)，以無菌水取代木霉菌孢子懸液為對照，次日將病原菌菌餅轉(zhuǎn)接至含有l(wèi)mg/L苯菌靈選擇性培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次。第5d記錄試驗結(jié)果，最終以病原菌生長直徑及存活率表示，每個處理取其平均值。觀察病原菌的生存趨勢從而判段生防菌的防治作用。表2ZJSX5003對病原菌孢子存活率的影響
病菌―孢jV/品-率(%)
齒株 ------------—
尖抱憾刀菌屮珠鐮刀菌采荇德刀菌
ZJSX5003PO 00PO, 00PO. 00由表2可以看出，ZJSX5003對三株病原菌(尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌)孢子存活率均為00.00%。實施例3、溫室活體防治試驗
在PDA培養(yǎng)基中分別活化病原菌和木霉菌于28°C下培養(yǎng)7d，用無菌水分別沖洗培養(yǎng)基上病原菌孢子，菌液用已滅菌的濾紙過濾以除去菌絲，病原菌將濾液加適當(dāng)蒸餾水稀釋成孢子濃度為I X IO6個/mL的懸浮液，木霉菌將濾液加適當(dāng)蒸餾水稀釋成孢子濃度為I X IO7個/mL的懸浮液，備用。(I)黃瓜枯萎病防治實驗將表面消毒的黃瓜種子于雙層濕濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，每皿6粒，重復(fù)3次。無菌水保濕培養(yǎng)數(shù)日，待種子萌發(fā)退去種皮后在溫室內(nèi)用花盆栽黃瓜幼苗，待黃瓜幼苗長出3 5片葉時，將無菌水制備的黃瓜枯萎病菌的孢子懸浮液灌溉到黃瓜幼苗的根部，每株黃瓜幼苗灌根15 20mL，保濕24h后觀察發(fā)病情況；再將木霉菌孢子懸浮液灌溉到黃瓜幼苗的根部，以灌無菌水為對照，7d后觀察防治效果。黃瓜枯萎病病害分級標(biāo)準(zhǔn)0級，無可見癥狀；1級，病斑面積占整個葉盤面積的5%以下；2級，病斑占整個葉盤面積的級，病斑占整個葉盤面積的25% 50% ;4級，病斑占整個葉盤面積的50% 75% ;5級，病斑占整個葉盤面積的75%以上。 病情指數(shù)和菌株的防治效果計算方法如下病情指數(shù)=Σ (各病級株數(shù)X各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)X最高一級代表it) XlOO防效=(防治后病情指數(shù)X對照區(qū)前病情指數(shù))/(防治前病情指數(shù)X對照區(qū)后病情指數(shù))X 100。(2)玉米莖腐病防治實驗高壓滅菌處理的無菌土中灌入病原菌孢懸液，密閉發(fā)病直到紅色毛狀物出現(xiàn)。試驗采用盆栽進(jìn)行，花盆用70%酒精消毒后裝處理過的土壤至2/3處，然后每盆播經(jīng)酒精消毒過的種子，再覆2cm無菌土，壓實。出苗后每盆保苗2棵。苗期管理澆灌至3 4葉期時玉米植株發(fā)病后，再將木霉菌孢子懸浮液灌溉到玉米根部，以灌無菌水為對照，7d后調(diào)查植株根系的受害情種況及株高、根長、根數(shù)(胚根十次生根等)。玉米苗期調(diào)查病情分級標(biāo)準(zhǔn)0級，整株生長正常，無病；1級，地上地下部生長基本正常，根部可見少量病斑，病斑面積占根表總面積1/4以下，根群顏色白中有褐；2級，地上地下生長明顯受阻，葉色變淡，株高僅及對照的3/4，側(cè)根少而短，無須根，病斑連片，病斑面積占根表總面積的1/4 1/2，根群顏色白、褐相當(dāng)；3級，地上地下部生長極不正常，地上部可見青枯一黃枯狀，株高僅及對照的1/2，側(cè)根極小，病斑面積占根總面積的1/2 3/4，根群顏色褐中帶白；4級，發(fā)芽，但不出苗，幾乎窒息而死，病斑面積占根表總面積的3/4以上，根為褐色。表3菌株ZJSX5003處理對土傳病害的防治效果
權(quán)利要求
1.一種拮抗土傳病害的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株為棘孢木霉(Trichoderma asperellum) ZJSX5003 CGMCC No. 6480。
2.如權(quán)利要求I所述的拮抗土傳病害的木霉菌菌株，其特征是，所述菌株的ITS序列如SEQ ID NO. I 所示。
3.如權(quán)利要求I所述的拮抗土傳病害的木霉菌菌株，其特征是，所述菌株的Tefl-α序列如SEQ ID NO. 2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物防治領(lǐng)域的拮抗土傳病害的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJSX5003 CGMCC No.6480。本發(fā)明的木霉菌菌株的生長速度快、產(chǎn)孢量大，離體對峙病原菌抑制率分別達(dá)79.79%、73.68%、72.25%，病原菌孢子存活率均為0.00%，針對黃瓜枯萎病、玉米莖腐病的活體防效分別為85.08%、66.67%，幾丁質(zhì)酶酶活為4.0783U，β-1,3-葡聚糖酶酶活為0.8050U，胞外蛋白酶酶活為4.8503U，抗生性次生代謝物中起拮抗作用的聚酮類、萜烯類和羧酸類占總體比重的44.44%；本發(fā)明的木霉菌菌株具有高拮抗性、強專化性的優(yōu)點，應(yīng)用該菌株生產(chǎn)的生物農(nóng)藥能夠有效防治土傳病害，保證農(nóng)作物、蔬菜產(chǎn)量的穩(wěn)定增長。
文檔編號C12R1/885GK102888350SQ201210378679
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者孫瑞艷, 陳捷, 曹磊, 劉志誠, 李雅乾, 張倩月 申請人:上海交通大學(xué)