拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種生物防治領域的拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途。所述木霉菌菌株為深綠木霉（Trichoderma?atroviride）SG3403CGMCC?No.6479；同時，本發明還涉及前述木霉菌菌株在制備防治玉米莖腐病和紋枯病農藥中的用途。本發明提供的木霉菌菌株生長速度快、產孢量大、離體對峙病原菌抑制率分別達71.91%、74.77%、73.11%，幾丁質酶酶活為4.1452U，β-1,3-葡聚糖酶酶活為0.5969U，胞外蛋白酶酶活為2.4845U；本發明的菌株能夠用于生產高效且快速防治玉米莖腐病和紋枯病的生物農藥。
【專利說明】拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物防治領域，涉及一株木霉菌菌株及其用途，尤其涉及一株拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株及其用途。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著耕作和栽培制度的改變、品種輪換及高油高淀粉品種大面積種植，玉米的土傳病害有逐年加重的趨勢，一般年份發病率大約在10-30%，嚴重年份甚至可以達到60%以上，從而導致玉米產量顯著降低。因此，土傳病害已成為玉米穩產、高產的主要制約因素之一。而我國玉米的主要土傳病害有4種，即莖基腐病、絲黑穗病、紋枯病和全蝕病，其中莖基腐病和紋枯病的危害尤為嚴重。
[0003]玉米莖腐病(Corn Stalk Rot)，又稱玉米青枯病，其分布廣、危害重，世界玉米各產區均普遍發生，給玉米生產造成很大損失，一般年份發病率為10-20%，嚴重時可達50%以上，導致玉米減產20-30%。絕大多數研究證明，引起玉米莖腐病的病原菌是一個致病菌的群體，而且不同地區的病原菌不完全相同，或完全不同。目前，從病殘體中分離到的致病菌有腐霉菌、鐮刀菌、干腐菌、炭疽菌和細菌等。國內近年來有關莖腐病病原菌的種類存在3種不同的觀點:腐霉菌是主要的致病菌；鐮刀菌是主要致病菌；腐霉菌和鐮刀菌復合侵染所致。
[0004]玉米紋枯病(Rhizoctonia solani)是世界上玉米產區廣泛發生、危害嚴重的世界性病害之一，在我國始見于1966年的吉林省，后在四川、貴州、江蘇、浙江、河南、河北、安徽、遼寧、黑龍江、吉林、山西、陜西、山東等省及兩湖、兩廣地區的春、夏、秋玉米均有發生。20世紀70年代后，隨著玉米種植面積的擴大，雜交種的推廣應用，施肥量及種植密度的提高，玉米紋枯病的發生、發展和蔓`延日趨嚴重；特別在我國西南玉米種植地區，由于玉米生長期氣溫高、濕度大，紋枯病已經成為玉米第一大病害研究發現，目前其紋主要病原菌是立枯絲核菌。
[0005]為了有效防治以上玉米病害、保證我國玉米產量穩定增長，必然需要進行玉米病害的綜合防治，即從玉米田間生態系統的整體觀念出發，以農業防治為基礎，協調運用生物防治和化學防治等各項措施，將病害的發生為害控制在經濟允許損失水平以下，實現經濟、生態和社會的三大效益。其中，生物防治廣受政府、農莊及農戶關注，生防微生物資源研究中高效拮抗菌株成為重中之重。而木霉菌，作為國際公認的生防菌，尋找具高效生防能力的木霉菌株迫在眉睫。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是通過對峙培養測定、拮抗相關酶活測定、盆栽接種試驗及抗生性次生代謝物提取分析的方法，提供一種高拮抗性、強專化性的拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株，該菌株能夠用于生產高效且快速防治玉米莖腐病和紋枯病的生物農藥。
[0007]本發明是通過以下的技術方案實現的，[0008]第一方面，本發明涉及一種拮抗玉米莖腐病和紋枯病的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株為深綠木霉(Trichoderma atroviride) SG3403CGMCC N0.6479。
[0009]優選地，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]第二方面，本發明還涉及前述木霉菌菌株在制備防治玉米莖腐病和紋枯病農藥中的用途。
[0011]本發明提供的木霉菌菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101 ;本發明菌株的信息為:深綠木霉(Trichoderma atroviride) SG3403 ;保藏號為CGMCC N0.6479 ;保藏日期為 2012.8.28。
[0012]菌株培養特征包括:在PDA和SNA上的最適合生長溫度為25_30°C，25°C PDA培養3d,菌落半徑為 42.8-60.5mm ；25°C SNA 培養 3d，菌落半徑為 22.2-35.5mm。在 PDA 上 30°C培養96h，菌落邊界清晰，中央有一菌絲相對致密的圓盤狀結構，是分生孢子的主要產生區域；一般沒有分生孢子堆，有椰子氣味(甜味)。
[0013]菌株形態特征包括:分生孢子梗的可育延伸物沒有或者很少產生，沒有不育的菌毛；雖然成對著生的分枝比較常見，但分生孢子梗的典型分枝方式為單側分枝，分枝角度為近似90°。瓶梗長度為4.2~15.0ym,長寬比值為1.1~6.3，直或者彎曲，有時候為鉤狀；2~4個呈漩渦狀排列，常為單生；漩渦狀排列中的最頂端瓶梗及單生瓶梗一般為圓柱形，只在尖端下部縊縮，形成細頸樣形狀；尖端下面著生的瓶梗為燒瓶形，中部膨大，至頂縊縮，基部稍微縊縮；瓶梗的支持細胞寬度與瓶梗基部相似。沒有間生瓶梗。分生孢子綠色，亞球形至卵圓形，沒有明顯的脫落痕跡，光滑，3.0~5.0μ mX2.3~4.Ομπι,長寬比值為
0.8~1.6，干燥。
[0014]本發明采集華東地區農田土壤，并于4°C保藏，再分離純化菌株，然后依次進行離體對峙病原菌抑制試驗(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)、檢測拮抗相關酶酶活(幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)和活體接菌防效試驗，經過以上步驟反復篩選，最終選出高拮抗性、強專化性的殺玉米莖腐病和紋枯病病害的木霉菌菌株，編號為SG3403。為了該菌株更好地開發利用，進行了抗生性次生代謝物質分析，明確了在拮抗中起作用的物質的比例。通過菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形態特征鑒定以及內轉錄基因間區核酸序列測定和分析，其ITS序列如序列表中的序列I所示，從而確定了該菌株的分類地位:木霉屬(Trichoderma Pers.ex Fr.),深綠木霉(Trichoderma atroviride)。
[0015]本發明提供的木霉菌菌株生長速度快、產孢量大、離體對峙病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)抑制率分別達71.91%,74.77%,73.11%，幾丁質酶酶活為4.1452U，β -1, 3-葡聚糖酶酶活為0.5969U，胞外蛋白酶酶活為2.4845U。該菌株能夠用于生產高效且快速防治玉米莖腐病和紋枯病的生物農藥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0017]圖1為本發明SG3403菌株中不同類型的抗生性次生代謝物分配比例結果圖。【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0019]本發明通過采集山東省壽光市芹菜蔬菜地土壤，并于4°C保藏土壤，再分離純化野生菌株1026株木霉菌，然后依次進行離體對峙病原菌抑制試驗(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)、檢測拮抗相關酶酶活(幾丁質酶、β -1, 3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶)、活體接菌防效試驗和抗生性次生代謝物提取分析，經過以上步驟反復篩選，最終選出高拮抗性、強專化性的殺玉米莖腐病和紋枯病病害的木霉菌菌株，編號為木霉菌SG3403。并通過菌株的菌落、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形態特征鑒定以及內轉錄基因間區核酸序列測定和分析確定該菌株的分類地位。
[0020]實施例1為離體對峙抑菌試驗，實施例2~4為拮抗相關酶的酶活檢測試驗，實施例5為活體接菌防效試驗，實施例6~7為抗生性次生代謝物提取分析試驗。
[0021]實施例1、離體對峙抑菌試齡
[0022]制備PDA平板，用打孔器自培養3d的供試木霉菌和3株病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)菌落邊緣分別打取直徑5mm的菌塊，分別移植在平板相對的兩側中央，相距約5cm，28°C恒溫倒置培養，重復3次，以僅接種病原菌的平板作為對照。接種144h后分別測量三株病原菌的直線生長距離和S。,，按如下公式計算抑制率:抑制率(%)= (Sck-St)/SekX 100%，其中Sek表示對照組接種病原菌株144h后的直線生長距離；St表示對峙培養組接種病原菌株144h后的直線生長距離。
[0023]表1菌株離體抑菌率`的測定結果
[0024]

病If抑制寧(%)
菌株 ---
禾谷鐮刀w?I'.珠鐮刀菌立枯鎿核眞
[ S(；:M03 —71.91~74.7773.11
[0025]由表1可以看出，SG3403對三株病原菌(串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、立枯絲核菌)的抑制作用較好，分別為71.91%,74.77%,73.11%。
[0026]實施例2、幾丁質酶酶活力檢測
[0027]將木霉菌株接種到PDA培養基平板(直徑90mm)上，在光照恒溫恒濕培養箱25°C、60%濕度培養5d。把長滿木霉的平板用滅菌水浸泡3-5min，用棉簽輕輕刮洗下孢子及菌絲體，脫脂棉或4層紗布過濾除去菌絲體，濾液即為孢子懸浮液。根據血球記數板法進行計數，稀釋后孢子懸浮液濃度為IO6個.mL—1孢子量。
[0028]配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)(色譜純，Sigma Chemical C0.P.0., Germany)的Img.mL—1的標準溶液，取6支25 X 250mm試管，按表2加入試劑，將各管混勻，在沸水中準確煮5min，取出后立即冷卻至室溫，再向各試管加入21.5mL蒸餾水，搖均。稀釋后各管NAG的濃度依次為0、8、12、16、20、24、28 ( μ g/mL)。先對7管樣品通過紫外分光光度計在200-700nm范圍進行全波掃描，得到其最大吸收值的波長。再對上述7支管在最大光吸收(OD)值的波長下按NAG濃度從低到高測定吸光值，以NAG濃度(μ g/mL)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制出標準曲線。
[0029]表2建立NAG標準曲線的試劑
[0030]
【權利要求】
1.一種措抗玉米3；腐病和紋枯病的木霉囷囷株，其特征在于，所述木霉囷囷株為深綠木霉(Trichoderma atroviride) SG3403CGMCC N0.6479。
2.根據權利要求1所述的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQID N0.1 所示。
3.—種如權利要求1所述的木霉菌菌株在制備防治玉米莖腐病和紋枯病農藥中的用途。
【文檔編號】C12N1/14GK103484377SQ201310336703
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2012年9月29日
【發明者】孫瑞艷, 陳捷, 曹磊, 劉志誠, 李雅乾, 姚麗美, 林振亞 申請人:上海交通大學