專利名稱：土傳病害鑒定病圃的建立方法
技術領域：
本發明涉及植物病害防治領域，具體涉及土傳病害鑒定病圃的建立方法。
背景技術：
對植物病害防治的研究，尤其是植物土傳病害防治的研究，建立合適的病圃對于研究植物的抗病性鑒定和抗病育種意義非常重大。病圃的設置與利用是進行抗病性鑒定的基本條件，沒有重而均勻的發病條件就難以對植物品種資源的抗病性做出可靠的鑒定。合適均勻病圃的建立，一方面關系到對植物的抗病性鑒定是否準確可靠，鑒定結論是否可信，能否用于指導科研生產；另一方面，對于植物的抗病育種也至關重要，它能對育種材料或品種的抗性進行最全面、嚴格的考驗，鑒定 出適合在生產中應用的材料或品種，合適均勻的病圃可以利于促進抗病育種的選育步伐。病圃的建立可分為天然病圃和常規人工病圃。天然病圃是指在連年耕作的常規農田中，局部或部分面積地塊病原菌逐年積累，自然形成的重病塊或重病區，人們選擇這部分田塊作為天然病圃。天然病圃的選擇建立有其特定的缺點和不足①發病不均勻天然病圃土壤中病原菌含量不均勻、相差較大，表現為局部地塊發病很重、局部地塊發病很輕的情況，這無論對抗病性鑒定還是抗病品種選育都不準確，容易造成偏差。②病原菌生理小種不可控很多土傳病害，存在不同的生理小種，各生理小種之間，致病力有所不同，所以，無論選擇致病力極強的生理小種還是選擇致病力極弱的生理小種，都不能很好地反映出植物的抗病性，而天然病圃中病原菌的生理小種存在不確定性，致病力過強或過弱都不適宜植物的抗病性鑒定和抗病品種的選育。③病圃位置存在隱患絕大多數土傳病害都屬于檢疫性病害，因為科研工作的需要，建立土傳病圃時，一般都遵循植物檢疫的原則，做到有效杜絕病原物的外傳，保持農業生產區的純凈。而天然病圃大多都在農田區域范圍內，具有潛在擴散傳播的危險性，使得機耕、灌溉等農事操作及農產品種子、苗木、莖桿及果實的運輸帶來不便。常規人工病圃是指人為把病原菌從病株上分離出來，經純化后在特定培養基上擴大培養，待長滿整個培養基后，將病原菌和培養基一同撒施到規劃好的區域內，建立土傳病害病圃的ー種方法。常規的人工病圃建立也有其缺點和不足的地方①常規人工病圃費時耗力，耗費大量物資。常規人工病圃需要制作大量的培養基，常見培養基有大麥、小麥、棉子殼、麥麩等的混合物，需要把這些物質進行浸泡處理、裝袋密封及高壓滅菌工作，用量大，費エ費時，消耗水電。②操作過程容易污染，對環境要求高整個培養基制作、滅菌、接種以及存放等均需要無菌的環境，ー不小心容易造成雜菌感染，培養基接種后還要需要大量潔凈的空間存放培養，對環境要求高。③常規人工病圃效率低下，エ效不高，エ期較長。常規人工病圃的建立需要大量的接種物，如果建立面積較大的病圃，處理起來非常麻煩，功效很低，需要連續多年才能建造成比較成熟的病圃。④常規人工病圃也存在不均勻的現象。人エ培養的培養基及病原菌混合物雖然可以在撒入土壌中做到盡量均勻，但是，因為人工培養基多為固體團粒狀，無法均勻撒開，且病原菌的菌絲體或孢子生長不一致，所以常規人工病圃也存在局部很重，局部很輕的情況。

發明內容
本發明的目的就是針對上述現有技術中運用方法繁復、成本偏高、費エ費時、病圃均勻性低等缺陷，提供了一種土傳病害鑒定病圃的建立方法。為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為土傳病害鑒定病圃的建立方法，包括以下步驟
1)病原物的分離純化將病原物從植物病株中分離出來后，進行單孢分離并純化后得到病原物單菌落；
2)菌落培養將步驟I)得到的培養好的病原物單菌落，用打孔器沿菌落邊緣打取直徑 為IOmm的菌塊，接種于馬鈴薯PDA培養基上，28°C培養5_7天，之后將培養好的病原物菌落連同馬鈴薯PDA培養基全部接入查氏培養液中進行培養，并于28°C搖床培養4-5天，搖床轉速為120轉/分，得到孢子懸浮液，再以無菌水配制成濃度為I X IO7個/ml的病原物孢子懸浮液；
3)二次培養將步驟2)得到的病原物孢子懸浮液按照1:40體積比例接入到查氏培養液中，靜置培養10天，以監測孢子量大于等于I X IO7個/ml為達到所需標準，得到可接種孢子液；
4)接入病圃將步驟3)得到的可接種孢子液按照每畝地IOOkg接種量施入病圃中，分別在植物生長的第30、50、70和90天施入。進ー步的，所述步驟I)中，病原物為土壤習居菌，屬于土傳病害可以利用此方法。進ー步的，所述步驟2)中，馬鈴薯PDA培養基中各組分比例為按照質量比馬鈴薯甸甸糖:瓊月旨:水為100 9 9 :382。進ー步的，所述步驟2)中，病原物單菌落接種于馬鈴薯PDA培養基上，280C培養6天。進ー步的，所述步驟2)中，查氏培養液中各組分比例為按照質量比硝酸鉀磷酸~-氣鐘:硫fe續氣化鐘硫Ife亞鐵庶糖水為2 I 0. 5 0. 5 0. 01 30 :1000。本發明的有益效果為本發明提供的技術方案，具有以下效果
1、以前的常規人工建立病圃的方法是費時耗力，耗費大量物資，本技術方案可以節省大量的培養基物質，省去固體培養基浸泡處理、裝袋密封、高壓滅菌以及人工接菌等繁瑣過程，直接接入液體查氏培養基中即可，省時省エ，可節省大量成本；
2、以前的常規人工建立病圃的方法容易引起雜菌的感染，本技術方案直接接入到液體培養基中，密封性好，不容易混入雜菌，減少了常規接種等復雜操作過程中不慎混入雜菌的感染的可能性；
3、本技術方案可以減少操作步驟，提高工作效率，可以大批量制備，液體查氏培養基易于制備，簡單可行，無需復雜操作；
4、通過滴灌的方式隨水滴施進入病圃的方法均勻性好，病原菌孢子可以均勻分布到土壌中，而且直接在土壌中定殖，利于侵染寄主植物，避免常規人工接種過程中在田間撒施時，因為風吹日曬、紫外線輻射使部分病原菌菌絲及孢子死亡的現象發生。
具體實施例方式實施例I :
棉花枯萎病病圃的建立
1)從棉花枯萎病株體中分離純化出枯萎病單菌落，編號為XH-I，保存備用；
2)將編號為XH-I的枯萎病單菌落接種于制備好的馬鈴薯PDA培養基上，置于28°C霉菌培養箱中培養5 7天，至菌落長滿整個培養皿；
3)沿菌落邊緣打成直徑IOmm的菌餅，在超凈工作臺上接到500ml三角錐形瓶的查氏培養液中，每IOOml培養液接入3片菌餅，每瓶接入10片菌餅(因每個三角錐形瓶裝入查氏培養液體積約為330ml)；
4)置于120轉/分，溫度設置為28°C的搖床上，搖培4-5天后，得到孢子懸浮液，用無·菌水調節成I X 107孢子懸浮液；
5)然后將其按1:40比例接到體積為20L密閉容器裝入4/5體積滅菌好的查氏培養液中，靜置培養10天，當監測孢子量ミI X IO7個/ml吋，即可接種；
6)按照姆畝地IOOkg接種量隨水滴施進入病圃中,在整個棉花生長季節的第30天、50天、70天和90天連續施入4次。查氏培養液中各組分比例為按照質量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0實施例2:
棉花黃萎病病圃的建立
1)從棉花黃萎病株體中分離純化出黃萎病單菌落，編號為143T-5，保存備用；
2)將編號為143T-5的黃萎病單菌落接種于制備好的PDA培養基上，置于28°C霉菌培養箱中培養5 7天，至菌落長滿整個培養皿；
3)沿菌落邊緣打成直徑IOmm的菌餅，在超凈工作臺上接到500ml三角錐形瓶的查氏培養液中，每IOOml培養液接入3片菌餅，每瓶接入10片菌餅(因每個三角錐形瓶裝入查氏培養液體積約為330ml)；
4)置于120轉/分，溫度設置為28°C的搖床上，搖培4-5天后，得到孢子懸浮液，用無菌水調節成I X 107孢子懸浮液；
5)然后將其按1:40比例接到體積為20L密閉容器裝入4/5體積滅菌好的查氏培養液中，靜置培養10天，當監測孢子量彡IX 107個/ml吋，即可接種；
6)按照姆畝地IOOkg接種量隨水滴施進入病圃中,在整個棉花生長季節的第30天、50天、70天和90天連續施入4次。查氏培養液中各組分比例為按照質量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0實施例3:
向日葵菌核病病圃的建立
1)從向日葵菌核病株體中分離純化出菌核病單菌落，編號為BTU-10，保存備用；
2)將編號為BTU-10的菌核病單菌落接種于制備好的PDA培養基上，置于28°C霉菌培養箱中培養5 7天，至菌落長滿整個培養皿；
3)沿菌落邊緣打成直徑IOmm的菌餅，在超凈工作臺上接到500ml三角錐形瓶的查氏培養液中，每IOOml培養液接入3片菌餅，每瓶接入10片菌餅(因每個三角錐形瓶裝入查氏培養液體積約為330ml)；
4)置于120轉/分，溫度設置為28°C的搖床上，搖培4-5天后，得到孢子懸浮液，用無菌水調節成I X 107孢子懸浮液；
5)然后將其按1:40比例接到體積為20L密閉容器裝入4/5體積滅菌好的查氏培養液中，靜置培養10天，當監測孢子量彡IX 107個/ml吋，即可接種；
6)按照姆畝地IOOkg接種量隨水滴施進入病圃中,在整個向日葵生長季節的第30天、50天、70天和90天連續施入4次。查氏培養液中各組分比例為按照質量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0最后應說明的是以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，包括以下步驟 1)病原物的分離純化將病原物從植物病株中分離出來后，進行單孢分離并純化后得到病原物單菌落； 2)菌落培養將步驟I)得到的培養好的病原物單菌落，用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為IOmm的菌塊，接種于馬鈴薯PDA培養基上，28°C培養5_7天，之后將培養好的病原物菌落連同馬鈴薯PDA培養基全部接入查氏培養液中進行培養，并于28°C搖床培養4-5天，搖床轉速為120轉/分，得到孢子懸浮液，再以無菌水配制成濃度為I X IO7個/ml的病原物孢子懸浮液； 3)二次培養將步驟2)得到的病原物孢子懸浮液按照1:40體積比例接入到查氏培養液中，靜置培養10天，以監測孢子量大于等于I X IO7個/ml為達到所需標準，得到可接種孢子液； 4)接入病圃將步驟3)得到的可接種孢子液按照每畝地IOOkg接種量施入病圃中，分別在植物生長的第30、50、70和90天施入。
2.根據權利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟I)中，病原物為土壤習居菌。
3.根據權利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟2)中，馬鈴薯PDA培養基中各組分比例為按照質量比馬鈴薯葡萄糖瓊脂 水為100 9 9 :382。
4.根據權利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟2)中，病原物單菌落接種于馬鈴薯PDA培養基上，28°C培養6天。
5.根據權利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟2)中，查氏培養液中各組分比例為按照質量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖 水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0
全文摘要
本發明公開了土傳病害鑒定病圃的建立方法，包括以下步驟1)病原物的分離純化；2)菌落培養；3)二次培養；4)接入病圃。本發明的有益效果為1、節省大量的培養基物質，省去固體培養基浸泡處理、裝袋密封、高壓滅菌以及人工接菌等繁瑣過程，可節省大量成本；2、直接接入到液體培養基中，密封性好，不容易混入雜菌，減少了常規接種等復雜操作過程中不慎混入雜菌的感染的可能性；3、可以減少操作步驟，提高工作效率，可以大批量制備，液體查氏培養基易于制備，簡單可行，無需復雜操作；4、通過滴灌的方式隨水滴施進入病圃的方法均勻性好，利于侵染寄主植物。
文檔編號C12N3/00GK102835288SQ201210309640
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者劉政, 孫艷, 余渝, 林海, 劉麗, 陳兵, 韓煥勇, 王方勇, 董承光, 宿俊吉 申請人:新疆農墾科學院