一種全細胞催化制備(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種全細胞催化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）為底物，利用生物催化劑在以異丙醇為氫供體的條件下，然后加入CaCl2、重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞，于溫度25℃～40℃下攪拌，在pH為6.0～8.0的水相中不對稱還原反應生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯；利用細胞本身的輔酶再生體系，無需添加外源性的輔酶，解決了傳統生物法中催化效率低以及成本高的問題，該方法反應條件溫和、反應效率高、操作簡便，特別是催化反應過程不用加還原性輔酶因子，大大提高了效率和降低了反應的成本，具有廣闊的工業生產應用前景。
【專利說明】一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物合成領域，尤其涉及一種全細胞催化制備（S) -4-氯-3-羥基丁酸 乙酯的方法。

【背景技術】
[0002] (S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯（（S)-CHBE)是一種重要的有機合成中間體，可用于 很多活性藥物的合成，如他汀類降血脂藥HMG-CoA還原酶抑制劑類、Slagenins B和C以及 P-1，4-二氫吡啶型鈣離子通道阻斷劑等。他汀類藥物是目前最暢銷的降血脂類藥物，隨著 阿托伐他汀專利的到期，市場對其中間體（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的需求量會進一步加 大。
[0003] 以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)為底物合成（S)-CHBE是非常有效經濟的制備途徑， COBE易于合成且價格低廉。目前關于COBE不對稱手性還原制備（S)-CHBE以進行了很多的 研究報道，概括起來主要有化學法和生物法。化學法催化的不對稱還原，所用的催化劑包括 銠、釕等昂貴金屬，最關鍵的是采用化學法合成的（S)-CHBE立體選擇性不夠高，催化還原 反應需要很高的氫氣壓，耗能高，污染尤其嚴重，對環境影響很大。
[0004] 生物法以其所具有的反應條件溫和、立體專一性強、轉化率高等特點被廣泛 地研究和應用。中國發明專利申請例如申請號200810124754. 2、201010213724. 6、 201110225388. 1等公開了數種酮還原酶生產（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，然 而這些方法的酶和輔因子用量較高，并需要添加葡萄糖作為氫供體。國內專利申請號 201210465009. 0公開了一種異丙醇作為氫供體的催化方法，所用的為酮還原酶凍干粉，酶 凍干粉的生產成本較高，而且在反應中也需加入價格昂貴的輔因子，反應體系中添加了有 機溶劑，不僅成本較高，不符合綠色化學催化的理念。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種反應步驟簡單、成 本較低、產品光學純度高、的（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的制備方法。
[0006] 為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種全細胞催化制備 (S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，利用生物催化劑 在以異丙醇為氫供體的條件下，在水相中不對稱還原反應生成（S)-4_氯-3-羥基丁酸乙 酯，所述不對稱還原反應在pH為6. 0?8. 0的水相緩沖液中進行，在反應容器中加入配 制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底物C0BE、異丙醇、CaCl2、重組酮還原酶的大腸桿菌 全細胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應，利用氣相色譜方法檢測反應進程，至轉化率達到 80 %?100%，分批加入底物C0BE;繼續進行反應，至反應轉化率達到95%?100 %時結束 反應，加入二氯甲烷多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙 酯；本發明的催化方法綠色無污染，無需添加有機溶劑和還原性輔因子，效率高、成本低、步 驟少，簡便易操作。
[0007] 本發明所述的底物COBE和其他基本的化學試劑由市售購得，所述的含有重組酮 還原酶的大腸桿菌由本公司專利201310345823. 3中所制得。

【權利要求】
1. 一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸 乙酯（COBE)為底物，利用生物催化劑在以異丙醇為氫供體的條件下，在水相中不對稱還原 反應生成（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于：所述不對稱還原反應在pH為6. 0? 8. 0的水相緩沖液中進行，在反應容器中加入配制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底 物COBE、異丙醇、CaCl2、重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應， 利用氣相色譜方法檢測反應進程，至轉化率達到80 %?100%，分批加入底物COBE ;繼續進 行反應，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入二氯甲烷多次萃取，合并有機相 并蒸發脫去溶劑，即得（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
2. 根據權利要求1所述的一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其 特征在于，所述含有重組酮還原酶的大腸桿菌細胞的制備方法為： 1) 將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養 基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時； 2) 將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖 床180-220rpm振蕩培養，培養至0D6(I(I值達到0. 8?1. 2時，加入誘導劑，于22?32°C下繼 續培養16?20小時； 3) 培養完成后在4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體兩遍，再次離心收集菌體 即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞。
3. 根據權利要求1和所述的一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的反應體系中底物COBE的終濃度為20%?30% (w/v)，重組酮還原酶的 大腸桿菌細胞的用量為底物質量的1.0%?4.0% (w/w)，異丙醇的濃度為8%?13% (w/ v)。
4. 根據權利要求1所述的一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述的水相緩沖液濃度為50?200mM， pH6. 2 ?6. 8。
5. 根據權利要求1所述的一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其 特征在于，所述的反應體系中所用的為CaCl2，濃度為2. 0-20mM。
6. 根據權利要求1所述的一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述底物COBE根據反應情況分1?5批補加，每批次補加量為反應體積的 3%-15%。
7. 根據權利要求1所述的一種全細胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的誘導劑為異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG)，其誘導終濃度為0. 2? 1. OmM。
【文檔編號】C12P7/62GK104372041SQ201310348621
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司