一種連續(xù)制備他汀藥物中間體(r)-3-羥基戊二酸乙酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種連續(xù)制備他汀藥物中間體(R)-3-羥基戊二酸乙酯的方法，包括以下工藝步驟：第一步(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重組鹵醇脫鹵酶（HHDH）的催化下生成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯在重組腈水解酶（NIT）的催化下生成(R)-3-羥基戊二酸乙酯，所述的兩個(gè)反應(yīng)步驟均在反應(yīng)罐中的水溶液中催化反應(yīng)；本發(fā)明通過兩步耦聯(lián)生物催化反應(yīng)，采用特定的鹵醇脫鹵酶和腈水解酶，連續(xù)催化制備他汀類藥物的關(guān)鍵中間體，兩步串聯(lián)的連續(xù)綠色催化反應(yīng)，無(wú)需提出中間體即可進(jìn)行下一步反應(yīng)，可連續(xù)操作、設(shè)備利用率高、成本低、簡(jiǎn)便易操作。
【專利說(shuō)明】一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種兩步生物催化耦聯(lián)制備他汀藥物中 間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物已是世界上銷量最大，療效穩(wěn)定的降脂類藥物。其中最有代表性的是 阿托伐他汀（Atorvastatin)和瑞舒伐他汀（Rosuvastatin),前者是世界上首款銷售額突 破百億美金的藥物，而后者則是迄今為止降脂效果最好的他汀類藥物，又被成為"超級(jí)他 汀"。瑞舒伐他汀由阿斯利康公司開發(fā)（英文商品名Crestor)，于2002年11月首次在荷蘭 獲批，2003年8月通過美國(guó)FDA上市審批，2011年在全球銷售額66.2億美元。（R)-3-羥 基戊二酸乙酯是合成瑞舒伐他汀的重要手性前體。

【權(quán)利要求】
1. 一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，包括以 下工藝步驟：第一步（S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯（（S)-CHBE)在含有重組鹵醇脫鹵酶（HHDH) 的催化下生成（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，第二步（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯在重 組腈水解酶（NIT)的催化下生成（R)-3-羥基戊二酸乙酯，所述的兩個(gè)反應(yīng)步驟均在反應(yīng)罐 中的7iC溶液中偶化皮應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述的制備裝置包括反應(yīng)罐1和反應(yīng)罐2,反應(yīng)罐中設(shè)有攪拌裝置，反應(yīng)罐 1和反應(yīng)罐2通過帶有流量調(diào)節(jié)閥的管路相連接，反應(yīng)罐1上設(shè)有底物添加管路，pH控制管 路和重組鹵醇脫鹵酶添加管路，反應(yīng)罐2上設(shè)有重組腈水解酶添加管路和產(chǎn)物出口管。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，所述的制備方法為： 1) 以（S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯為底物加入含氰化鈉水溶液的的反應(yīng)罐1中，接著加 入重組鹵醇脫鹵酶進(jìn)行催化反應(yīng)；重組鹵醇脫鹵酶的用量為底物質(zhì)量的2%?15% (w/w)， 氰化鈉的用量為底物質(zhì)量的5%?20% (w/w);所述反應(yīng)在pH為6. O?8. O的水相中進(jìn)行， 反應(yīng)體系的溫度為40?55°C ;當(dāng)通過氣相色譜法測(cè)得混合液體中的底物轉(zhuǎn)化率大于95% 時(shí),開始通過添加管路流加底物（S)-CHBE和鹵醇脫鹵酶液，同時(shí)打開兩個(gè)反應(yīng)罐間的流量 調(diào)節(jié)閥，保持反應(yīng)罐1中的反應(yīng)體積不變； 2) 在反應(yīng)罐2中起始加入腈水解酶緩沖液到最低攪拌葉處，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度至25? 30°C，當(dāng)從反應(yīng)罐1中開始流出含中間體（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的反應(yīng)液時(shí)，同時(shí) 以反應(yīng)罐2中加入腈水解酶粗酶液；腈水解酶粗酶液的用量為底物質(zhì)量的20%?60% ;液 收集反應(yīng)罐2產(chǎn)物出口管流出的反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2. 0,硅藻土過濾除酶，等體積乙 酸乙酯萃取水相3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉除水，旋蒸，即得產(chǎn)品（R)-3-羥基戊二酸已 酯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，所述從反應(yīng)罐1流向反應(yīng)罐2的速率為反應(yīng)體系流加速率，所述反應(yīng) 罐1中底物流加速率、鹵醇脫鹵酶液、氰化鈉溶液流加速率三者之和等于反應(yīng)體系流加速 率。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述反應(yīng)罐1中的氰化鈉溶液通過磷酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值；反應(yīng)罐1中 優(yōu)選的pH為6. 8?7. 2,反應(yīng)溫度為48?50°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，反應(yīng)罐1中底物的流加速率為反應(yīng)體系流加速率的1%?5%，鹵醇脫鹵 酶液的流加速率為反應(yīng)體系流加速率的5%?25% ;反應(yīng)罐2中腈水解酶粗酶液的流加速率 為反應(yīng)體系流加速率的〇. 5%?2%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述的鹵醇脫鹵酶液按粗酶液：去離子水=1 :60的比例配制。
8.根據(jù)權(quán)利要求3和所述的一種連續(xù)制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的 方法，其特征在于，所述的含有重組鹵醇脫鹵酶HHDH和腈水解酶NIT的制備方法為：將含有 重組鹵醇脫鹵酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重組大腸桿菌單菌落分別接種到含卡那霉素 抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)4?8小時(shí)，將培養(yǎng)得 到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振 蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD 6tltl值達(dá)到0. 8?1. 2時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG) 至終濃度ImM，于22?32°C下繼續(xù)培養(yǎng)16?20小時(shí)，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水 清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用2?8倍體積的三乙醇胺緩沖液（2mM，pH7. 0)懸浮細(xì) 胞；細(xì)胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘；1：下15000g離心30min，取上清液，得 重組鹵醇脫鹵酶HHDH和腈水解酶NIT的粗酶液。
【文檔編號(hào)】C12P7/62GK104372040SQ201310348620
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】陳令偉 申請(qǐng)人:南京朗恩生物科技有限公司