一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG及其編碼的蛋白與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及植物基因工程領域，提供了一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。構建MpSRG重組植物表達載體，用農桿菌轉化擬南芥，獲得轉MpSRG基因擬南芥，結果表明MpSRG基因在擬南芥中超表達，提高了轉基因擬南芥的耐鹽性，證明MpSRG基因具有提高植物耐逆性的作用。
【專利說明】一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG及其編碼的蛋白與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物基因工程領域，尤其涉及一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG及其編碼的蛋白質與應用。
【背景技術】
[0002]鹽堿、干旱等非生物脅迫影響著農作物的生長發育，嚴重時甚至導致作物死亡。為了提高農作物產量，培育耐逆性作物品種是主要的應對方法之一。目前，通過基因工程的方法育種已經成為培育耐逆性作物的重要方法之一。高等植物可以通過多種途徑來應對環境中的這些不利因素。隨著測序技術的發展，尤其是轉錄組測序技術的廣泛應用，人們在植物體內發現了很多功能未知的基因可能參與了植物耐逆調控。這些新的基因功能未知，有些也沒有發現保守結構域，對其所發揮的機理也知之甚少。人們從苜蓿、鷹嘴豆、沙冬青和大豆等不同豆科植物中克隆到了許多功能未知的基因，然而還未從水黃皮中克隆到與非生物逆境相關的基因。
[0003]水黃皮為典型的半紅樹植物，既能生長于海岸或沿河的灘涂地區，又可在遠離海邊的陸地上生長，對土壤鹽度表現出廣泛的適應性，因而是研究植物耐逆性的良好材料。同時，作為豆科植物，水黃皮的基因資源將可通過轉基因技術應用于大豆或其它農作物的品種改良。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG,其喊基序列如SEQ IDNO:1所示。在本發明中，所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG的具體堿基序列長度為402bp，如SEQ ID NO:1 所示:
[0005]
atgcttcaca caatcaaaac ggttttacac tatccaccag tttcattccc acggtctctc 60 tcttcaaacc ttggtagaga aacttccgca cttagattct gcaccgaacc tgatcgtact 120 aacaacacac agagtgctca taagHtggac gacaagactc agaagccaag tgaggaaaat 180 actcatactc atggggacgc gatgtctcat tcgtt.tgggg tagggtatgc cacgaggtca 240 gatgaagaag gatttggggg aertttatggt ggaaaccaat ccattcccaa gacagagacg 300 gataaatacg tacatgaaaa tcactcagct tatgacasga cacagggaag cgaggggaag 360 gagaaggaaa aagctgggca ccggaccaac gctaatgctt aa420
[0006]在本發明中，將SEQ ID NO:1所示的基因序列命名為MpSRG。
[0007]本發明的第二個目的在于提供一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。在本發明中，水黃皮耐逆相關基因MpSRG編碼的蛋白質的具體長度為133aa， 如SEQ ID NO:2所示:
[0008]Met Leu His Thr He Lys Thr Val Leu His Tyr Pro Pro Val Ser Phe Pro Arg Ser
151015
Leu Ser Ser Asn Leu Gly Arg Glu Thr Ser Ala Leu Arg Phe Cys Thr Glu Pro Asp
20253035
Arg Thr Asi \ n Thr Gln Ser Ala His Lys Met Asp Asp Ly、Thi Gln Lys Pro Ser
40455U55
Glu Glu Asn Thr His Thr His Gly Asp Ala Met Ser His Ser Phe Gly Val Gly Tyr
60657075
Ala Thr Arg Ser Asp Glu Glu Gly Phe Gly Gly He Tyr Gly Gly A i bin Ser He
80859095
Pro Lys Thr Glu Thr Asp Lys Tyr Val His Glu Asn His Ser Ala Tyr Asp Lys Thr

100105HO
Gln Gly Ser Glti Gly Lys Glu Lys Glu Lys Ala Gly His Arg Thr Asn Ala Asn Ala
115120125130
[0009]本發明的第三個目的在于提供一種含有所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG的重組載體。
[0010]所述重組載體為重組植物表達載體。所述重組載體可以通過將上述水黃皮耐逆相關基因MpSRG插入到克隆載體或表達載體而得到。
[0011]適于構建本發明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T、pMD19-T Simple Vecter、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等。
[0012]適于構建本發明所述的表達載體包括但不限于，例如:pBI121、pl3W4、pGEM等。
[0013]重組植物表達載體包括但不限于雙元農桿菌表達載體、可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。
[0014]使用MpSRG構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
[0015]為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因,直接以逆境篩選轉化植株。
[0016]本發明的第四個目的在于提供含有本發明所述重組載體的重組細胞。所述重組細胞可以通過將含有水黃皮耐逆相關基因MpSRG的重組載體轉化至宿主細胞而得到。
[0017]適于構建本發明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于，例如:根癌農桿菌細胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。
[0018]在本發明的一個實施方案中，所述重組細胞為根癌農桿菌細胞LBA4404_MpSRG。
[0019]本發明的第五個目的在于提供所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG及其編碼的蛋白質在提高植物耐逆性中的應用，尤其在提高作物耐逆性中的應用。
[0020]本發明的第六個目的在于提供一種提高植物耐逆性的方法，將水黃皮耐逆相關基因MpSRG導入植物組織或細胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG是下述核苷酸序列之一:
[0021]1) SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列；
[0022]2)編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸殘基序列的DNA序列。
[0023]所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG通過含有所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG的重組植物表達載體導入植物組織或細胞。
[0024]所述重組植物表達載體為PBI121_MpSRG。
[0025]本發明又一方面，還涉及一種制備本發明所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG的方法，包括如下步驟:利用分子生物學方法從水黃皮中克隆耐逆相關基因，命名為MpSRG。
[0026]所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG還可以通過人工合成的方法制備，例如:利用核酸合成儀，根據SEQ ID NO:1所示堿基，人工合成水黃皮耐逆相關基因MpSRG。
[0027]本發明的技術路線為:
[0028]1)利用分子生物學方法從水黃皮中克隆耐逆相關基因，命名為MpSRG ；
[0029]2)構建MpSRG重組植物表達載體PBI121_MpSRG，用農桿菌轉化擬南芥，獲得轉MpSRG基因擬南芥；
[0030]3)結果表明=MpSRG基因在擬南芥中超表達，提高了轉基因擬南芥的耐鹽性。
[0031]本發明克隆了一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG，構建MpSRG重組植物表達載體，用農桿菌轉化擬南芥，獲得轉MpSRG基因擬南芥，結果表明MpSRG基因在擬南芥中超表達，提高了轉基因擬南芥的耐鹽性。證明MpSRG基因具有提高植物耐逆性的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為實時熒光定量PCR分析MpSRG在鹽脅迫處理下的表達特征圖；
[0033]圖2MpSRG重組植物表達載體PBI 121_MpSRG構建流程圖；
[0034]圖3為MpSRG基因在轉MpSRG基因擬南芥植株中的表達量RT-PCR檢測圖；
[0035]圖4為野生型植株和轉MpSRG基因植株在鹽脅迫下的相對根長測定及表型觀察圖，注:(a)縱坐標相對根長用小數表不作圖,兩個星號表不P〈0.01 ；
[0036]圖5為野生型植株和轉MpSRG基因植株在鹽脅迫下的生長比較圖，注:(a)轉基因擬南芥在150mM NaCl脅迫10天后恢復10天和30天表型觀察；(b)轉基因擬南芥在150mMNaCl脅迫10天后恢復10天的存活率統計；(c)轉基因擬南芥在150mM NaCl脅迫10天后恢復30天的干重統計；(d)轉基因擬南芥在150mM NaCl脅迫10天后恢復30天統計主莖高；一個星號表不P〈0.05,兩個星號表不P〈0.01。
【具體實施方式】
[0037]以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。
[0038]實施例1水黃皮耐逆性相關蛋白MpSRG編碼基因的篩選及其全長cDNA克隆
[0039]用海水(相當于30%。NaCl)和淡水處理水黃皮一月齡植株，然后選取處理2、4和8小時的根和葉樣品分別進行RNA提取，再將三個時間點的RNA等量混合，構建得到四個文庫(即根淡水處理、根海水處理、葉淡水處理和葉海水處理)后進行Illumina測序。最后，將測序結果進行組裝和拼接，得到十萬多條unigene序列。根據以下三個原則選擇基因:首先，該基因在鹽脅迫后表達顯著上調表達；其次，該基因同源性最高的序列來自于豆科物種；再次，與該基因相似性最大的幾個基因在植物耐鹽和干旱機制方面的還未見研究報道。根據以上三原則得到一個水黃皮基因，其表達受鹽脅迫誘導。
[0040]提取水黃皮幼苗總RNA，通過RACE技術獲取全長cDNA。將水黃皮總RNA分別經5’和3’RACE所用化學試劑處理，然后進行巢式PCR，將得到的PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。將該回收片段與PMD18-T載體連接，把連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態，通過PMD18-T載體上的氨芐青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的M13-47和RV-M序列引物進行測序。將測序結果用GeneTool軟件進行拼接并分析，又將拼接后序列與轉錄組測序獲得的序列進行比對，并且將拼接后序列與NCBI數據庫比對。比對結果表明，RACE所獲得的序列在5’端具有帽子結構，在3’端具有poly (A)結構，說明這就是全長cDNA序列，進一步分析獲得了開發閱讀框(0RF)。結果表明MpSRG基因由402個脫氧核糖核苷酸組成，具體序列如SEQ ID NO:1所示；其編碼的蛋白質，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
`[0041]RACE實驗巢式所用引物如下:
[0042]
【權利要求】
1.一種水黃皮耐逆相關基因MpSRG，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權利要求1所述的水黃皮耐逆相關基因MpSRG編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.含有權利要求1所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG的重組載體。
4.權利要求3所述重組載體為重組植物表達載體。
5.含有權利要求3或4所述重組載體的重組細胞。
6.權利要求1所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG在提高植物耐逆性中的應用。
7.權利要求6所述植物為農作物。
8.一種提高植物耐逆性的方法，將水黃皮耐逆相關基因MpSRG導入植物組織或細胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG是下述核苷酸序列之一:
1)SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列； 2)編碼SEQID NO:2所示氨基酸殘基序列的DNA序列。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG通過含有所述水黃皮耐逆相關基因MpSRG的重組植物表達載體導入植物組織或細胞。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述重組植物表達載體為PBI121-M pSRG。
【文檔編號】C12N5/10GK103468710SQ201310363323
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】鄭易之, 黃健子, 黃榮峰, 陳受宜, 張萬科, 嚴昊 申請人:深圳大學