專利名稱：小立碗蘚抗逆基因PpCor166及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和細胞系的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種小立碗蘚抗逆基因 尸/7Cw766及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和轉基因細胞系。
背景技術：
低溫、千旱、高鹽是限制植物生長發育、地理分布、形態建成等的重要環境 脅迫因素。這些脅迫因素作用的結果均導致植物細胞失水，影響植物細胞的滲透 壓，進而影響植物正常的生理代謝，嚴重時導致植物的死亡。通過對一些模式植 物的研究發現這三種脅迫因素誘導表達的功能蛋白及轉錄因子相互交差，因此， 尋求同時具有忍耐低溫、干旱、高鹽脅迫的綠色植物來研究植物的非生物脅迫極 有必要。
對苔蘚植物的基礎研究標明苔蘚植物是極地低溫度環境的先鋒植物之一， 同時它也分布在極端干旱的沙漠。在漫長的生物進化歷程中，莒蘚植物形成了一 套獨特的適應低溫干燥等惡劣環境的機制。對小立碗蘚非生物脅迫研究發現(Frank 等，2005),與其他高等植物相比，小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)可以忍耐極 端的生態環境。如，擬南芥在100mM的NaCl處理下即受到傷害(Sunkar等，2003 )， 而小立碗蘚可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐漸提高的鹽處理條件下， 小立碗蘚可以忍耐600mM的NaCl脅迫。500mM的山梨醇處理三天后，小立碗蘚 仍可以幸存。當小立碗蘚失水92%時仍可恢復正常生長發育。在脫水、鹽漬和滲 透脅迫條件下，Frank等(2003)分析鑒定了一系列上調基因，其編碼的蛋白主要有 膽堿脫氫酶(choline dehydrogenase)、甜菜堿(glycine betaine)、三氫晚咯羧酸鹽
(deltall-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、 鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAP kinase)等。在0。C低溫脅迫七天后小立碗蘚仍可恢復生長(Minami等，2005),且 在冷馴化過程中激活了 LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的轉錄，提高了其冰 凍耐受能力。
因此從苔蘚植物中克隆抗逆相關基因并進一步通過轉基因等技術應用于提高 農作物的抗逆性是目前研究的熱點之一。

發明內容
為了解決上述問題提出并完成了本發明。 本發明的目的是提供一種高效的抗逆相關基因。 本發明的另一目的是提供上迷基因編碼的蛋白質。 本發明的再一目的是提供含有上述基因的栽體。 本發明的再一目的是提供表達上述基因的轉基因細胞系。
具體地，本發明的發明人將培養至15葉左右的小立碗蘚莖葉體在ox:下處理
48小時，然后通過RT-PCR方法獲得了一種具有顯著抗逆特性的基因一小立碗蘚 抗逆基因尸pCor 66,其#序列如SEQ ID No.l所示。
進一步，本發明還提供了上述基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本發明的完成過程中，還提供了包含上迷基因的栽體、以及表達該基因的 轉基因細胞系。
本發明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術，可以利用 該基因培育出優質的轉基因農作物，從而提高農作物的抗逆性。


圖1顯示了尸/ Cor/66基因的RT-PCR分析結果。圖2顯示了 /^CoW66誘導表達特異性的Nothern Blot分析結果。
具體實施方式
一、尸; Cw766基因的制備1、小立碗蘚的培養及冷脅迫處理將小立碗蘚培養至15葉左右，移入0'C處理48小時，該基因在此時顯著表達。 附小立碗蘚培養基配方及制備微量元素配制成1000X母液，4。C存放。 固體基本培養基，加入濃度為0.8%瓊脂粉。磷酸緩沖液的配制取25g KH2P04溶解于100 ml蒸餾水，用4 M KOH調整 pH7.0， 4'C存放。大量元素Ca(N03)2.4H20FeS04.7H20MgS04.7H20微量元素CuS04.5H20ZnS04'7H20H3B03MnCl2.4H20CoCl2-6H20KINa2Mo04.2H20 Glucose 酒石酸銨 磷酸鹽緩沖液0.055 mg/L 0.055 mg/L 0.614 mg/L 0.389 mg/L 0.055 mg/L 0.028 mg/L 0.025 mg/L0.8 g /L 0.0125 g/L 0.25 g/L5g/L 0.5g/L lml/L2、總RNA的提取(熱酚法)1) 從-80。C冰取出約10g的小立碗蘚莖葉體，加入液氮，在-20。C預冷的高溫 滅菌的研缽中充分研磨成細粉狀；2) 分裝到1.5ml預冷的eppendorf管中；3) 立即加入80'C預熱的水飽和酚和快速抽提液各500ul,渦旋15s后置于水上；4) 4。C，13000rpm, 10min離心；5) 從每管中吸取上清液約450 ul至另一 1.5 ml預冷的含500 ul 24: 1的氯仿 異戊醇eppendorf管，滿旋15s;6) 4。C， 13000rpm離心lOmin;7) 從每管中吸取上清液約400 ul至另一 1.5 ml預冷的eppendorf管；加入40ul 3.0M的NaOAC (1/10)及800ul (2倍)無水乙醇，顛倒數次，放于-80。C沉淀過夜；8) 次日4°C, 13500rpm離心15min，棄上清；9) 預冷的500ul 80%乙醇洗滌，4匸，13500rpm離心5min,棄上清，稍離心， 吸去殘留的水分；10) 在超凈工作臺內，冰上風干10分鐘去掉殘留乙醇；11) 在超凈工作臺內，每管加入30ul預冷的DEPC處理水，吸打溶解，并將 提取的總RNA合并混勻。12) 紫外分析測定純度，電泳檢測總RNA完整性。
附總RNA快速抽提液配方(IOO ml):2M LiCl lMTris HC1 0.5M EDTA 10%SDS ddH205 ml 10 ml 2 ml 10 ml 73 ml上述試劑均用0.1% DEPC處理水配制。 3、總RNA逆轉錄按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0操作說明書進行，反應體系為:MgCl210XRT緩沖液 無Rnase的dH20 dNTP混和物(各10mM) Rnase舉卩制劑 AMV逆轉錄酶 Oligo dT-接頭引物 模板RNA2jil0.25^U 0.5^10,5^1lO.Ojil反應參數45 °C, 30min; 99 'C, 5min; 51: ， 5min。4、尸; CorM(5基因全長的獲得利用該基因的5'端序列設計引物5-CTTTAGCGCAGACCAAGGGG-3,采用 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0中的M13primerM4作下游引物，將上述oligodT-接頭來源的冷脅迫mRNA逆轉錄產物為摸板，反應體系及條件如下RT模板 2^15XPCR緩沖液 2^1dH20 4.25jilTaKaRa五;cr", 0.05^1Ppcorl66up 0.1^1 M13primerM4 0.1 piCorl66 lp_0.5^1反應參數: 94 °C 94 °C 54 °C2 min 30sec 30sec1個循環35個循環72 "C 1 min5、 PCR產物的回收將PCR產物在1%瓊脂糖上電泳，紫外燈下切取目的條帶并切碎膠塊后，按 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0操作(由TaKaRa生產)。6、 PCR產物的連接和轉化取純化后的PCR產物各1 pl，與Promega公司的pGEM -T easy vector連接(按照其產品說明書操作)。將連接產物熱擊轉化入E.coliDH5 ct感受態細胞，挑選陽性克隆測序。 二、 i^Cw766基因的分子水平表達分析1 、尸/ CoW66基因的RT-PCR分析將從冷處理0、 12、 24、 48、 72h的小立碗蘚總RNA(見前)，按TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0操作說明書分別逆轉錄成cDNA。用特異性引物及內標引物， 按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作說明書進行PCR。PCR反應體系cDNA產物 lOpl5XPCR緩沖液 10^1dH20 27.25nlTaKaRa ExTaqHS 0.25^1Corl66 up 0.5(ilCor 166 lp 0.5nlActin up 0.5}xlActin lp 0.5|il-OT^n-反應參數94'C 2min 1個循環9化30sec, 54匸30sec， 72'Clmin, 23個循環。 所用尸/ CoW66的引物為PPCorl66Up: 5' —- CGGAAC TGCCCAAGACAA—3' PPCorl66Lp: 5' — AACCCACTCCACTTTACTGCTT—曙3'所用actin引物為 Actin up: 5' —TGGGTCGTTATCGTCTTCTTCACA-—3';Actin lp: 5' —TCATCTTCTCCCTGTTCGCCTTC —-3' 尸/7Coa7^5基因的RT-PCR分析結果如圖1所示。測序結果顯示，該基因全長 892bp，具有504bp的開放閱讀框，編碼167氨基酸的蛋白質。通過BLASTx搜索， 發現與來自小麥的基因AY148492編碼的蛋白質具有大于25。/o的同一性，認為二者 具有相似的功能，即該基因編碼一個與抗逆相關的蛋白(LEA蛋白)。 尸pO W66基因具有以下核苷酸序列 3tgccgct33 gsgcgctscc ggasctgccc ssgacssggc tggcc33gct 50 ggggactacg C3sgctcs33 ggccc33gct gctssgtctg scgcttccg3 100 cgcgaccgga gctgcccagc acaaggcagg cgaagctact gatgctgcta 150 aggataccat cacagcgagt tggtgacaag actgctgacg ctgctggagc 200 tgcaaaggsc saggc3tatg aggccaagga cgccgcaggc gggsaggccs 250 gcgagacggg tggctacttg ggtgacaagg caaaccaggt caagggtacc 300 gctgctgatg ccgctggcgc cactcaggac aaggcttcgg gtttggcgac 350 caccgcccaa c3g33ggctg gtgssggtgc 333tt3tgcc ssagsgsctg 400 cggtgsgcgc ca3gg3cacc gctggasacg ttttgcsgcs g3ccggtg3t 450 gctgtggcca scgtsttcaa ccgcgcgsag gaaactgtc3 cccc333gcs 500 gt33 550其編碼的蛋白質的氨基酸序列為Met Pro Leu Arg Ala Leu Pro Glu Leu Pro Lys Thr Arg Leu Ala Lys Leu Gly Thr Thr Gin Ala Gin Arg Pro Lys Leu Leu Ser Leu Thr Leu Pro Thr Arg Pro Glu Leu Pro Ser Thr Arg Gin Ala Lys Leu LeuMet Leu Leu Arg lie Pro Se Gin Arg Val Gly Asp Lys Thr Ala Asp Ala Ala Gly Ala Ala Lys Asp Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala Ala Gly Giy Lys Ala Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Leu Gly Asp Lys Ala Asn Gin Val Lys Giy Thr Ala Ala Asp Ala Ala Gly Ala Thr Gin Asp Lys Ala Ser Gly Leu Ala Thr Thr Ala Gin Gin Lys Ala Gly Glu Gly Ala Asn Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Val Ser Ala Lys Asp Thr Ala Gly Asn Val Leu Gin Gin Thr Gly Asp Aia Val Aia Asn Val Phe Asn Arg Ala Lys Glu Thr Val Thr Pro Lys Gh2 、尸/ CorM6基因的Nothern blot分析將冷處理不同時間的總RNA定量后，控制每個泳道上樣量一致(IO嗎)，然 后在lOOv電壓下進行變性膠電泳約2.5h。探針DNA為尸/ CoW66的RT-PCR回收 產物，按隨才幾引物標i己試劑盒Prime-a-Gene Labelling System(Promag, USA)說明書 進行探針的標記，雜交完成后，壓磷屏及掃描圖像，結果如圖2所示。低溫處理 后的Northern雜交結果表明尸pCor/6(5在12小時有微弱表達，48小時達到最強， 72小時后開始減弱，因此可以推斷PpCorl66參與了植物的低溫脅迫應答反應，與 小立碗蘚的抗低溫特性密切相關。
<110〉首都師范大學<120> —種小立碗蘚抗逆基因PpCorl66及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和細胞系<160>3<210>1<211>892<212>DNA<213>小立碗蘚(Physcomytrella Pateuts)<220><221>CDS<222>(1)...(504)<400>1atgccgctaagagcgctaccggaactgcccaagacaaggctggccaagct50ggggactacgcaagctcaaaggcccaagctgctaagtctgacgcttccga100cgcgaccggagctgccc昭cacaaggcaggcgaagctactgatgctgcta150aggataccatcacagcgagttggtgacaagactgctgacgctgctggagc200tgcaaaggacaaggcatatgaggccaaggacgccgcaggcgggaaggcca250gcgagacgggtggctacttgggtgacaaggcaaaccaggtcaagggtacc300gctgctgatgccgctggcgccactcaggacaaggcttcgggtttggcgac350caccgcccaacagaaggctggtgaaggtgcaaattatgccaaagagactg400cggtgagcgccaaggacaccgctggaaacgttttgcagcagaccggtgat450gctgtggccaacgtattcaaccgcgcgaaggaaactgtcaccccaaagca500 gtaa 550<210>2<211>167<212>PRT<213>小立碗蘚(Physcomytrella Pateuts ) <400>2Met Pro Leu Arg Ala Leu Pro Glu Leu Pro Lys Thr Arg Leu Ala 15 10 15Lys Leu Gly Thr Thr Gin Ala Gin Arg Pro Lys Leu Leu Ser Leu20 25 30Thr Leu Pro Thr Arg Pro Glu Leu Pro Ser Thr Arg Gin Ala Lys35 40 45Leu Leu Met Leu Leu Arg lie Pro Ser Gin Arg Val Gly Asp Lys50 55 60Thr Ala Asp Ala Ala Gly Ala Ala Lys Asp Lys Ala Tyr Glu Ala65 70 75Lys Asp Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Leu80 85 90Gly Asp Lys Ala AsnGln Val Lys Gly Thr Ala Ala Asp Ala Ala95 100 105Gly Ala Thr Gin Asp Lys Ala Ser Gly Leu Ala Thr Thr Ala Gin110 115 120 Gin Lys Ala Gly Glu Gly Ala AsnTyr Ala Lys Glu Thr Ala Val 125 130 135Ser Ala Lys AspThr Ala Gly AsnVal Leu Gin Gin Thr Gly Asp 140 145 150Ala Val Ala AsnVal Phe Asn Arg Ala Lys Glu Thr Val Thr Pro 155 160 165Lys Gin<210〉3<211>918<212>DNA<213>小立碗蘚(Physcomytrella Pateuts)<400>3cattgccttt cttcttctta tctacttacg ttcttcttcc tctcttctac 50cgttttacag tcagtcattg tgtgtttcta gctcgcccca catctgtacg 100tttttctaga gctctgcatt tgagatcagt ctccgtcacc ggctttcgtc 150gagatgtcga ccttcgagca aaccaaggag caggctggaa agaaggcgga 200ggagaccaag gggtttggac aagagcaggc tggacacgcc aaggatgccg 250ctaagagcgc taccggaact gcccaagaca aggctggcca agctggggac 300tacgcaagct caaaggccca agctgctaag tctgacgctt ccgacgcgac 350cggagctgcc cagcacaagg caggcgaagc tactgatgct gctaaggata 400ccacacagcg agttggtgac aagactgctg acgctgctgg agctgcaaag 450gacaaggcat atgaggccaa ggacgccgca ggcgggaagg ccagcgagac 500gggtggctac ttgggtgaca aggcaaacca ggtcaagggt accgctgctg 550atgccgctgg cgccactcag gacaaggctt cgggtttggc gaccaccgcc 600caacagaagg ctggtgaagg tgcaaattat gccaaagaga ctgcggtgag 650cgccaaggac accgctggaa acgttttgca gcagaccggt gatgctgtgg 700ccaacgtatt caaccgcgcg aaggaaactg tcaccccaaa gcagtaaagt 750ggagtgggtt acttagtttt ggtgaatact acaatgggta漏cacat 800ttatttactg tcactccatc tcagctgcca gagaacttct agagattctc 850agttttgcga aagtgtacag tgttcagaat gaatattgaa aggtcaaatt 900taagccgtaa aaaaaaaa 918
權利要求
1、一種小立碗蘚抗逆基因PpCorl66，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID No.1所示。
2、 權利要求1所述基因編碼的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質的氨基酸序 列如SEQID No.2所示。
3、 含有權利要求1所述基因的載體。
4、 表達權利要求1所述基因的轉基因細胞系。
全文摘要
本發明涉及生物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種小立碗蘚抗逆基因PpCor166及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和轉基因細胞系。所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本發明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術，可以利用該基因培育出優質的轉基因農作物，從而提高農作物的抗逆性。
文檔編號C12N15/29GK101161814SQ20061011372
公開日2008年4月16日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者何奕昆, 李林輝, 慧 王 申請人:首都師范大學