人miR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明基于基因工程領域，公開了人miR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用。本發明的技術方案為人miR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用。本發明的研究表明人miR-148a能夠促進脂肪細胞的分化，可用于制備促進脂肪細胞分化的藥物。
【專利說明】AmiR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，涉及人miR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著經濟的發展，無論是發達國家還是發展中國家，肥胖患病率正以驚人的速度在不斷上升。從全球范圍來看，符合超重標準的成年人已超過十億，其中三億屬于肥胖。2010年，WTO預測肥胖將出現全球化趨勢，如何預防和治療肥胖受到人們的普遍關心。理論上，“邁開腿，管住嘴”，即在控制飲食、增加運動使能量消耗超過攝入量的減肥措施，但是該模式收效甚微，因此，在分子水平上開展肥胖病因研究以尋找有效防治策略開始受到關注，尤其從近年來發現的非編碼RNA角度尋找肥胖相關非編碼RNA具有重要意義。miRNA是一類長度約為22-25nt的非編碼RNA分子，通過對靶基因的轉錄后調控機制參與眾多疾病，如肥胖、糖尿病、腫瘤、免疫系統疾病等的發病過程。
[0003]人脂肪前體細胞是一類具有增殖潛能、能夠向脂肪細胞定向分化的特殊細胞，月旨肪細胞的數量和體積由脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化的程度決定，目前前體脂肪細胞過度增殖和分化已被認為是肥胖發生的重要環節。前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的一個重要標志是細胞內合成甘油三酯，并以脂肪小滴的形式存儲在細胞內，脂質含量的多少可間接反映前體脂肪細胞的分化程度。因此，誘導人脂肪前體細胞分化為成熟脂肪細胞已成為肥胖研究的一個常用體外研究模型。
[0004]在先前研究中，我們發明人采用miRNA芯片(miRNA Array)技術篩選人脂肪細胞分化前后的差異表達miRNA，獲得一條特異高表達于成熟脂肪細胞的miRNA——人miR-148a，提示其可能與肥胖的發生`發展相關。該miRNA位于人Chr7pl5.2，屬于基因間的miRNA。但目前沒有關于人miR-148a在脂肪細胞中的功能報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供了人miR_148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用。
[0006]本發明人在研究中發現人miR_148a能夠顯著促進脂肪細胞的分化，故提出了人miR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中的應用的技術方案。
[0007]本發明的有益效果:
[0008]本發明經過研究發現在人脂肪前體細胞中穩定表達人miR_148a，與陰性對照相t匕，顯著促進脂肪細胞的分化，從而提出人miR-148a在制備促進脂肪細胞分化藥物中應用的技術方案，根據本發明提出的技術方案可利用人miR-148a制備促進脂肪細胞分化的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1:pGLV-Hl-GFP/Puro載體圖譜、插入位點及人miR_148a過表達慢病毒載體酶切及測序鑒定。
[0010]圖2:人miR_148a過表達慢病毒感染人脂肪前體細胞株的鑒定
[0011]圖3:脂肪細胞分化油紅0染色圖。圖中A為轉染空載pGLV-Hl-GFP/Puro的人脂肪細胞；B為過表達人miR_148a的人脂肪細胞。Dayl分化第I天；Day4為分化第4天；Day7為分化第7天；Dayl5為分化第15天。
[0012]圖4:分化第15天脂肪細胞內甘油三脂含量比較圖。其中:miR-148a:miR-148a過表達的前體脂肪細胞，NC:空載轉染對照細胞。
【具體實施方式】
[0013]以下通過實施例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明
[0014]實施例1
[0015]I材料和方法
[0016]1.1 試驗材料:人前體脂肪細胞株(Human Preadipocytes-visceral, HPA_v)購自美國Sciencell公司。本實驗所需的pGLV-Hl-GFP/Puro質粒購自上海吉瑪公司，包裝質粒 Pcgvp、Rev、Vsvg 購自美國 Allele Biotech & Pharmaceuticals 公司；pGLV-Hl-miR-148a-GFP/Puro慢病毒載體由本實驗小組自行構建；DNA、RNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司,miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA檢測試劑盒、TanMan基因表達mix II購自美國 ABI 公司，TaKaRaLAhq? DNA Polymerase Hot-Start Version PCR 試劑盒購自日本Takara公司，脂肪細胞專有培養基7211購自美國Sciencell公司，限制性內切酶、T4連接酶購自美國NEB公司，引物由美國Invitrogen公司合成。
[0017]1.2實驗方法:
[0018](一)人miR_148aminigene的擴增及人miR_148a慢病毒過表達載體(pGLV-H 1-mi R-148a_GFP/Pur o )的構建
[0019](I).DNA提取:按照以下步驟提取基因組DNA(德國Qiagen公司QIAamp DNA MiniKit)
[0020]I)取4ml離心管一只，加入600 U I核裂解液，冰上冷卻。
[0021]2)加入10_20mg解凍的人脂肪組織，勻漿機勻漿10秒。將裂解物移至1.5ml離心
管中。65°C孵育30分鐘。
[0022]3)待樣品達到室溫后，加入200 ii I蛋白沉淀液，潤旋震湯20秒，直于冰上冷卻5分鐘。
[0023]4) 13，OOOXg離心4分鐘，可見白色沉淀。將上清移至一新離心管中。
[0024]5)加入600 ill異丙醇，輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成。13，000 Xg離心I分鐘，棄去上清。
[0025]6)加入600 ii I室溫70%乙醇,輕輕顛倒離心管數次,13，000 X g離心I分鐘，小心棄去上清。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10-15分鐘。
[0026]7)向離心管中加入50iU雙蒸水，65°C孵育I小時，以充分溶解DNA，4°C保存。
[0027](2).人 miR_148a minigene 的擴增
[0028](2.1)通過miRBase數據庫獲得人miR_148a的前體pre-miRNA_148a的序列；在NCBI blast中比對查找其所在的基因組序列,根據引物設計規則,采用Primer5軟件設計擴增包括pre-miR-148a在內的序列，并在其上游和下游分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，上游引物(含 BamHI 位點，下劃線區域)5’ -GCCGGATCC AATCTGAGGACGGGTAGGAAG-3’;下游引物(含 EcoRI 位點，下劃線區域)5’ -ACCGAATTCCAAGGGAAAGGCGCAGCGACGTG-3 ’，目的基因長度為 443bp。(PCR試劑盒:TaKaRa LA Taqll' DNA Polymerase Hot-Start Version, Takara)
[0029]
[0030]
【權利要求】
1.人miR-148a在制備促進 脂肪細胞分化藥物中的應用。
【文檔編號】C12N5/077GK103446593SQ201310362966
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】史春梅, 季晨博, 郭錫熔, 張敏, 陳玲, 楊蕾, 徐廣峰, 曾玉, 陳婷 申請人:南京市婦幼保健院