一種檢測雞胡須基因型的方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測雞胡須基因型的方法，涉及分子生物學領域，本發明方法基于焦磷酸測序技術，采用一對引物和一條測序引物，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、2、3所示，對雞27號染色體1707859bp位點的單核苷酸多態性進行分析，結果發現雞胡須基因型顯性純合子T堿基、C堿基峰高相同，各占一半；雜合子T堿基峰高大于C堿基，T:C=2:1；隱性純合子只有T堿基的峰，無C堿基的峰。本發明提供的方法操作簡單，靈敏度高，準確性強，通量高，檢測成本低，可快速檢測純合基因型的胡須個體，在雞的保種、育種過程中具有重要應用價值。
【專利說明】一種檢測雞胡須基因型的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學【技術領域】，具體涉及用于雞胡須基因型檢測的SNP分子標 記、以及檢測胡須基因型的方法。

【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性標記（SNP)，主要是指基因組上由單個核苷酸突變所引起的DNA 序列多態性。通過檢測單核苷酸多態性標記檢測基因型是近些年興起的一種方法。分子標 記在動物育種中的應用已有一段時間，相比傳統育種方法，分子育種大大加快了選育效率， 節省了育種時間，使得育種學家可以在分子水平上不斷探索并選育更優良的家畜品種。
[0003] 已有多種方法可用于SNP檢測，目前比較常用的有基因芯片方法、DNA測序法、質 譜法、以及TaqMan熒光定量方法等。不同方法根據所依據的原理不同適用于不同的研究。 芯片和質譜技術適用于大規模的多態信息檢測。而測序和Taqman技術適用于高精度、高準 確性的判定SNP多態信息。在多種測序技術中，焦磷酸測序是一種基于酶級聯反應的新型 DNA測序技術。是目前少數能夠得到定量序列結果的技術之一，其準確度高，重復性好，廣泛 用于多種遺傳多態性分析。
[0004] 焦磷酸測序技術（pyrosequencing)是一種新型的酶聯級聯測序技術，焦磷酸 測序法適于對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相 媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的 能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性（singlenucle-otide potymorphisms，SNPs)研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平臺。該技術進行改進 后可以滿足上百個核苷酸序列的測序工作，這樣該技術又可以滿足對重要微生物的鑒定與 分型，特定DNA片段的突變檢測和克隆鑒定等方面的應用。焦磷酸測序技術的原理是：引物 與模板DNA退火后，在DNA聚合酶（DNApolymerase)、ATP硫酸化酶（ATPsulfurytase) ? 突光素酶（luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶（Apyrase)4種酶的協同作用下，將引物上 每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到 實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術的反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物 和4種酶構成。反應底物為5' -磷酰硫酸（adenosine-5' -phosphosulfat，APS)、突光素 (luciferin)。在每一輪測序反應中，反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP)。如 果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的 3'末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸（PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以 和APS結合形成ATP，在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光 素，同時產生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高 低則和相匹配的堿基數成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上 述反應不會發生，也就沒有檢測峰。反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase 的作用下發生降解。待上一輪反應完成后，加入另一種dNTP，使上述反應重復進行，根據獲 得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。焦磷酸測序技術可以用來研究單核苷酸多態性 (singleucleotidepolymor一phism，SNP)，遺傳多態性，植物多態性分析，分子診斷細菌 與病毒分型、甲基化分析、法醫鑒定及藥物基因組學等方面都有廣泛的應用。該技術不需要 凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有大通量、低成本、快 速、直觀的特點。
[0005] 鳥類的羽毛在形態和顏色方面都呈現出廣泛的多樣性，羽毛的演化和發育模型一 直是進化、發育生物學研究的熱點。分離控制羽毛類型的基因，對闡明羽毛發育機制具有重 要意義。目前已經明確定位的羽毛性狀包括絲羽、纓頭、裸頸、翻毛、無毛等。胡須是在雞 額下部位呈放射狀分布的髯羽，通過雜交試驗已經確定胡須是一種顯性遺傳性狀。傳統的 表型鑒定方法需要很長的時間才能將顯性性狀的基因純化。而目前用于鑒定胡須性狀基因 型的分子標記方法還未見報道，因此確定胡須性狀的基因型對于加快具有胡須性狀雞的選 種、提高育種效率具有非常重要的作用。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種檢測雞胡須基因型的方法。
[0007] 為達到上述目的，本發明的技術方案首先提供一種用于檢測雞胡須基因型的SNP 分子標記，其位于雞27號染色體1707859bp處。所述雞27號染色體基因序列根據雞第四 版本序列信息ICGSCGallus_gallus_4.0/galGal4。
[0008] 本發明提供了用于檢測雞胡須基因型SNP分子標記的引物，其核苷酸序列為：

【權利要求】
1. 一種用于檢測雞胡須基因型的SNP分子標記，其特征在于，位于雞27號染色體 1707859bp 處。
2. 用于檢測權利要求1所述SNP分子標記的引物，其特征在于，其核苷酸序列為： 上游引物：5' -TCTGCCCCTGTTCTGTACCAT-3'， 下游引物：5' -AGCTGCGTGGGCTGAAAC-3'。
3. 與權利要求2所述引物配合使用的探針，其特征在于，其核苷酸序列為： 5, -ACCCAACAGCCTCCC-3，。
4. 一種檢測雞胡須基因型的方法，其特征在于，利用焦磷酸測序法對雞27號染色體 1707859bp位點的核苷酸進行SNP檢測。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取待測雞的基因組DNA，以其為模板，以權利要求2所述的引物為擴增引物，進行 PCR反應； (2) 以步驟（1)的擴增產物為模板，以權利要求3所述的探針為測序引物進行焦磷酸測 序，當雞27號染色體1707859bp位點T堿基、C堿基峰高相同，各占一半時，則為雞胡須基 因顯性純合子；當T堿基峰高大于C堿基，T:C=2:1，則為雞胡須基因雜合子；當只有T堿基 的峰，無C堿基的峰時，則雞胡須基因隱性純合子。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1)中PCR擴增的反應體系為：總體 系為25iil時，含有基因組DNA:50ng，lXPCR Buffer，dNTP3mM，上下游引物各lOpmol， LongAmp Taq DNA聚合酶1. 25U，加水補至25 ill反應體系。
7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1)中PCR反應條件為：94°C預變 性 3min ;94°C變性 10sec，60°C退火 30sec，65°C延伸 20sec，35 個循環；65°C終延伸 lOmin ; 12°C保存。
8. -種檢測雞胡須基因型的試劑盒，其特征在于，含有一對引物和一個探針，其核苷酸 序列分別如SEQ ID No. 1、2、3所示。
9. 權利要求1所述的SNP分子標記在雞育種中的應用。
10. 權利要求8所述試劑盒在雞育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104342489SQ201310367546
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】胡曉湘, 郭影, 顧曉榮, 盛哲雅, 舒鼎銘, 羅成龍, 李寧 申請人:中國農業大學