一種檢測雞胡須性狀的方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測雞胡須性狀的方法，涉及分子生物學領域，在胡須雞27號染色體發現存在三個DNA片段的拷貝數變異，物理位置分別為1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、3578409-3592890bp，確定了3個分子標記，針對該分子標記設計了3對引物，用PCR方法對待測雞基因組的上述3個分子標記進行檢測，若三個PCR擴增反應的目的片段分別為3200bp、501bp、411bp，則檢測結果為陽性，否則為陰性。本發明提供的方法操作簡單，靈敏度高，準確性強，檢測成本低，可快速檢測含有胡須性狀的個體，在雞的保種、育種過程中具有重要應用價值。
【專利說明】一種檢測雞胡須性狀的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學【技術領域】，具體涉及用于雞胡須性狀的分子標記、以及檢 測胡須性狀的方法。

【背景技術】
[0002] 長期的進化和馴化選擇，豐富了農業動物遺傳資源的多樣性。近年來的研究發現， 基因組結構變異是畜禽馴化過程中多個重要性狀的遺傳基礎，如雞20號染色體上發生的 復雜結構重排，會使EDN3基因的表達產生變化，最終導致黑色素在真皮內的沉積；位于雞1 號染色體的S0X5基因內含子1內3. 2kb區域的復制，使得在發育的6-12天內S0X5基因表 達發生改變，導致豆冠表型的產生。基因組結構變異可以通過多種機制影響基因表達，對結 構變異進行研究，有助于我們解析相關性狀形成的機制。
[0003] 基因組結構變異包括缺失、重復、倒位、易位四種類型。目前針對基因組結構變異 的檢測技術主要有基于高密度SNP的基因分型芯片、比較基因組雜交芯片，以及高通量測 序技術等。隨著高通量測序技術的不斷發展，成本的不斷降低，測序已經成為目前生物學研 究的重要手段。通過對結構變異靶區域的重測序分析，分離出結構變異造成的斷點和重排 情況，進而利用PCR等常規分子生物學技術對結構變異進行檢測。檢測只需在結構變異產 生的斷點兩側設計擴增引物，利用簡單的PCR反應，通過瓊脂糖凝膠檢測就可以檢測結構 變異的存在。
[0004] 雞的胡須性狀是家畜中最早進行研究的表型性狀之一，經歷了上百年的歷史，至 今仍未見報道影響胡須性狀的確定染色體位置和檢測方法。如果利用傳統方法對雞的胡須 形狀進行選育，將耗費大量的人力、物力、財力。利用分子生物學的手段建立一種快速檢測 胡須性狀的方法，進行標記輔助選擇，將有助于提高育種效率。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種鑒別雞胡須性狀性狀的方法。
[0006] 本發明以中國農業大學與廣東省農業科學院畜牧研究所合作建立的以惠陽胡 須雞與嶺南黃雞A03系為親本的F2雜交資源群體為研究對象，記錄了F0、F1和F2代 個體的胡須性狀，利用全基因組SNP進行連鎖分析，將影響雞胡須性狀的基因座定位于 雞27號染色體；對R)樣本的進行重測序分析，分離得到了影響雞胡須性狀的結構變 異。本發明發現，胡須雞27號染色體存在三個DNA片段的重復(拷貝數變異，CNV)，在雞 ICGSCGallus_gallus-4.0 版本基因組中的物理位置分別為 1702269-1721521bp(CNV1)、 4470331-4503417bp(CNV2)、3578409-3592890bp(CNV3)，三個片段順利連接并插入到CNV1 原座位，其位置關系如圖1所示。本發明鑒別雞胡須性狀的方法，是針對不同CNV片段間的 連接設計引物進行PCR檢測，根據檢測結果判定雞是否存在胡須基因。
[0007] 本發明首先提供一種用于檢測雞胡須性狀的分子標記組合，其為CNV1、 CNV2和CNV3,這三個分子標記物理位置位于雞27號染色體1702269-1721521bp、 4470331-4503417bp、3578409-3592890bp處，CNV1 和CNV2 連接的基因序列如SEQIDNo. 7 所示，CNV2和CNV3連接的基因序列如SEQIDNo. 8所示，CNV3和CNV1連接的基因序列如 SEQIDNo. 9 所示。
[0008] 本發明提供了用于檢測上述分子標記組合的引物組合，是針對上述不同CNV片段 間的連接設計引物，其核苷酸序列為：

【權利要求】
1. 一種用于檢測雞胡須性狀的分子標記組合，其特征在于，其為CNV1、CNV2和CNV3， 這三個分子標記物理位置位于雞27號染色體1702269-1721521bp、4470331-4503417bp、 3578409-3592890bp 處，CNV1 和 CNV2 連接的基因序列如 SEQ ID No. 7 所示，CNV2 和 CNV3 連 接的基因序列如SEQ ID No. 8所示，CNV3和CNV1連接的基因序列如SEQ ID No. 9所示。
2. 權利要求1所述的分子標記組合在雞育種中的應用。
3. 用于檢測權利要求1所述分子標記組合的引物組合，其特征在于，其核苷酸序列為： CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC〇
4. 權利要求3所述的引物組合在制備檢測雞胡須性狀試劑盒中的應用。
5. 權利要求3所述的引物組合在雞育種中的應用。
6. -種檢測雞胡須性狀的試劑盒，其特征在于，含有權利要求3所述的引物組合。
7. -種檢測雞胡須性狀的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)以待測雞的基因組DNA為模板，用三對引物分別進行PCR反應；所述三對引物分別 是： CNV1-2F TTTGTTGTCTCCTTGCATCATT CNV1-2R CCATGTCAGCACAGTAACGATT CNV2-3F ATGTTGGTTGTGTGCCAAGTAG CNV2-3R TTTCCCCTCGTCTGCTTTATTA CNV3-1F ACAAGTCAGAGAGGCAATCGAC CNV3-1R CCATACAGCCTCAGGTAAGGAC ； (2 )將三次PCR反應的擴增產物用瓊脂糖凝膠檢測，若CNV1、CNV2、CNV3引物的PCR擴 增反應的目的片段分別為320(^?、50化？、4^?，則結果為陽性，否則為陰性。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R和 CNV2-3F、CNV2-3R的PCR擴增反應體系為： 總體系為25 ill時，基因組DNA :50ng，1 XPCR Buffer，dNTP4mM，上、下游引物各 lOpmol，康為Taq DNA聚合酶1. 25U，加水補至25iil反應體系； 引物 CNV1-2F、CNV1-2R 的 PCR 擴增反應體系為：基因組 DNA:50ng，lXPCR Buffer， dNTP4mM，上、下游引物各10pmol，Long AmpTaq DNA聚合酶NEB1. 25U，加水補至25iil反應 體系。
9. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（1)中引物CNV3-1F、CNV3-1R及 CNV2-3F、CNV2-3R 的 PCR 反應條件為：94°C預變性 5min ;94°C變性 30sec，60°C退火 30sec， 72°C延伸20sec，共35個循環；72°C終延伸7min;12°C保存； 引物CNV1-2F、CNV1-2R的PCR反應條件為：94°C預變性3min ;94°C變性lOsec，57°C退 火30sec，65°C延伸4sec，共35個循環；65°C終延伸7min ;12°C保存。
10. 權利要求7-9任一所述的方法在雞育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104342490SQ201310367724
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】胡曉湘, 顧曉榮, 郭影, 盛哲雅, 王彥強, 舒鼎銘, 瞿浩, 李寧 申請人:中國農業大學