一種pcr-dgge\tgge\sscp引物篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的篩選方法，從所研究的微生物生態體系的菌群序列特性出發進行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選，篩選指標包括引物對的匹配情況及其擴增片段的區分度、平均差異度、平均長度和平均GC含量，最適的引物對是通過綜合比較各引物對之間指標的優劣來確定的。本發明選取的引物具有很強的針對性同時無需進行繁瑣的多引物篩選或聯用的實驗操作工作，有助于采用PCR-DGGE\TGGE\SSCP技術對所研究微生態體系的菌群多樣性進行快速而準確的解析。
【專利說明】—種PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物分子生態學【技術領域】，具體涉及一種PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的篩選方法，特別是一種適合于所研究微生物生態體系菌群多樣性解析的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的篩選方法。
【背景技術】
[0002]PCR-DGGE簡稱DGGE即變性梯度凝膠電泳、PCR-TGGE簡稱TGGE即溫度梯度凝膠電泳和PCR-SSCP簡稱SSCP即單鏈構態多樣性分析是三項DNA指紋技術，目前均已經成為微生物菌群多樣性研究的重要手段。這三項技術可以用于分離長度相同但序列不同的DNA片段:對于DGGE和TGGE技術，雙鏈DNA片段的分離是依靠其在含有化學變性劑梯度(DGGE)或溫度梯度(TGGE)的凝膠當中泳動時具有不同的解鏈行為而實現的；對于SSCP技術，單鏈片段的分離是依靠其在低溫下具有不同的構像而實現的。與微生物學傳統研究手段相比，這三項微生物分子生態學技術最大的特點在于它們是不基于培養的方法——是以樣品總DNA或RNA出發進行研究的，因此能檢測到生態體系中大量的不可培養微生物。同時這三技術還具有可靠性強、重現性高、方便快捷的優點，目前被廣泛應用于土壤、活性污泥、生物膜、動物腸道、湖泊等各種環境的微生物生態解析中。
[0003]PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的選擇對于特定微生物生態中菌群多樣性的研究十分關鍵:如果引物和研究體系中某些微生物種群不匹配，結果就會導致相關菌群的遺漏，甚至包括優勢菌群；如果引物擴增的片段可變性不足，就難以通過DGGE\TGGE\SSCP獲得全面準確的菌群多樣性信息。因此既要求引物要從研究體系中各微生物種群共有的保守序列中選取，又需要引物擴增的片段在研究體系的各菌群中具有足夠的可變性。目前針對rDNA序列已經開發出了一些常用的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物，而當前大多數菌群多樣性研究往往只選擇其中的一對引物開展.一并未考查該引物是否適合于所研究體系，或者是否有更加合適的引物。有研究表明，選擇不同的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物進行研究結果往往存在差異。針對適合于所研究體系菌群多樣性研究的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的選擇，有關研究表明可以采用比較不同類型的引物進行多樣性分析的效果，然后從中篩選出最佳的引物；或者采用多對引物分別進行PCR-DGGE\TGGE\SSCP分析，最后共同解析菌群多樣性。然而多對引物擇優或者聯用的研究策略將大大增加工作量，此外還是具有一定的盲目性。因此應該采用從所研究的菌群體系出發選取或者設計PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的策略，這樣則選取或者設計得到的引物將具有很強的針對性，同時無需進行繁瑣的多引物篩選或聯用的實驗操作工作。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種基于序列特性分析的PCR_DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法，從而實現對所研究微生態體系的菌群多樣性進行快速而準確的解析。
[0005]為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:一種PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法，其特征在于:從所研究的微生物生態體系的菌群序列特性出發進行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選，篩選指標包括引物匹配情況及其擴增片段的區分度、平均差異度、平均長度和平均GC含量。
[0006]具體步驟如下:
步驟1:確定所研究體系涉及的微生物種屬。
[0007]所研究體系涉及的微生物種屬可以結合文獻報道和前期研究進行確定，因此該方法更加適用于體系較為明確的研究。此外相關分析是基于已知涉及的菌群信息及其現有的DNA序列，隨著相關研究的開展、進行和深入，菌群信息及其DNA序列將會得到更新或者補充，因此可以采用同樣的方法進行完善。
[0008]步驟2:根據研究需要選擇特定的DNA片段，收集步驟I所述微生物種屬的該DNA片段并找出現有的靶向該片段的系列PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物對。
[0009]rDNA可變區常被選擇作為菌群多樣性研究的靶標片段，如采用16S rDNA的V3區研究細菌菌群多樣性。而對于某一微生物種屬，其特定DNA片段的檢索最好是在專門的數據庫中進行(如 RDP:http://rdp.cme.msu.edu/ 和 SILVA:http://www.arb-silva.de/等)，所得序列將更加可靠和具有代表性；此外檢索結果可能不止一條，應選擇長度最長的作為代表。
[0010]步驟3:將步驟2中收集到的微生物種屬的DNA序列和各引物對分別進行比對，分析各引物對的匹配情況。
[0011]各引物對和收集的微生物種屬DNA的比對可以采用生物信息學軟件Clustal完成。引物的匹配情況是指引物與所研究體系各微生物種屬相應靶標序列的匹配情況，這決定了 PCR擴增的成敗以及擴增的好壞`，將直接影響到對菌群多樣性的準確而有效的解析。理想的情況是最優引物和所研究體系各微生物種屬相應靶標序列均能夠完全匹配，以保證最佳的擴增(；邢德峰，任南琪.應用DGGE研究微生物群落時的常見問題分析.微生物學報，2006，46 (2):331-335.)。
[0012]步驟4:對各引物對擴增片段的序列特性進行包括區分度、平均差異度、平均長度和平均GC含量的分析。
[0013]引物一般設計在保守區內，其擴增的可變區片段需要盡可能多地區分研究體系中的微生物種屬，這樣才能保證獲得準確而可靠的菌群多樣性信息(59，695-700;Ercolini, D., 2004.PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection ofmicrobes in food.J Microbiol Methods.56, 297-314.);因此引物對擴增片段需要保證良好的區分度，這是非常重要的。對于所研究微生物體系，某一引物對擴增片段的區分度是指該片段序列存在差異的微生物種屬數量占全體微生物種屬數量的比例；該比例越高越好，最好的結果是I。對于某一引物對的擴增片段，各微生物種屬之間該片段的差異度是指通過比對得到的差異堿基數占比對全長的百分數，這是一個與相似度相對的指標；而平均差異度為所有存在擴增片段序列差異的微生物種屬片段差異度的平均值，表征了擴增片段的整體差異程度。由于序列差異越大其分離情況越復雜，因此平均差異度越低越好，其最低值在兩兩之間均只相差一個堿基的情況下取得(Lyons, J.1994.1dentificationof mutant forms of G-protein a subunits in human neoplasia by polymerase chainreaction-based techniques.Meth.Enzymo1.237: 295-308; Colin R.Jackson, EricE.Roden, Perry F.Churchill.Denaturing Gradient Gel Electrophoresis CanFail to Separate 16S rDNA Fragments with Multiple Base Differences.MolecularBiology Today 2000.1(2): 49-51.)。平均長度是指可變區核苷酸的平均數量，可變區長度一般在 200bp_500bp 之間(13，3131-3145; Freeman, K., Woods, E., ffelsby,S., Percival, S.L., Cochrane, C.A., 2009.Biofilm evidence and the microbialdiversity of horse wounds; Can J Microbiol.55, 197-202; Lee, S., Choi, B., Yi,S.-M., Ko, G., 2009.Characterization of microbial community during Asian dustevents in Korea.Science of the Total Environment.407, 5308-5314.),在此范圍內一般越短分辨率越高。平均GC含量是指G堿基和C堿基之和占總堿基數的平均比例，相同長度的兩個可變區相比，平均GC含量低的發生序列變異所引起的效果(解鏈或構象形成差異)會更明顯，因此更有利于序列不同的片段的分離。
[0014]步驟5:根據各引物對的匹配情況和其擴增片段的序列特性進行綜合分析，篩選最適的引物對。
[0015]進一步的，所述的步驟3和步驟4各引物對匹配情況及其擴增片段的序列特性，匹配情況和區分度是核心評估指標，需要首先保證良好的匹配度和區分度；而平均差異度、平均長度和平均GC含量是輔助評估指標，需要低的平均差異度、短的片段平均長度和低的平均GC含量。
[0016]進一步的，所述的步驟5各引物對的匹配情況及其擴增片段序列特性的綜合分析將決定其是否適合于所研究微生物體系菌群多樣性的解析，最適引物對是通過綜合比較各弓I物對之間指標的優劣來確定的。
[0017]本發明是從所研究的微生物生態體系的菌群序列特性出發進行引物篩選的，因此選取的引物將具有很強的針對性，同時無需進行繁瑣的多引物篩選或聯用的實驗操作工作，這樣將有助于采用PCR-DGGE\TGGE\SSCP技術對所研究微生態體系的菌群多樣性進行快速而準確的解析。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是引物篩選方法實施步驟的簡要流程。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0020]實施例1:
以紅曲黃酒釀造體系中的真菌菌群為研究對象，通過三對靶向18S rDNA片段的引物對(FR1-FF390、NS3_YM951r和NSl-Fung)的匹配情況及其擴增片段序列特性的分析，篩選適合于該體系真菌菌群多樣性研究的PCR_DGGE\TGGE\SSCP引物。具體步驟如下:
1、確定紅曲黃酒釀造體系中的真菌菌群信息
根據本發明實施例的前期研究(Identification and characterization offilamentous fungi isolated from fermentation starters for Hong Qu glutinousrice wine brewing.Xu-Cong Lv, Zh1-Qing Huang, Li Ni*, et al.The Journal ofGeneral & Applied Microbiology.2012, 58 (I):33-42.另有部分結果尚未發表)和查閱相關文獻，確定出紅曲黃酒釀造體系中的主要真菌菌群共15種，如表I所示。
[0021]2、收集18S rDNA近全長序列
根據表I在SILVA數據庫中檢索各真菌種屬的18S rDNA近全長序列(真菌的18S rDNA序列全長約有1800bp，但是目前數據庫中僅有少數真菌種屬的18S rDNA全長序列，因此本實施例收集的是18S rDNA近全長序列，至少不少于1500bp)，檢索結果出現多條序列的則在保證測序質量的前提下選擇最長的那條。各真菌種屬18S rDNA近全長序列的AccessionNumber情況詳見表I。
表I紅曲黃酒釀造陣系中的真菌菌群及其I SSrDNA序列信息
【權利要求】
1.一種PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法，其特征在于:從微生物生態體系的菌群序列特性出發進行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選，篩選指標包括引物匹配情況及其擴增片段的區分度、平均差異度、平均長度和平均GC含量。
2.根據權利要求1所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法，其特征在于:具體步驟如下: 步驟1:確定所研究體系涉及的微生物種屬； 步驟2:根據研究需要選擇特定的DNA片段，收集步驟I所述微生物種屬的該DNA片段并找出現有的靶向該片段的系列PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物對； 步驟3:將步驟2中收集到的微生物種屬的DNA序列和各引物對分別進行比對，分析各引物對的匹配情況； 步驟4:對各引物對擴增片段的序列特性進行包括區分度、平均差異度、平均長度和平均GC含量的分析； 步驟5:根據各引物對的匹配情況和其擴增片段的序列特性進行綜合分析，篩選最適的引物對。
3.根據權利要求2所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法，其特征在于:所述的步驟3和步驟4各引物對匹配情況及其擴增片段的序列特性，匹配情況和區分度是核心評估指標，需要首先保證良好的匹配度和區分度；而平均差異度、平均長度和平均GC含量是輔助評估指標，需要低的平均差異度、短的片段平均長度和低的平均GC含量。
4.根據權利要求2所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物篩選方法，其特征在于:所述的步驟5各引物對的匹配情況及其擴增片段序列特性的綜合分析將決定其是否適合于所研究微生物體系菌群多樣性 的解析，最適引物對是通過綜合比較各引物對之間指標的優劣來確定的。
【文檔編號】C12Q1/04GK103436615SQ201310372313
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月24日 優先權日:2013年8月24日
【發明者】倪莉, 黃志清, 陳芳, 黃山, 靳爽 申請人:福州大學