施氏假單胞菌及其培養、固定化和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株施氏假單胞菌及其培養、固定化和應用。該菌株為施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri）WZUF25，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC?NO.7685。該菌株進行好氧反硝化的適宜pH和溫度范圍廣，不僅對NO3--N和NO2--N的去除率高，而且具有很高的同化NH4+-N能力，可為同步硝化和反硝化提供種源。本發明同時提供采用活性炭-海藻酸鈣包埋法制備的固定化施氏假單胞菌，其同樣具有良好的去除NO3--N的能力和穩定性。
【專利說明】施氏假單胞菌及其培養、固定化和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境微生物領域，具體涉及一株施氏假單胞菌及其培養、固定化和應 用。
【背景技術】
[0002]氮素給環境造成的污染問題近年來日益突出，其危害性也日益被人們認識和重 視。如氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮有可能轉化為致癌、致突變和致畸的亞硝胺；又如氮素 流入水體造成水體富營養化，引起水質惡化乃至湖泊退化。生物脫氮具有處理效果好、處理 過程穩定可靠、操作管理方便等的優點而得到廣泛應用。
[0003]傳統脫氮理論認為廢水生物脫氮必須是銨態氮經歷典型的硝化與反硝化過程，即 廢水中的銨態氮首先被氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化細菌在好氧條件下依次氧化為亞硝酸 鹽氮、硝酸鹽氮，然后由反硝化細菌在厭氧或兼氧條件下將硝酸鹽氮依次還原為亞硝酸鹽 氮、氮氣或氮氧化物。傳統認識上的反硝化菌在有氧條件下優先利用氧氣作為電子受體，只 有在缺氧條件下硝酸鹽才會代替氧氣作為最終電子受體進行反硝化作用。
[0004]20世紀80年代,Robertson和Kuene在除硫和反硝化處理系統中首次分離到好氧 Thiosphaera pan to tropha (% Paracoccus pan to trophus )、
Pseudomonas spp. JkAlcaligenes /aecaJis,至今已有許多好氧反硝化菌被分離 獲得，現已報道的好氧反硝化細菌大多分布于假單胞菌屬（Pseudomonas)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)和產堿菌屬（Alcaligenes)等土壤、廢水常見種屬中，而且發現好氧反硝化菌 大多表現異氧硝化的特性。但分離自不同環境的菌株，其生理特性和除氮能力各具特色，它 們可為實際應用或進一步的菌株改造提供豐富的種源。如李小龍等從魚塘水樣中分離到1 株不動桿菌i Acinetobacter sp.)，以KN03、（ NH4)2 S04、NaN02為唯一氮源的培養液中，可 在24 h內將培養液中NCV-N從161. 61 mg ? I71降至55. 69 mg ? L'去除速率為4. 41 mg ? L 1 h 1 N03 -N ；15 h 內將 NH 4+ _N 由 220. 24 mg ? L 1 降至 14. 78 mg ? L S 去除速率 為 13. 70 mg *L :h 1 NH: - N ；12 h 內 N02 _N 濃度由 101. 27 mg *L 1 降至 21. 85 mg *L 1, 去除速率為e.eZmg.L—V1 N02--N;但其脫氮的適宜pH為偏堿性的；20°C時不生長，40°C時 在NH4+-N測定液中生長緩慢，在N02_-N測定液中不生長，最佳生長溫度為30°C (微生物學 報，2011，51 (8) : 1062-1070)。
[0005]好氧反硝化和異養硝化的發現打破了傳統的生物脫氮理論，使得同步硝化和反硝 化成為可能。迄今為止，對于異養硝化、好氧反硝化的機理尚有待繼續深入研究，對異養硝 化菌和好氧反硝化菌的應用還很少，但因其在脫氮方面的獨特優勢，從長遠看必將得到廣 泛的應用，因此選育優良性能的菌株為實際應用提供種源具有重要的實際意義。
[0006]固定化細胞技術用于廢水生物處理與傳統的懸浮生物處理法相比，能純化和保持 高效菌種，微生物濃度高，污泥產量少，固液分離效果好。因此，該項技術在廢水生物處理， 尤其是在特種水處理領域中，獲得了廣泛的研究。固定
化細胞技術已用于B0D物質的去除、硝化一反硝化、脫磷、去酚、氰的降解、LAS降解、重金屬離子的去除與回收以及印染廢水的脫色處理等。近年來，固定化硝化菌脫氮技術已經從實驗室和小規模試驗階段進入大規模的生產性試驗階段。目前，固定化好氧反硝化菌脫氮技術還處于實驗室和小規模試驗階段。

【發明內容】

[0007]為了解決上述技術問題，本發明提供一株好氧反硝化菌，其特點為該菌株為采用常規分離方法從采自浙江溫州西片污水處理廠的活性污泥中分離獲得，經過16SrDNA序列測定并將測序結果通過GeenBank Blast進行比對分析,與stutzeri的同源性為 99.9%，編為 A stutzeri WZUF25。
[0008]本發明提供的一株施氏假單胞菌，該菌株為施氏假單胞菌iPseudomonass tutzeri ) WZUF25 ,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7685。
[0009]本發明提供上述施氏假單胞菌的培養方法，包括如下步驟:
.1)保藏菌株WZUF25接種于LB培養基中，培養12h以上，離心，得菌體，用無菌水洗滌后制成OD680為0.900~1.000的菌懸液；
.2)步驟I)所得菌懸液接種于反硝化培養基中進行培養；
其中，所述反硝化培養基的構成為:碳源，氮源，K2HPO4, FeSO4, MgSO4, H2O,所述碳源為丁二酸鈉、乙酸鈉、甘油或葡萄糖，所述氮源為含硝酸根離子的化合物。
[0010]優選地，步驟2)中所述反硝化培養基的配方為:碳源，氮源中硝酸根的質量
.1.228g, K2HPO4 lg, FeSO4.7H20 0.20g, MgSO4.7H20 0.10 g, H2O 1000 mL, pH 為 5~9，所述碳源與氮源的NO3-的質量比為5:1.228~15:1.228。
[0011]作為優選技術方案，步驟I)保藏菌株WZUF25接種于LB培養基中，于20~40°C，溶氧3.5~6.1 mg* L-1的條件下培養；步驟2)中所得菌懸液接種于反硝化培養基中，于.25~40°C，溶氧3.5~6.1 mg.I71下培養。
[0012]作為優選技術方案，步驟2)中所述反硝化培養基的pH 5~9。
[0013]優選地，所述菌懸液以5%的體積比接種于反硝化培養基中。
[0014]本發明提供上述的施氏假單胞菌的應用，其特征在于，將所述施氏假單胞菌WZUF25接種于含氮水溶液中，進行脫氮。
[0015]作為優選技術方案，所述含氮水溶液為含有NH4+、N03_和N02_的一種或其組合的水溶液，所述施氏假單胞菌WZUF25脫NCV-N、NH4+-N和Ν02__Ν的碳源含有乙酸鈉、丁二酸鈉、甘油或葡萄糖的其中之一或其組合。含氮水溶液中的氮源只為NH/-N時，碳源與含氮廢水中NH4+的質量比優選為5:0.0.3-15:0.34 ;含氮水溶液中的氮源只為Ν03_時，碳源與含氮廢水中Ν03_的質量比為5:1.228~15:1.228 ;含氮水溶液中的氮源只為Ν02__Ν時，碳源與含氮廢水中Ν02_的質量比為5:0.67~15:0.67。
[0016]作為優選技術方案，所述含氮水溶液pH為4~10，所述施氏假單胞菌WZUF25于溫度20°C~45°C，溶氧為1.3~7.3mg.L—1的條件下對含氮水溶液進行脫氮。
[0017]本發明提供上述施氏假單胞菌固定化制備微膠囊的方法，步驟如下:
I)菌株WZUF25接種于LB培養基中培養后離心得菌體，菌體以蒸餾水洗滌，菌體與分散有活性炭粉末的海藻酸鈉溶液混合；2)配制CaCl2水溶液中，于37°C水浴l(T30min后，將步驟I)所得混合液滴加入溫度37 0C的CaCl2水溶液中，得微膠囊。
[0018]上述微膠囊的應用:所述微膠囊接種于含氮水溶液中，進行脫氮。
[0019]優選地,所述含氮水溶液為含有NOf和NOf的一種或其組合的水溶液，所述固定化施氏假單胞菌WZUF25的微膠囊脫N03--N、NH4+-N和Ν02__Ν的碳源含有乙酸鈉、丁二酸鈉、甘油或葡萄糖的其中之一或其組合。含氮水溶液中的氮源只為NO3-時，碳源與含氮廢水中N03_的質量比為5:1.228^15:1.228 ;含氮水溶液中的氮源只為N02_時，碳源與含氮廢水中NO2-的質量比為5:0.67~15:0.67。
[0020]作為優選技術方案，所述含氮水溶液pH為4~10，所述固定化施氏假單胞菌WZUF25的微膠囊于溫度20°C~45°C，溶氧為1.3~7.3mg.L—1的條件下對含氮水溶液進行脫氮。[0021]本發明能夠達到以下技術效果:
1、施氏假單胞菌iPseudomanos stutzeri )WZUF25進行好氧反硝化的適宜pH和溫度范圍廣，不僅對no3_-n和Ν02_-Ν的去除率高，而且具有較高的同化NH/-N能力，可為同步硝化和反硝化提供種源。同時提供采用活性炭-海藻酸鈣包埋法制備的固定化施氏假單胞菌去除NO3--N的能力和穩定性。
[0022]2、本發明經研究提供了適合菌株WZUF25培養的反硝化培養基和培養方法，可培養獲得大量菌體。
[0023]3、在菌株WZUF25的最佳脫氮條件下，Ν03__Ν和Ν02__Ν的去除率能夠達到99%以上；NH4+_N去除率可達60%左右。
[0024]4、利用本發明的菌株能夠有效對廢水進行處理，降低廢水C0D，并且脫氮效果良好。
[0025]5、本發明的菌株經固定化制得的微膠囊同樣具有Ν03_-Ν和Ν02_-Ν的去除率高的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是采用MEGA4.1軟件，鄰位連接法顯示菌株WZUF25與相關種的16S rDNA序列系統發育樹，進行1000次的相似度重復計算，圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大于50%數值,上標的“T”表示模式菌株(P., Pseudomonas')。
[0027]圖2是菌株WZUF25去除人工配制的NH4+_N污水進程。
[0028]圖3是菌株WZUF25去除人工配制的Ν03__Ν污水進程。
[0029]圖4是菌株WZUF25去除人工配制的Ν02__Ν污水進程。
[0030]圖5是活性炭-海藻酸鈣包埋菌株WZUF25去除人工配制的Ν03__Ν污水進程。
[0031]菌株保藏
本發明的施氏假單胞菌iPseudomanos stutzeri )WZUF25,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7685，保藏起始日期為2013年6月8日。
【具體實施方式】[0032]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
[0033]實施例一:好氧反硝化菌株的分離
樣品為取自浙江溫州西片污水處理廠的活性污泥，采用常規分離法，將一定量活性污泥接種于富集培養基(KNO3 lg，丁二酸鈉 5g，KH2PO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H200.1Og, H2O 1000mL, pH 7.2-7.6)于 30°C 160 ~180 rpm 下進行富集培養 3 ~4 天，待長出細菌后轉接新的富集培養基繼續富集培養，如此重復4~5次。然后將經適當稀釋的菌液涂布于分離培養基(瓊脂18g.L—1，其他成分同富集培養基)于30°C下培養48 h，挑取單菌落轉接新的分離培養基進行劃線純化，直至經鏡檢為純培養物，然后轉接保藏培養基(酵母膏5g，蛋白胨lOg，NaCl 10g,瓊脂18g，H2O 1000 mL, pH 7.0)于30°C下培養后保藏。
[0034]分別將保藏菌株接種于反硝化培養基(丁二酸鈉IOg.L—1，其他成分同富集培養基)于30°C 160~180 rpm下培養(250mL錐形瓶裝培養基lOOmL)，定時取樣分別用格利斯試劑I和II以及二苯胺檢測Ν02_-Ν和Ν03_-Ν，根據Ν02_-Ν的生成和降解情況以及Ν03_-Ν的降解情況，對保藏菌株的好氧反硝化性能進行初步篩選，對初步篩選獲得的好氧反硝化菌株進行反硝化性能測定，測定方法按文獻進行(東秀珠，常見細菌系統鑒定手冊，北京:科學出版社，2001)，以進一步確定好氧反硝化性能。
[0035]將初篩獲得的具有好氧反硝化性能的菌株進行復篩，方法為將菌株接種于反硝化培養基(丁二酸鈉IOg.I/1，其他成分同富集培養基)于30°C 160~180 rpm下培養24 h(250mL錐形瓶裝培養基IOOmL),然后于8000rpm下離心IOmin后測定上清液的Ν02__Ν濃度和no3_-n濃度，計算no3_-n的去除率和no2_-n的積累情況，篩選no3_-n去除能力強、no2_-n積累低甚至沒有積累的優良菌株。
[0036]經上述方法獲得I株優良的好氧反硝化菌株，編為WZUF25。
[0037]Ν03_-Ν測定采用酚二磺酸法分光光度法，NO2^-N測定采用N- (1-萘基)-乙二胺光度法(國家環境保護局.水和廢水監測分析方法(第三版).北京:中國環境科學出版社，1989)。
[0038]NO3--N去除率(%)=(培養前上清液NO3--N濃度-培養后上清液Ν03__Ν濃度)/培養前上清液NO3--N濃度X 100%
實施例二:好氧反硝化菌株的鑒定
菌株WZUF25在分離培養基培養48h后菌落呈圓形、半透明、表面不光滑、邊緣不整齊、菌落呈淡黃色，菌細胞短桿狀，大小0.7~0.8X 1.5~3.2 μ m，無芽孢，革蘭氏陰性，單極鞭毛。
[0039]以細菌基因組DNA為模板擴增16SrDNA，擴增采用一對通用引物:上游引物(Pl):5’ -AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’，下游引物(P6):5’ -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，PCR產物的純化和測序由上海生物工程有限公司完成，測序結果通過GeenBankBlast進行比對分析。與GeenBank中的假單胞菌屬iPseudmonas sp.)的16SrDNA序列具有很高同源性，與A stutzeri的同源性為99.9%。采用MEGA4.1軟件，鄰位連接法顯示菌株WZUF25與相關種的16S rDNA序列系統發育樹見圖1。
[0040]施氏假單胞菌(Fseudmorms stutzeri) WZUF25,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.7685，保藏起始日期為2013年6月8日。
[0041 ] 實施例三:菌株WZUF25好氧反硝化去除Ν03__Ν的特性
采用單因子試驗法，研究菌株WZUF25進行好氧反硝化去除Ν03_-Ν的特性。實驗過程為:將保藏菌株(2.0mL冷凍管融化的菌液)接種于裝有200mL LB培養基(酵母膏5g，蛋白胨10g, NaCl 10g, H2O 1000 mL，pH 7.0)的 500mL 錐形瓶中，在 30°C、160rpm 下培養 24h，在8000 rpm下離心IOmin得菌體，并用無菌蒸餾水洗滌菌體2次，用無菌水制成菌懸液(fl9_0.900 ~1.000)。
[0042]然后菌懸液按5%體積比的接種量轉接于裝有IOOmL反硝化培養基(碳源，KNO3,K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H20 0.10 g, H2O 1000mL, pH 4~10)的 250mL 錐形瓶中，于一定溫度(20~45°C)—定轉速(O~250rpm)下培養24 h, 8000rpm下離心IOmin后測定上清液的NO2--N濃度和NO3--N濃度，計算NO3--N的去除率和Ν02__Ν的積累情況。
[0043]NO2--N和NO3--N的測定同實施例一，溶氧的測定為裝有IOOmL培養基的250mL錐形瓶在一定溫度、一定轉速下振蕩24h后測定培養基的DO值。
[0044]NO3--N去除率計算同實施例一。
[0045]主要探討碳源、碳源與KNO3的重量比、溫度、pH和溶氧對菌株WZUF25去除Ν03__Ν的影響，結果如表1~表5所不。
[0046]1、碳源對菌株WZUF25去除NOf-N的影響
菌懸液按5%體積比的接種量轉接于裝有IOOmL反硝化培養基(碳源10g，KNO3 2.0g，K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H20 0.10 g, H2O 1000mL, pH 7.0)的 250mL 錐形瓶中，于溫度30°C,轉速150rpm (溶氧4.9mg.171)下培養24 h, 8000rpm下離心IOmin后測定上清液的NO2--N濃度和NO3--N濃度，計算NO3--N的去除率和Ν02__Ν的積累情況。
[0047]表1碳源對菌株WZUF25去除Ν03__Ν的影響
【權利要求】
1.一株施氏假單胞菌，其特征在于，該菌株為施氏假單胞菌stutzeri)WZUF25，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為 CGMCC N0.7685。
2.權利要求1所述施氏假單胞菌的培養方法，其特征在于，包括如下步驟: .1)保藏菌株WZUF25接種于LB培養基中，培養12h以上，離心，得菌體，用無菌水洗滌后制成OD680為0.900~1.000的菌懸液； .2)步驟I)所得菌懸液接種于反硝化培養基中進行培養； 其中，所述反硝化培養基的構成為:碳源，氮源，K2HPO4, FeSO4, MgSO4, H2O,所述碳源為丁二酸鈉、乙酸鈉、甘油或葡萄糖，所述氮源為含硝酸根離子的化合物。
3.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，步驟I)保藏菌株WZUF25接種于LB培養基中，于20~40°C，溶氧3.5~6.1 mg.L-1的條件下培養；步驟2)中所得菌懸液接種于反硝化培養基中，于25~40°C，溶氧3.5~6.1 mg.L-1下培養。
4.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，步驟2)中所述反硝化培養基的配方為:碳源，氮源中硝酸根的質量 1.228g，K2HPO4 lg, FeSO4.7H20 0.20g, MgSO4.7H20 0.10g, H2O 1000 mL，pH為5~9，所述碳源與氮源的NOf的質量比為5:1.228~15:1.228。
5.權利要求1所述的施氏假單胞菌的應用，其特征在于，將所述施氏假單胞菌WZUF25接種于含氮水溶液中，進行脫氮。
6.權利要求5所述的施氏假單胞菌的應用，其特征在于，所述含氮水溶液為含有NH4+、NO3-和NO2-的一種或其組合的水溶液，所述施氏假單胞菌WZUF25脫Ν03_-Ν、ΝΗ4+-Ν和Ν02__Ν的碳源含有乙酸鈉、丁二酸鈉、甘油或葡萄糖的其中之一或其組合。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述含氮水溶液pH為4~10，所述施氏假單胞菌WZUF25于溫度20°C~45°C，溶氧為1.3~7.3mg.L—1的條件下對含氮水溶液進行脫氮。
8.權利要求1所述的施氏假單胞菌固定化制備微膠囊，其特征在于，步驟如下: .1)菌株WZUF25接種于LB培養基中培養后離心得菌體，菌體以蒸餾水洗滌，洗滌后的菌體與分散有活性炭粉末的海藻酸鈉溶液混合； .2)配制CaCl2水溶液中，于37°C水浴l(T30min后，將步驟I)所得混合液滴加入溫度37 0C的CaCl2水溶液中，得微膠囊。
9.權利要求8所述微膠囊的應用，其特征在于，所述微膠囊接種于含氮水溶液中，進行脫氮。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述含氮水溶液為含有NO3-或NO2-的一種或其組合的水溶液，所述固定化施氏假單胞菌WZUF25的微膠囊脫N03_-N、NH4+-N和Ν02__Ν的碳源含有乙酸鈉、丁二酸鈉、甘油或葡萄糖的其中之一或其組合。
【文檔編號】C12N11/04GK103497908SQ201310375037
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年8月26日 優先權日:2013年8月26日
【發明者】蔣張亮, 陳文雅, 練石金, 周茂洪, 李軍 申請人:溫州大學