基于環介導的等溫擴增的人呼吸道合胞病毒檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基于環介導的等溫擴增的人呼吸道合胞病毒檢測試劑盒。本發明人經過比較篩選，找到了針對RSV特異性良好的環介導等溫擴增引物，所述引物針對含有RSV以外的核酸不發生特異性擴增。本發明的方法可良好地應用于鑒定RSV成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。
【專利說明】基于環介導的等溫擴增的人呼吸道合胞病毒檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和核酸檢測【技術領域】。具體地，本發明涉及基于環介導的 等溫擴增的人呼吸道合胞病毒檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV)于1955年首次從黑猩猩 中分離出毒株。并于1955年從嬰兒中分離得到與黑猩猩中株有相同抗原特性的病毒株，在 隨后的研究中發現，該病毒以人為自然宿主，是引起人呼吸道感染的重要病原。該病毒在 體外感染細胞時會使相鄰的細胞形成合胞體，產生塊狀的細胞病變，并因而得名。RSV是不 分節段的負股單鏈RNA病毒，屬副粘病毒科，肺病毒亞科，肺病毒屬；與副流感病毒，麻疫病 毒，偏肺病毒屬同一科。
[0003] RSV感染人會引起上呼吸道感染，出現咳嗽，流涕，低燒等癥狀，下呼吸道感染在輕 度感染的嬰兒中也很普遍，長時間的RSV感染會引起細支氣管炎，哮喘及由肺炎引起的缺 氧，嚴重的可危及生命。RSV感染在嬰兒和成人中都有發生，但嬰兒，老人和有心肺疾病及免 疫缺陷的人更容易被感染，而且會表現出更嚴重的癥狀。大約2/3的嬰兒會在出生后的第 一年之內經歷RSV感染，大約90%的嬰兒會在第二年經歷RSV感染，幾乎所有的嬰兒都會在 出生兩年內經歷至少一次RSV感染，其中有一半會經歷兩次RSV感染。在小于5歲的兒童 中，20%的住院治療，18%的急診以及門診是由RSV感染引起的。兒童在最初幾年會經常性 的經歷RSV的重復感染，即使在成年后，RSV依然可以感染同一個體。RSV的重復感染不依 賴于抗原的改變。RSV在初次感染時會引起下呼吸道感染，但在再次感染時癥狀會減輕，成 人經歷RSV感染時基本沒有癥狀。6周到六個月的嬰兒最易發生嚴重的RSV感染，其高峰出 現在2到3月大小。
[0004] RSV的發病率隨季節而變化，在溫帶地區一般在每年的冬季和初春爆發，一二月份 為發病的高峰，在熱帶地區爆發于雨季。RSV依據抗體反應分為A，B兩個亞型，A型和B型 交替流行傳播，A性為主要流行亞型并具有更強的致病性。A型和B型的交替流行為RSV頻 繁的重復感染提供了一種可能的機制，即通過亞型交替可以規避由前一種流行亞型帶來的 宿主免疫機制。但同一亞型的重復感染也頻繁出現。
[0005] 現有技術中，呼吸道合胞病毒的檢測方法主要包括病毒培養分離，酶連免疫檢測， 熒光抗體檢測，膠體金快速檢測，多重PCR檢測，熒光定量PCR檢測，NASBA檢測（Nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依賴的擴增反應），基因芯片檢測的檢測 技術。
[0006] 病毒培養技術用收集的樣本與細胞共培養，通過觀察細胞病變或其他方法檢測病 毒的擴增來確定樣本中是否有病毒感染。此方法雖然是曾經的病毒感染檢測"金色標準"， 但只能檢測樣本中的具有感染能力的病毒顆粒，靈敏度不足。而且操作程序復雜，對實驗場 地和設備有生物安全等級要求，檢測過程長（至少要一周以上），不能用于現場檢測，對不 同病毒的檢測結果不同。
[0007] 基于抗體的酶標檢測，直接與間接熒光檢測以及膠體金快速檢測均利用抗原與抗 體之間的特異結合，通過偶聯了顯色基團的抗體實現對病原體的可視化檢測。抗體檢測不 依賴大型設備，而且檢測結果可在30分鐘以內得到。但抗體檢測由于沒有信號放大的過 程，靈敏性要比分子檢測低，而且結果容易出現假陽性及假陰性。由于新抗體的制備周期較 長，該方法很難用于新出現病毒的檢測，而且對于由抗原漂變產生的新的病毒亞型的檢測 能力也值得懷疑。
[0008] 病原的核酸分子檢測通過聚合酶對病原的核酸分子進行擴增，然后利用熒光，電 泳等方法對反應過程或產物進監測，根據反應是否進行或產物是否出現來判定病原是否出 現。與普通PCR相比多重定量PCR，可以實現多種病毒的同時檢測，而且反應過程可以實時 監測，還可以確定樣品中病原的量，靈敏度也高于普通PCR。但基于PCR的方法都需要熱循 環儀等設備，對檢測場地也有要求，定量PCR還需要專門訓練，這些都限制了 PCR相關技術 在快速檢測中的應用。
[0009] 基因芯片等基于雜交的檢測方法利用病毒特異的探針或探針組通過孵育，雜交， 顯色，結果掃描等步驟實現多種病毒的高通量檢測，但生產芯片需要昂貴的設備，雜交過程 耗時很久，結果檢測也需要特殊儀器及專業人員。這些都限制了該種技術在快速檢測中的 應用，使其只能作為一種研究手段實現對病原基因信息的分析。
[0010] NASBA也是一種恒溫，連續的酶介導的核酸擴增技術，該技術同時使用T7RNA聚合 酶，反轉錄酶，與核糖核酸酶同過轉錄與反轉錄過程的交替進行實現模板的擴增，但該技術 需要通過分子信標等熒光探針實現結果的檢測，因而需要特殊設備，且主要用于RNA模板 的檢測。由于結果檢測需要專門的設備，該技術主要用實驗室檢測，很難用于現場檢測。除 了 NASBA外還有SDA，HAD，RCA等恒溫擴增技術可能用于病原檢測。
[0011] LAMP (Loop-mediated isothermal amplification，環介導的等溫擴增）是于 2000 年首次報道并在其后經過不斷改進形成的一種等溫，連續，快速，高特異和可視化檢測的核 酸擴增方法。鑒于難以找到合適的、較廣譜的擴增引物，以及，難以實現根據顏色變化進行 結果判定，目前國內外還沒有RSV的RT-LAMP檢測產品出現。


【發明內容】

[0012] 本發明的目的在于提供基于環介導的等溫擴增的人呼吸道合胞病毒檢測方法以 及試劑盒。
[0013] 在本發明的第一方面，提供分離的多核苷酸，所述多核苷酸包括：
[0014] 呼吸道合胞病毒A亞型N基因編碼區第610-930位（即以N基因起始密碼子ATG 中A作為第1位起算）所示的多核苷酸；
[0015] 呼吸道合胞病毒B亞型L基因編碼區第2452-3052位（即以L基因起始密碼子 ATG中A作為第1位起算）所示的多核苷酸。
[0016] 在一個優選例中，所述的呼吸道合胞病毒A亞型N基因編碼區第610-930位所示 的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所不；
[0017] 所述的呼吸道合胞病毒B亞型L基因編碼區第2452-3052位所示的多核苷酸的核 苷酸序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。
[0018] 在本發明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制備鑒定呼吸道合胞病 毒的檢測試劑或試劑盒。
[0019] 在本發明的另一方面，提供一種鑒定呼吸道合胞病毒的方法，所述方法包括：以待 測樣品的RNA為模板，以特異性擴增引物進行擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中 包含呼吸道合胞病毒；
[0020] 其中，所述的特異性擴增引物包括：
[0021] 引物對 I :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ;
[0022] 引物對 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ;
[0023] 引物對 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ;
[0024] 引物對 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 ;
[0025] 引物對 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和
[0026] 引物對 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
[0027] 在一個優選例中，所述的擴增是環介導等溫擴增。
[0028] 在另一優選例中，所述的環介導等溫擴增條件是：
[0029] (1)60±2°C (較佳地 60±1°C )恒溫反應 60±10min(較佳地 60±5min);或
[0030] (2)① 60±2°C (較佳地 60土 1°C )30 秒，② 60°C ±2°C (較佳地 60土 1°C )30 秒 采集熒光；步驟①-②重復進行60± 10次（較佳地60±5次）。
[0031] 在另一優選例中，所述的環介導等溫擴增的體系中包括：引物對1-6混合物，環介 導等溫擴增反應緩沖液，Bst聚合酶，AMV RTase，熒光素（較佳地為鈣黃綠素）；其中，所述 的環介導等溫擴增反應緩沖液包括：甜菜堿，dNTP，Thermolpol RB,硫酸鎂，Tween-20。
[0032] 在另一優選例中，所述的熒光素是鈣黃綠素或SYBR Green I熒光染料。
[0033] 在另一優選例中，所述的熒光素是鈣黃綠素；還在體系中加入錳離子溶液（如氯 化錳）；在環介導等溫擴增反應結束后，在擴增產物中存在綠色，則表明擴增陽性；擴增產 物中存在橘黃色，則表明擴增陰性。
[0034] 在另一優選例中，所述鑒定呼吸道合胞病毒的方法是非疾病診斷方法。
[0035] 在另一優選例中，所述的引物以混合物的形式用于擴增，較佳地，
[0036] SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2在引物混合物中終濃度為0· 2 μ M ;
[0037] SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4在引物混合物中終濃度為L 6 μ M ;
[0038] SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6在引物混合物中終濃度為0· 8 μ M ;
[0039] SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO:8在引物混合物中終濃度為0· 2 μ M ;
[0040] SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10在引物混合物中終濃度為L 6 μ M ;
[0041] SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12在引物混合物中終濃度為0. 8 μ Μ。
[0042] 在本發明的另一方面，提供一種用于環介導等溫擴增的緩沖液，所述緩沖液包括： 甜菜喊，dNTP，Thermolpol RB,硫酸緩，Tween-20。
[0043] 在一個優選例中，所述的用于環介導等溫擴增的緩沖液中，甜菜堿0.5M， dNTPL 6mM，Thermolpol RBl X，硫酸鎂 6mM，Tween-200. 2%v/v。
[0044] 在本發明的另一方面，提供一種鑒定呼吸道合胞病毒的試劑盒，所述試劑盒中包 括：
[0045] 引物對 I :SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 ;
[0046] 引物對 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ;
[0047] 引物對 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ;
[0048] 引物對 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO:8 ;
[0049] 引物對 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和
[0050] 引物對 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
[0051] 在一個優選例中，所述試劑盒中還包括：
[0052] 所述的用于環介導等溫擴增的緩沖液或獨立分裝的甜菜堿、dNTP、Thermolpol RB、硫酸鎂和Tween-20 ;含有呼吸道合胞病毒的檢測標準品；RNA提取試劑；甜菜堿；Bst DNA聚合酶；AMV RTase ;和/或熒光素；如鈣黃綠素；較佳地還包括錳離子溶液；更佳地為 鈣黃綠素和氯化錳按濃度比1:100 (目視檢測），或1:200 (real-time檢測）配制而成的混 合液；說明鑒定呼吸道合胞病毒的方法的使用說明書。
[0053] 在本發明的另一方面，提供所述的試劑盒的用途，用于從待測樣品（如食品，離體 樣品，藥物）中鑒定呼吸道合胞病毒。
[0054] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055] 圖1、曲線為反應體系在565-590nm范圍內的發射熒光隨時間的變化，反應曲線 1-9依次對應實驗條件表中的1-9號實驗條件。
[0056] 圖2、上圖為用實驗一中的引物組與RSV標準株反應的目視結果，表7為照片中對 應編號的反應管內所加的模板；下圖為對應反應的實時熒光變化曲線。
[0057] 圖3、上圖為以RSV及相近種屬病毒的RNA為模板測試引物組反應是否特異針對 RSV，表9為上圖內反應體系對應的模板；下圖為對應管的實時熒光變化曲線。
[0058] 圖4、對RSAV A族毒株VR-1540 (上圖）和B族毒株VR-1400 (下圖）的RNA提取 液進行十倍倍比稀釋后的反應過程。上圖中，1號為陰性對照，2號為未稀釋的模板，3-8號 依次為對RSV模板進行10,100,1000,10000,100000,1000000倍稀釋。下圖中，Al號為陰性 對照，A2號為未稀釋的模板，A3-A8號依次為對RSV模板進行10,100,1000,10000,100000， 1000000倍稀釋。

【具體實施方式】
[0059] 本發明人經過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus，RSV)的環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amp I i fi cat ion，LAMP)檢測方法。經過比較篩選，找到了針對RSV特異性良好的引物，所述 引物針對含有RSV以外的核酸不發生特異性擴增。本發明的方法可良好地應用于鑒定RSV 成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。
[0060] 本發明人通過對大量RSV基因組序列的分析，找到了在很多RSV病毒基因組中相 對保守的序列區段。所述區段是呼吸道合胞病毒A亞型N基因編碼區第609-930位所示 的多核苷酸；呼吸道合胞病毒B亞型L基因編碼區第2452-3052位所示的多核苷酸。進 一步地，所述的呼吸道合胞病毒A亞型N基因編碼區第609-930位所示的多核苷酸的核 苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所示；所述的呼吸道合胞病毒B亞型L基因編碼區第 2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 52-61任一所示。上述相對保守 的區段可用于制備鑒定呼吸道合胞病毒的檢測試劑或試劑盒。
[0061] 基于上述RSV病毒基因組中相對保守的序列區段進行引物的篩選，獲得一類可特 異性鑒定RSV的引物，其對于RSV的RNA發生特異性擴增，而對其它病毒的核酸不發生特異 性擴增。
[0062] LAMP是近年來發展的一種新穎和較成熟的等溫核酸擴增技術。與PCR方法相比， LAMP不需要熱循環儀（PCR儀），且由于LAMP反應中產生大量的副產物-白色焦磷酸鎂沉 淀，擴增產物通過肉眼觀察或濁度計即可判定結果；因此LAMP適合于現場、戰時野外或條 件較差的實驗室進行快速檢測。LAMP技術以其快速、準確和操作簡便等優點在核酸的科學 研究、病原微生物鑒定和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。總體而言，LAMP法 是一種簡便、快速、高特異的基因擴增法，不需要特殊的試劑和儀器設備，采用該方法能建 立起總成本低廉的檢測體系。
[0063] 本發明采用環介導等溫擴增（LAMP)快速檢測技術，設計三對針對目的序列的八 段區域的引物，利用鏈置換聚合酶和擴增產物自身形成的可與引物結合的頸環結構實現目 的片段的循環擴增，最終產物為一系列不同長度的目的序列的串聯長鏈。該擴增方法的擴 增效率是PCR的100倍。同時反應的副產物焦磷酸根會大量積累，可以通過焦磷酸根和反 應體系內的鎂離子形成的白色沉淀的量來監測反應的進行程度并可用來判定結果的陽性 及陰性。也可以同過鈣黃綠素等金屬指示劑的變色反應來指示反應的進行，并可用來試試 監測反應進程。
[0064] 因此，本發明提供一種引物，所述的引物是LAMP擴增引物，包括：引物對I :SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2;引物對2:SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4;引物對3:SEQ ID N0:5和SEQ ID NO: 6 ;引物對 4 :SEQ ID NO: 7 和 SEQID NO: 8 ;引物對 5 :SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10 ; 和引物對 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
[0065] 本發明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物 質進行標記。
[0066] 利用本發明的引物，進行LAMP反應，可通過濁度儀檢測或顯色觀察，快速地判斷 待測樣品是否含有RSV。優選地，可應用熒光素來進行結果觀察。作為本發明的更優選方 式，LAMP反應體系中加入錳離子溶液；運用鈣黃綠素作為熒光素，LAMP熒光檢測試劑中的 鈣黃綠素初始與錳離子結合以產生驟冷效應。接著副產物的焦磷酸根與錳離子結合并從鈣 黃綠素上帶走錳離子使其產生熒光。由此管內出現熒光即表明目標基因被大量擴增。將含 有擴增產物和嵌入式熒光染料的離心管放入紫外燈下照射產生的熒光強度更甚。
[0067] 本發明還提供了一種鑒定RSV的方法，所述方法包括：以待測樣品的RNA為模板， 以特異性擴增RSV的引物進行擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含RSV。更 優選地，基于本發明所提供的適用于鑒定RSV的特異性引物，所述方法包括：以待測樣品的 RNA為模板，以引物對1?引物對6的混合引物進行擴增；若發生特異性擴增，則表明待測 樣品中包含RSV。
[0068] 獲取待測樣品的RNA的方法是本領域技術人員所熟知的技術，例如可采取傳統的 酚/氯仿/異戊醇法，或者可采用一些商購的RNA提取試劑盒，這類試劑盒是本領域技術人 員熟知的。
[0069] 本發明還涉及一種用于鑒定RSV的試劑盒，所述試劑盒中含有針對RSV的LAMP擴 增引物。
[0070] 此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定RSV的試劑，如（但不限于）：含有RSV的 檢測標準品；用于環介導等溫擴增的緩沖液；含有呼吸道合胞病毒的檢測標準品；RNA提取 試劑；甜菜堿；Bst DNA聚合酶；AMV RTase ;和/或熒光素（如鈣黃綠素；較佳地還包括錳 離子溶液；較佳地為為鈣黃綠素和氯化錳按濃度比1:100 (目視檢測），或1:200 (real-time 檢測）配制而成的混合液）；說明鑒定呼吸道合胞病毒的方法的使用說明書。
[0071] 此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定RSV的使用說明書和/或標準操作程序。
[0072] 本發明所述的試劑盒可實現快速檢測、批量檢測RSV的目的。
[0073] 本發明的主要優點在于：
[0074] (1)首次揭示一種可特異性鑒定RSV的引物，所述的引物特異性良好，對于RSV能 夠實現特異性擴增，而對于RSV以外的其它病毒基因組不能特異性擴增。并且，所述引物具 有良好的再現性、結果穩定可靠。
[0075] (2)利用所述的引物或含有所述引物的檢測試劑盒，可快速、大批量地檢測RSV， 從待測樣品中快速準確地區分RSV，并且所需樣品量少，操作簡單。
[0076] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0077] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0078] I.實驗材料和方法
[0079] 病毒樣品及RNA提取
[0080] 從上海南翔醫院收集從09年08月到12年12月的77個呼吸道的鼻咽拭子樣本， 將拭子浸入病毒運輸液中，待反應前將病毒運輸液分裝用于核酸提取。用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) RNA提取試劑盒提取樣本浸出液中的病毒RNA，并用無 RNA酶水洗 脫。洗脫液可以作為反應模板使用。
[0081] 病毒標準株包括 RSV A 族（VR-26, VR-1540)，RSV B 族（VR-1580, VR-955， VR-1400), Influenza B(VR-823), Rhinovirus(VR-283), Reovirus(VR-824), Mesales virus (VR-24)，coronavirus (VR-1558)，influenzaA (VR-825)，均購自 ATCC，括號內為 ATCC 編號。
[0082] LAMP反應緩沖液
[0083] 取 50mM 硫酸鎂 3 μ I，6M 甜菜堿 2· 08 μ I，IOmM dNTPs4 μ I，10 X Thermolpol RB2. 5 μ 1，4%Tween-201. 25 μ 1，2. 02 μ I無 RNA酶水或等比例放大得到反應體系的緩沖液， 每次反應加入14.85μ1。其中lOXThermolpol RB是NEB公司的Bst DNA聚合酶大片段的 反應緩沖液，由 200mM Tris-HCl，IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl，20mM MgSO4, l%Triton X-100 組成，ρΗ8·8。
[0084] 反應用酶
[0085] 每次反應加入8U/ μ 1的Bst聚合酶大片段1 μ 1，IOU/ μ 1的AMV反轉錄酶 0. 05 μ 1。
[0086] 顯色劑
[0087] IOX鈣黃綠素溶液（500 μ M :5mM):取100 μ IlmM鈣黃綠素母液與100 μ IlOmM氯 化錳混合或等比例擴大配制而成，每次反應加入1. 5 μ 1，用于反應結果的目視檢測。
[0088] IOX鈣黃綠素溶液（250 μ M :5mM):取50 μ IlmM鈣黃綠素母液與100 μ IlOmM氯化 錳以及50 μ 1雙蒸水混合或等比例擴大配制而成，每次反應加入1. 5 μ 1，用于反應過程的 實時監測。
[0089] RT-LAMP 反應
[0090] RT-LAMP反應體系如表1。
[0091] 表 1
[0092]

【權利要求】
1. 分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括： 呼吸道合胞病毒A亞型N基因編碼區第610-930位所示的多核苷酸； 呼吸道合胞病毒B亞型L基因編碼區第2452-3052位所示的多核苷酸。
2. 如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的呼吸道合胞病毒A亞型N基因編 碼區第610-930位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO: 13-51任一所示； 所述的呼吸道合胞病毒B亞型L基因編碼區第2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸 序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。
3. 權利要求1或2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制備鑒定呼吸道合胞病毒 的檢測試劑或試劑盒。
4. 一種鑒定呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，所述方法包括： 以待測樣品的RNA為模板，以特異性擴增引物進行擴增；若發生特異性擴增，則表明待 測樣品中包含呼吸道合胞病毒； 其中，所述的特異性擴增引物包括： 引物對 1 :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ; 引物對 2 :SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; 引物對 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ; 引物對 4 :SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ; 引物對 5 :SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ;和 引物對 6 :SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的擴增是環介導等溫擴增。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的環介導等溫擴增條件是： (1) 60±2°C恒溫反應 60±10min ;或 (2) @60±2°〇30秒，@601：±21：30秒采集熒光；步驟@-@重復進行60±10次。
7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的環介導等溫擴增的體系中包括：引物 對1-6混合物，環介導等溫擴增反應緩沖液，Bst聚合酶，AMV RTase，熒光素； 其中，所述的環介導等溫擴增反應緩沖液包括：甜菜堿，dNTP，Thermolpol RB，硫酸鎂， Tween-20。
8. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的熒光素是鈣黃綠素；還在體系中加入 錳離子溶液；在環介導等溫擴增反應結束后，在擴增產物中存在綠色，則表明擴增陽性；擴 增產物中存在橘黃色，則表明擴增陰性。
9. 一種用于環介導等溫擴增的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液包括：甜菜堿，dNTP， Thermolpol RB，硫酸緩，Tween-20。
10. 如權利要求9所述的用于環介導等溫擴增的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液中， 甜菜堿 〇? 5M，dNTPl. 6mM，Thermolpol RBI X，硫酸鎂 6mM，Tween-200. 2%v/v。
11. 一種鑒定呼吸道合胞病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括： 引物對 1 :SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ; 引物對 2 :SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ; 引物對 3 :SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ; 引物對 4 :SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ; 引物對 5 :SEQ ID N0:9 和 SEQ ID N0:10 ;和 引物對6:5￡〇10勵：11和5￡〇10勵：12。
12. 如權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括： 權利要求9所述的用于環介導等溫擴增的緩沖液或獨立分裝的甜菜堿、dNTP、 Thermolpo 1 RB、硫酸緩和 Tween-20 ; 含有呼吸道合胞病毒的檢測標準品； RNA提取試劑； 甜菜堿； Bst DNA聚合酶； AMV RTase ； 熒光素；和/或 說明鑒定呼吸道合胞病毒的方法的使用說明書。
13. 權利要求11或12所述的試劑盒的用途，用于從待測樣品中鑒定呼吸道合胞病毒。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419713SQ201310398466
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】藍柯, 穆永林, 陳倩倩, 張馳宇 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所