一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）微生物初篩（2）微生物復篩（3）發酵培養（4）提取硫酸軟骨素酶（5）軟骨預處理（6）酶解超濾（7）制硫酸軟骨素。本發明采用魚軟骨來提取鯊魚硫酸軟骨素，發酵產生的硫酸軟骨素酶活力高，通過用硫酸軟骨素酶酶解得到的小分子硫酸軟骨素，具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特點。酶解液使用超濾膜濃縮工藝，提高了產品的收率和純度。本發明的提取方法操作方便、周期短，易于操作可實現大規模的工業化生產。
【專利說明】一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法。

【背景技術】
[0002]硫酸軟骨素是自哺乳動物氣管等軟骨提取而得的酸性黏多糖。白色粉末，無臭，無味，易吸濕，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮等有機溶劑，遇水即膨脹或成黏漿，對熱較不穩定。需避光密封保存。軟骨素由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺組成的黏多糖。硫酸軟骨素是軟骨素的硫酸酯，構成結締組織的主要成分。它具有澄清脂質，提高機體解毒功能，利尿和鎮痛等作用。對膠原性疾患十分有效，對由鏈霉素引起的聽覺障礙也有效果。酸性黏多糖是生物體內結締組織基質中特有成分之一，硫酸軟骨素A為酸性黏多糖之一種。醫療上用于冠心病防治。
[0003]根據硫酸基在半乳糖上位置不同主要分為硫酸軟骨素A (CSA)硫酸軟骨素C(CSC)。近年來研究發現，硫酸軟骨素(CS)的相對分子量較大，它的大體積往往妨礙其順利的穿越細胞膜，因而不能在機體內良好發揮其多種藥理功能，而低分子量的硫酸軟骨素(LMWCHS)具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特點。
[0004]近年來，小分子硫酸軟骨素在防治冠心病、關節炎以及抗腫瘤等方面正日益受到廣泛重視，小分子硫酸軟骨素的制備主要通過硫酸軟骨素酶酶解獲得。硫酸軟骨素酶是一類主要存在于微生物體內，能將多種酸性粘多糖如硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、透明質酸等降解為寡糖及不飽和二糖的裂解酶。
[0005]目前由于硫酸軟骨素酶產量低，價格昂貴，嚴重制約了小分子硫酸軟骨素行業的發展，如何發明一種高效、操作方便、生產周期短、適合大規模工藝化生產的方法，從而生產出小分子的硫酸軟骨素，具有極其重要的意義。


【發明內容】

[0006]本發明為了克服現有技術中存在的上述缺點，提供了一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
(1)微生物初篩:用無菌水將土樣懸浮制成10%的土壤溶液，兩層濾紙抽濾后得澄清液體，將液體梯度稀釋至10_5，取稀釋液0.3ml涂布分離培養基平板培養，將單菌落用平板劃線分離方法在分離培養基平板上純化2次，挑取純化后的單菌落點種于初篩培養基平板，32 °C溫箱中培養6-7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，將產生透明圈的菌株利用劃線法保存于試管固體斜面培養基上并于4°C保存待用；
(2)微生物復篩:將產生透明圈的菌體接種于復篩培養基中，32°C，135r/min振蕩通氣培養2天，將菌液梯度稀釋至10_9，取0.3ml 10' 10_8、10_9的菌液，涂布于初篩培養基中，在32°C溫箱中培養6-7天后，通過測量挑選透明圈相對于菌落較大的菌株，接種于復篩培養基中，32°C、135r/min振蕩通氣培養24h，經平板菌落計數得菌體密度為2 X 107-3 X 107個/ml作為種子菌液，肉眼觀察菌落的形態特征； (3)發酵培養:按2-2.5% v/v接種量將種子菌液接入5L發酵罐中通過發酵培養基發酵，28-32。。，發酵 55-65h ；
(4)提取硫酸軟骨素酶:將所得發酵液置于離心機中，4°C、4200r/min離心35min，棄去菌體沉淀，冰浴，在磁力攪拌器的攪拌下，緩緩向發酵上清液中加入硫酸銨至90%的飽和度，4°C層析柜中靜置2天，然后4°C、4200r/min再次離心發酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4°C層析柜中透析脫鹽，在(NH4)2S04溶液檢測透析袋外液體不含S042—的情況下，冷凍干燥；
(5)軟骨預處理:選擇魚軟骨脫脂后將其粉碎，加入3-5%的氫NaOH溶液和氯化鈉溶液在溫度為50-60°C的條件下提取5-6h，過濾后調濾液pH=8-9 ；
(6)酶解超濾:向上述濾液加入軟骨投料重量3-5%的步驟(4)制作的硫酸軟骨素酶粉，在pH值為6-7，溫度為40-50°C的條件下酶解5-6h，在室溫下用截留分子量為8000的超濾膜超濾脫水濃縮至原體積的2/3 ；
(7)制硫酸軟骨素:將超濾脫水后的濃縮液調pH值為8-9,加入為軟骨投料重量2-3%的雙氧水，在溫度為25-35°C的條件下氧化5-6h過濾，濾液調pH值為5_6，加入95%乙醇結晶，使乙醇濃度達65-75%，結晶后離心、洗滌、干燥后得到魚硫酸軟骨素。
[0007]上述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟(1)中使用的培養基包括硫酸軟骨素 0.5%、(NH4)2S04 0.5%、Κ3Ρ04 0.05%、NaCl 0.6%，ρΗ=7.0。
[0008]上述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟(2)中使用的培養基包括硫酸軟骨素0.5%、CaS04.7Η20 0.6%、ΚΗ2Ρ04 0.05%、NaCl 0.6%、冰醋酸1%、酵母浸粉 0.8%, ρΗ=7.0。
[0009]上述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟(3)中選用的發酵培養基包括硫酸軟骨素0.7%、CaS04.7H20 0.7%、酵母浸粉0.7%、ΚΗ2Ρ04 0.05%、起始ρΗ=6.0。
[0010]本發明的有益效果:
本發明采用魚軟骨來提取鯊魚硫酸軟骨素，采用硫酸軟骨素酶酶解代替傳統的游離酶酶解工藝，發酵產生的硫酸軟骨素酶活力高，通過用硫酸軟骨素酶酶解得到的小分子硫酸軟骨素，具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特點。酶解液使用超濾膜濃縮工藝，大大減少了酒精的用量以及酒精回收的能耗，并提高了產品的收率和純度。本發明的提取方法操作方便、周期短，易于操作可實現大規模的工業化生產。

【具體實施方式】
[0011]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以助于理解本發明的內容。
[0012]實施例1
(1)微生物初篩:用無菌水將土樣懸浮制成10%的土壤溶液，兩層濾紙抽濾后得澄清液體，將液體梯度稀釋至10_5，取稀釋液0.3ml涂布分離培養基平板培養，將單菌落用平板劃線分離方法在分離培養基平板上純化2次，挑取純化后的單菌落點種于由硫酸軟骨素 0.5%、(NH4)2S04 0.5%、Κ3Ρ04 0.05%、NaCl 0.6% 組成的初篩培養基平板，控制 pH=7.0，在32 °C溫箱中培養6-7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，將產生透明圈的菌株利用劃線法保存于試管固體斜面培養基上并于4°C保存待用； (2)微生物復篩:將產生透明圈的菌體接種于復篩培養基中，32°C，135r/min振蕩通氣培養2天，將菌液梯度稀釋至10_9，取0.3ml 10_7的菌液，涂布于初篩培養基中，在32°C溫箱中培養6天后，通過測量挑選透明圈相對于菌落較大的菌株，接種于由硫酸軟骨素0.5%、CaS04.7H20 0.6%、ΚΗ2Ρ04 0.05%、NaCl 0.6%、冰醋酸 1%、酵母浸粉 0.8% 組成的復篩培養基中，控制pH=7.0，在32°C、135r/min振蕩通氣培養24h，經平板菌落計數得菌體密度為2X 107-3X 107個/ml作為種子菌液，肉眼觀察菌落的形態特征；
(3)發酵培養:按2%v/v接種量將種子菌液接入5L發酵罐中通過由硫酸軟骨素0.7%、CaS04.7Η20 0.7%、酵母浸粉0.7%、ΚΗ2Ρ04 0.05%組成的發酵培養基發酵，控制起始ρΗ=6.0，在28°C，發酵65h ；
(4)提取硫酸軟骨素酶:將所得發酵液置于離心機中，4°C、4200r/min離心35min，棄去菌體沉淀，冰浴，在磁力攪拌器的攪拌下，緩緩向發酵上清液中加入硫酸銨至90%的飽和度，4°C層析柜中靜置2天，然后4°C、4200r/min再次離心發酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4°C層析柜中透析脫鹽，在(NH4)2S04溶液檢測透析袋外液體不含S042—的情況下，冷凍干燥；
(5)軟骨預處理:選擇魚軟骨脫脂后將其粉碎，加入3-5%的氫NaOH溶液和氯化鈉溶液在溫度為50°C的條件下提取6h，過濾后調濾液pH=8-9 ；
(6)酶解超濾:向上述濾液加入軟骨投料重量3%的步驟(4)制作的硫酸軟骨素酶粉，在pH值為6-7，溫度為40°C的條件下酶解6h，在室溫下用截留分子量為8000的超濾膜超濾脫水濃縮至原體積的2/3 ；
(7)制硫酸軟骨素:將超濾脫水后的濃縮液調pH值為8-9,加入為軟骨投料重量2%的雙氧水，在溫度為25°C的條件下氧化5h過濾，濾液調pH值為5-6，加入95%乙醇結晶，使乙醇濃度達65%，結晶后離心、洗滌、干燥后得到魚硫酸軟骨素。
[0013]實施例2
(1)微生物初篩:用無菌水將土樣懸浮制成10%的土壤溶液，兩層濾紙抽濾后得澄清液體，將液體梯度稀釋至10_5，取稀釋液0.3ml涂布分離培養基平板培養，將單菌落用平板劃線分離方法在分離培養基平板上純化2次，挑取純化后的單菌落點種于由硫酸軟骨素 0.5%、(NH4)2S04 0.5%、Κ3Ρ04 0.05%、NaCl 0.6% 組成的初篩培養基平板，控制 pH=7.0，在32 °C溫箱中培養6-7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，將產生透明圈的菌株利用劃線法保存于試管固體斜面培養基上并于4°C保存待用；
(2)微生物復篩:將產生透明圈的菌體接種于復篩培養基中，32°C，135r/min振蕩通氣培養2天，將菌液梯度稀釋至10_9，取0.3ml 10_8的菌液，涂布于初篩培養基中，在32°C溫箱中培養6-7天后，通過測量挑選透明圈相對于菌落較大的菌株，接種于由硫酸軟骨素0.5%、CaS04.7H20 0.6%、ΚΗ2Ρ04 0.05%、NaCl 0.6%、冰醋酸 1%、酵母浸粉 0.8% 組成的復篩培養基中，控制PH=7.0，在32°C、135r/min振蕩通氣培養24h，經平板菌落計數得菌體密度為2X 107-3X 107個/ml作為種子菌液，肉眼觀察菌落的形態特征；
(3)發酵培養:按2.5% v/v接種量將種子菌液接入5L發酵罐中通過由硫酸軟骨素0.7%、CaS04.7H20 0.7%、酵母浸粉0.7%、ΚΗ2Ρ04 0.05%組成的發酵培養基發酵，控制起始ρΗ=6.0，在 32°C，發酵 55h ；
(4)提取硫酸軟骨素酶:將所得發酵液置于離心機中，4°C、4200r/min離心35min，棄去菌體沉淀，冰浴，在磁力攪拌器的攪拌下，緩緩向發酵上清液中加入硫酸銨至90%的飽和度，4°C層析柜中靜置2天，然后4°C、4200r/min再次離心發酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4°C層析柜中透析脫鹽，在(NH4)2S04溶液檢測透析袋外液體不含S042—的情況下，冷凍干燥；
(5)軟骨預處理:選擇魚軟骨脫脂后將其粉碎，加入5%的氫NaOH溶液和氯化鈉溶液在溫度為60°C的條件下提取5h，過濾后調濾液pH=8-9 ；
(6)酶解超濾:向上述濾液加入軟骨投料重量3-5%的步驟(4)制作的硫酸軟骨素酶粉，在pH值為6-7，溫度為50°C的條件下酶解5h，在室溫下用截留分子量為8000的超濾膜超濾脫水濃縮至原體積的2/3 ；
(7)制硫酸軟骨素:將超濾脫水后的濃縮液調pH值為8-9,加入為軟骨投料重量3%的雙氧水，在溫度為35°C的條件下氧化5h過濾，濾液調pH值為5-6，加入95%乙醇結晶，使乙醇濃度達75%，結晶后離心、洗滌、干燥后得到魚硫酸軟骨素。
[0014]實施例3
(1)微生物初篩:用無菌水將土樣懸浮制成10%的土壤溶液，兩層濾紙抽濾后得澄清液體，將液體梯度稀釋至10_5，取稀釋液0.3ml涂布分離培養基平板培養，將單菌落用平板劃線分離方法在分離培養基平板上純化2次，挑取純化后的單菌落點種于由硫酸軟骨素 0.5%、(NH4)2S04 0.5%、Κ3Ρ04 0.05%、NaCl 0.6% 組成的初篩培養基平板，控制 pH=7.0，在32 °C溫箱中培養6-7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，將產生透明圈的菌株利用劃線法保存于試管固體斜面培養基上并于4°C保存待用；
(2)微生物復篩:將產生透明圈的菌體接種于復篩培養基中，32°C，135r/min振蕩通氣培養2天，將菌液梯度稀釋至10_9，取0.3ml 10_9的菌液，涂布于初篩培養基中，在32°C溫箱中培養6-7天后，通過測量挑選透明圈相對于菌落較大的菌株，接種于由硫酸軟骨素0.5%、CaS04.7H20 0.6%、ΚΗ2Ρ04 0.05%、NaCl 0.6%、冰醋酸 1%、酵母浸粉 0.8% 組成的復篩培養基中，控制PH=7.0，在32°C、135r/min振蕩通氣培養24h，經平板菌落計數得菌體密度為2X 107-3X 107個/ml作為種子菌液，肉眼觀察菌落的形態特征；
(3)發酵培養:按2.5% v/v接種量將種子菌液接入5L發酵罐中通過由硫酸軟骨素0.7%、CaS04.7H20 0.7%、酵母浸粉0.7%、ΚΗ2Ρ04 0.05%組成的發酵培養基發酵，控制起始ρΗ=6.0，在 32°C，發酵 55h ；
(4)提取硫酸軟骨素酶:將所得發酵液置于離心機中，4°C、4200r/min離心35min，棄去菌體沉淀，冰浴，在磁力攪拌器的攪拌下，緩緩向發酵上清液中加入硫酸銨至90%的飽和度，4°C層析柜中靜置2天，然后4°C、4200r/min再次離心發酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4°C層析柜中透析脫鹽，在(NH4)2S04溶液檢測透析袋外液體不含S042—的情況下，冷凍干燥；
(5)軟骨預處理:選擇魚軟骨脫脂后將其粉碎，加入4%的氫NaOH溶液和氯化鈉溶液在溫度為55°C的條件下提取5.5h，過濾后調濾液pH=8-9 ；
(6)酶解超濾:向上述濾液加入軟骨投料重量4%的步驟(4)制作的硫酸軟骨素酶粉，在pH值為6-7，溫度為45°C的條件下酶解5.5h，在室溫下用截留分子量為8000的超濾膜超濾脫水濃縮至原體積的2/3 ；
(7)制硫酸軟骨素:將超濾脫水后的濃縮液調pH值為8-9,加入為軟骨投料重量3%的雙氧水，在溫度為30°C的條件下氧化6h過濾，濾液調pH值為5-6，加入95%乙醇結晶，使乙醇濃度達70%，結晶后離心、洗滌、干燥后得到魚硫酸軟骨素。
[0015]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，并不局限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本專利揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)微生物初篩:用無菌水將土樣懸浮制成10%的土壤溶液，兩層濾紙抽濾后得澄清液體，將液體梯度稀釋至10_5，取稀釋液0.3ml涂布分離培養基平板培養，將單菌落用平板劃線分離方法在分離培養基平板上純化2次，挑取純化后的單菌落點種于初篩培養基平板，32 0C溫箱中培養6-7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，將產生透明圈的菌株利用劃線法保存于試管固體斜面培養基上并于4°C保存待用； (2)微生物復篩:將產生透明圈的菌體接種于復篩培養基中，32°C，135r/min振蕩通氣培養2天，將菌液梯度稀釋至10_9，取0.3ml 10' 10_8、10_9的菌液，涂布于初篩培養基中，在32°C溫箱中培養6-7天后，通過測量挑選透明圈相對于菌落較大的菌株，接種于復篩培養基中，320C、135r/min振蕩通氣培養24h，經平板菌落計數得菌體密度為2 X 107-3 X 17個/ml作為種子菌液，肉眼觀察菌落的形態特征； (3)發酵培養:按2-2.5% v/v接種量將種子菌液接入5L發酵罐中通過發酵培養基發酵，28-32。。，發酵 55-65h ； (4)提取硫酸軟骨素酶:將所得發酵液置于離心機中，4°C、4200r/min離心35min，棄去菌體沉淀，冰浴，在磁力攪拌器的攪拌下，緩緩向發酵上清液中加入硫酸銨至90%的飽和度，4°C層析柜中靜置2天，然后4°C、4200r/min再次離心發酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4°C層析柜中透析脫鹽，在(NH4)2SO4溶液檢測透析袋外液體不含SO/—的情況下，冷凍干燥； (5)軟骨預處理:選擇魚軟骨脫脂后將其粉碎，加入3-5%的氫NaOH溶液和氯化鈉溶液在溫度為50-60°C的條件下提取5-6h，過濾后調濾液pH=8-9 ； (6)酶解超濾:向上述濾液加入軟骨投料重量3-5%的步驟(4)制作的硫酸軟骨素酶粉，在PH值為6-7，溫度為40-50°C的條件下酶解5-6h，在室溫下用截留分子量為8000的超濾膜超濾脫水濃縮至原體積的2/3 ； (7)制硫酸軟骨素:將超濾脫水后的濃縮液調pH值為8-9,加入為軟骨投料重量2-3%的雙氧水，在溫度為25-35°C的條件下氧化5-6h過濾，濾液調pH值為5_6，加入95%乙醇結晶，使乙醇濃度達65-75%，結晶后離心、洗滌、干燥后得到魚硫酸軟骨素。
2.根據權利要求1所述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟(I)中使用的培養基包括硫酸軟骨素0.5%、(NH4)2SO4 0.5%、K3PO4 0.05%、NaCl 0.6%，pH=7.0。
3.根據權利要求1所述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟(2)中使用的培養基包括硫酸軟骨素0.5%、CaS04.7Η20 0.6%,KH2PO4 0.05%,NaCl 0.6%、冰醋酸1%、酵母浸粉0.8%，ρΗ=7.0。
4.根據權利要求1所述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟(3)中選用的發酵培養基包括硫酸軟骨素0.7%、CaS04.7Η20 0.7%、酵母浸粉0.7%,KH2PO4.0.05%、起始 ρΗ=6.0。
【文檔編號】C12P19/26GK104450831SQ201310427809
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月21日 優先權日:2013年9月21日
【發明者】李妮 申請人:青島藍農谷農產品研究開發有限公司