殺葉甲科害蟲的白僵菌菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種針對林業重要害蟲，特別針對鞘翅目葉甲科害蟲榆藍葉甲具有高毒殺能力的白僵菌新菌株XWY-1。毒力測試表明，XWY-1菌株對鞘翅目葉甲科害蟲榆藍葉甲具有極高的毒力，因而，可以將本發明白僵菌（Beauveriabassiana）XWY-1制成殺蟲劑，用于林業害蟲的防治，從而降低農藥的使用量，減少環境污染，保護天敵，具有重要的經濟價值和應用前景。
【專利說明】殺葉甲科害蟲的白僵菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物新菌株及其應用，具體地說是一種白僵菌及其在林業害蟲防治中的應用。
【背景技術】
[0002]白僵菌(及?awreria如是一類寄生昆蟲的病原真菌，以粘附在蟲體表皮或腸胃，快速繁殖，造成害蟲死亡，并以分生孢子造成害蟲流行感染。白僵菌是我國研究時間最長、應用面積較大的真菌殺蟲劑。從上個世紀60年代起，國內開始研究利用白僵菌防治林業害蟲松毛蟲和農業害蟲玉米螟，至70年代，開發出固相培養和液固兩相生產方法和應用技術，并陸續建廠生產白僵菌粗產品，大面積防治松毛蟲和玉米螟。目前，針對松毛蟲、天牛、小蠹蟲、象甲及木蠹蛾等重要林業害蟲進行了較多的白僵菌研究及應用工作，尚未有白僵菌防治林業害蟲榆藍葉甲的研究報道。
[0003]榆藍葉甲屬鞘翅目葉甲科，又名榆綠葉甲、榆毛胸繭葉甲、榆藍金花蟲。榆藍葉甲以成蟲和幼蟲危害榆樹葉片，嚴重發生時可將葉片食成網狀，甚至將樹冠葉片全部食光；成蟲還有進入公共場所、居民家中擾民的習性；榆藍葉甲化蛹前大量老熟幼蟲群集樹干分叉處和樹皮縫隙間，影響環境衛生，影響樹木的樹勢和景觀效果。上世紀六七十年代榆藍葉甲曾在我國爆發，造成榆樹在我國幾乎絕種。葉甲類害蟲對有機磷、有機氯、菊脂類農藥較為敏感，此類藥物雖然能夠取得短期效果，但同時也帶來一些弊端，如增強害蟲抗藥性、污染環境、殺傷鳥類、造成害蟲再度猖獗的惡性循環，不能達到對害蟲種群的有效控制。因此為了減少常規化學農藥對城市環境的污染及對居民健康的影響，榆藍葉甲防治需要安全有效、保護天敵的生物農藥，篩選對榆藍葉甲有高致病性的白僵菌是防治榆藍葉甲的有效的方法之一。

【發明內容】
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[0004]本發明的目的是提供一種針對林業重要害蟲，特別針對鞘翅目葉甲科害蟲榆藍葉甲具有聞毒殺能力的白僵菌新菌株。
[0005]本發明所提供新菌株是白僵菌如 s1sia/?a)XWY-l,該菌株已于2012年9月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6626。
[0006]XffY-1菌株是2010年河北省農林科學院植物保護研究所在河北雄縣甘薯田采集到的白色感病昆蟲上分離得到的。將分離到的XWY-1菌株接種在SDAY (蛋白胨10 g，酵母
10g，葡萄糖40 g，瓊脂15 g，蒸餾水I 000 mL，自然pH)平板培養基上，觀察菌落形態特征、產孢特征等。結果顯示在SDAY培養基上培養7天，菌落初期白色茸狀，產孢時乳白色，孢子層厚且均勻，中心至邊緣呈丘狀凸起，具同心紋。菌絲具分枝分隔，透明、光滑，有時成簇生長。產孢細胞濃密簇生于短而膨大的柄細胞上，產孢細胞上部“之”字形，頂端漸變細長；分生孢子為近球形，單細胞，孢子大小為1.1-2.2X1.5-2.7Mm。從以上特征看，菌株XWY-1為球孢白僵菌。XWY-1菌株菌落照片如圖1所示，XWY-1菌株孢子及菌絲照片如圖2所示。[0007]進一步的分析結果表明，與XWY-1菌株ITS序列最為接近的為球孢白僵菌，其ITS序列同源性為99%，結合XWY-1菌株的形態學特點，將該菌株鑒定為球孢白僵菌。
[0008]對XWY-1菌株進行毒力測試，發現該菌株濃度I X IO8孢子/mL的孢懸液對榆藍葉甲I齡、2齡、3齡幼蟲、成蟲、蛹7天的校正死亡率分別為92.3%,86.4%,82.3%,79.8%、38.5%。XffY-1菌株在第5~7天對榆藍葉甲2齡幼蟲的LC50分別為3.14X 107、8.05X IO6,
7.57 X IO5孢子/mL，對榆藍葉甲成蟲的LC50為2.46 X IO7孢子/mL。因此，XWY-1菌株對榆藍葉甲不同齡期的幼蟲和成蟲均有很高的殺蟲活性。
[0009]上述毒力測試表明，XWY-1菌株對鞘翅目葉甲科害蟲榆藍葉甲具有極高的毒力，因而，可以將本發明白僵菌(及?bassiana ) XffY-1制成殺蟲劑,用于林業害蟲的防治，從而降低農藥的使用量，減少環境污染，保護天敵，具有重要的經濟價值和應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】[0010]圖1為XWY-1菌株菌落照片；
圖2為XWY-1菌株孢子及菌絲照片；
圖3為XWY-1菌株感染的榆藍葉甲幼蟲；
圖4為XWY-1菌株感染的榆藍葉甲成蟲。
【具體實施方式】[0011 ] 實施例1:XWY-1菌株獲取的工作流程 田間采集自然感病僵蟲一直接分離純化菌株一接種榆藍葉甲幼蟲測定殺蟲毒力一獲得高毒力菌株XWY-1 —菌株形態、孢子形態、鑒定一提取菌株DNA，以真菌ITS序列通用引物擴增菌株DNA，將獲得的擴增序列測序并在GenBank中對比一確定菌株XWY-1為球孢白僵菌。
[0012]實施例2 =XffY-1菌株的篩選分離過程 XWY-1菌株是2010年河北省農林科學院植物保護研究所在河北雄縣甘薯田調查時采集到的白色感病昆蟲上分離得到的。將白色感病昆蟲帶回實驗室后保濕處理，待其體表產生孢子時，將孢子接種在SDAY (蛋白胨10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，瓊脂15 g，蒸餾水I000 mL,自然pH)平板培養基上培養至產生分生孢子，收集分生孢子，冷凍干燥后4°C備用。
[0013]實施例3:菌株培養及孢懸液配制 將XWY-1菌株接種于SDAY平板培養基上，25± I°C恒溫光照(14L: 10D)培養。形成分生孢子后用0.05%(v/v)無菌吐溫80水溶液收集孢子，經磁力攪拌器攪拌30 min，將孢子完全均勻打散后經4層無菌紗布過濾，獲得純孢子懸浮液，以血球計數板計數并配制成梯度濃度的孢懸液，用于致病力測定。
[0014]實施例4 =XffY-1菌株對榆藍葉甲的殺蟲活性XWY-1菌株對榆藍葉甲成蟲、幼蟲及蛹的殺蟲活性測定:飼養塑料盒用次氯酸鈉100倍液浸泡I h，晾干。挑取大小一致、健康活潑的榆藍葉甲試蟲，將不同濃度的XWY-1孢懸液分別噴灑于試蟲體表，并用濾紙吸去多于水分，以0.05% (V/V)吐溫-80水懸液處理作為對照，置于26±1°C、光周期14 h:10 h (L:D)條件下飼養，將新鮮榆葉用脫脂棉保濕飼喂試蟲。每處理30頭試蟲，設3次重復，施藥后定期調查死亡蟲數，并及時更換餌料。數據統計分析應用SPSS 18.0軟件進行數據處理。
[0015]從表1、2、3中可以看出，XWY-1菌株對榆藍葉甲幼蟲及成蟲均有較高毒力，濃度I X IO8孢子/mL的孢懸液對榆藍葉甲I齡、2齡、3齡幼蟲、成蟲、蛹7天的校正死亡率分別為92.3%,86.4%,82.3%,79.8%,38.5%。XffY-1在第5~7天對榆藍葉甲幼蟲的LC50分別為
3.14Χ107、8.05Χ106、7.57Χ105 孢子 /mL，對榆藍葉甲成蟲的 LC50 為 2.46X 107 孢子 /mL。可以看出，XWY-1菌株對榆藍葉甲不同齡期的幼蟲和成蟲均有很高的殺蟲活性。圖3為榆藍葉甲幼蟲感染XWY-1菌株的情況；圖4為榆藍葉甲成蟲感染XWY-1菌株的情況。
【權利要求】
1.白僵菌(此aweria知Miaaa) XWY-1，保藏號為 CGMCC N0.6626。
2.含有權利要求1所述菌株的微生物殺蟲劑。
3.權利要求1所述菌株或權利要求2所述微生物殺蟲劑在林業害蟲防治中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述害蟲為鞘翅目害蟲。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述害蟲為鞘翅目葉甲科害蟲。
6.根據權利要求5所述的應用，其`特征在于，所述害蟲為榆藍葉甲。
【文檔編號】C12R1/645GK103555589SQ201310428019
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】杜立新, 曹偉平, 宋健, 馮書亮, 王金耀 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所