定點突變獲得的谷氨酸脫羧酶突變體基因及其編碼蛋白質和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種谷氨酸脫羧酶突變體，酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突變為中性氨基酸，其DNA序列分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2，該突變體蛋白的氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。本發明利用DNA定點突變技術，對野生型谷氨酸脫羧酶GadB1編碼基因進行分子改造，得到了兩種突變體酶GadB1E312S和GadB1E91Q，相對野生酶其有效pH作用范圍得到一定的擴展，尤其在偏中性pH條件下仍具有較好的活性。隨著有效pH作用范圍的拓寬，突變酶在pH5.5～6.5條件下，仍然具有較高的催化活性，因此解決了谷氨酸脫羧酶催化GABA生物合成時，在pH5.5～6.5時，催化能力低的問題，為利用該酶及其編碼基因來生物合成GABA創造好的條件。
【專利說明】定點突變獲得的谷氨酸脫羧酶突變體基因及其編碼蛋白質和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及兩種谷氨酸脫羧酶突變體基因及其應用，屬于分子生物學的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]定點突變(site-directed mutagenesis)屬于理性設計,是指在目的DNA片段的指定位點引入特定的堿基對，從而改變其編碼的氨基酸序列的技術(圖2)。它是研究蛋白質結構與功能之間的復雜關系的強有力的工具，也是實驗室常用的基因改造的手段。對某個已知的基因的特定喊基進行定點改造、缺失、或者插入，可以改變對應氣基酸序列和蛋白質的結構和功能特征，有助于了解蛋白質結構和功能的關系。
[0003]谷氛酸脫竣酶(glutamatedecarboxylase,簡稱 GAD ；EC4.1.1.15)以 PLP 作為輔酶，催化谷氨酸發生不可逆的α-脫酸反應，過程中消耗一個質子，生成Υ-氨基丁酸(Y-aminbutyric，簡稱GABA)。GAD廣泛存在于動物、植物、微生物中，但是在它們的機體里面的功能各不相同。其中在動物中主要是產生GABA，一種中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，因此具有重要的生理功能；在植物中，GAD系統可以抵抗多種壓力，如驟然高溫、缺氧、鈣離子驟增等；在微生物中，特別是一些腸道細菌，如大腸桿菌、乳酸菌等，主要與機體耐酸機制有關，它們的最適PH—般在4~5，在此范圍之外酶活力會大幅降低，尤其是當pH大于6時基本失去活性，這使得利用該酶生物合成GABA受到體系pH值的嚴重限制，因此需要拓寬GAD酶的pH作用范圍，使其在偏中性條件下，仍具有較好的活性，解決谷氨酸脫羧酶催化GABA生物合成時，在pH5.5~6.`5時，催化能力低的問題，為利用該酶及其編碼基因來生物合成GABA創造好的條件。

【發明內容】

[0004]本發明提供了一種谷氨酸脫羧酶突變體，其酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突變為中性氨基酸。
[0005]所述谷氨酸脫羧酶突變體為第312位谷氨酸突變為絲氨酸，核苷酸序列如SEQ IDN0.1，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
[0006]所述谷氨酸脫羧酶突變體為第91位谷氨酸突變為谷氨酰胺，其核苷酸序列如SEQID N0.3，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4。
[0007]本發明還提供了一種獲得所述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，其特征在于:在中國專利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基礎上，對其編碼的氨基酸進行取代，所述氨基酸取代點分別為第312位的谷氨酸和第91位的谷氨酸。
[0008]上述任一突變體基因及其所編碼的酶在生物合成GABA的應用均屬于本發明要求保護的范圍。
[0009]本發明還提供一種生產上述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，將SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表達該酶的質粒為表達載體，以大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表達該酶的菌株為表達宿主，實現突變體基因gadBIe312s 和 gadBIe91q 的高效表達。
[0010]本發明中表達單元的啟動子為常用的T7啟動子，在T7啟動子的作用下，突變體酶可以直接在宿主細胞E.coli BL2KDE3)中，完成胞內的可溶性表達。
[0011]本發明所用的谷氨酸脫羧酶的基因gadBl來自產Y-氨基丁酸的短乳桿菌，該菌株已于2010年12月27日，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國武漢、武漢大學，保藏編號:CCTCC NO:M2010367，分類學命名短乳桿菌 Lb85 (Lactobacillus brevis Lb85),gadBl的測序結果在中國專利CN201110020606.8中已經公布，序列見SEQ ID N0.5。
[0012]本發明提供的突變體酶在偏中性條件下，酶活有明顯的提高，解決了野生型的谷氨酸脫羧酶在偏中性PH條件下催化活性低的問題，為利用該酶催化GABA生物合成創造好的條件。
[0013]本發明通過比較野生酶GadBl和突變酶GadBlE312S、GadBIe91q的有效作用pH范圍和體外的催化能力，結果發現在PH6.5下，突變體酶GadBlE91Q將L-谷氨酸轉變成GABA的轉化率為野生型的5.7倍；突變體酶GadBlE312S將L-谷氨酸轉變成GABA的轉化率為野生型的
3.6 倍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為重組質粒pET28a(+)-gadBl的構建圖譜: [0015]圖2為定點突變的原理示意圖:
[0016]圖3為野生型和突變型酶純化后的SDS-PAGE圖譜:
[0017]圖4為野生和突變酶的最適pH變化圖:
【具體實施方式】
[0018]以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發明范圍。材料和試劑:
[0019]所用的限制性內切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑等均購于TaKaRa寶生物公司；質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒、瓊脂糖純化試劑盒、大腸桿菌JM109、BL21(DE3)菌株購于天跟生物公司；引物購于上海捷銳公司；SDS-PAGE試劑盒購于碧云天生物公司；其他試劑均為國內或者國外購買的分析純試劑。
[0020]實施例一:重組質粒的構建
[0021]將L.brevis Lb85培養至指數生長中期,取3mL菌液12000rpm離心Imin棄上清，溶菌酶處理0.5h，然后按照試劑盒說明提取基因組DNA。
[0022]設計如下的引物來用于gadBl的擴增:
[0023]gadB1-F:5’ -GACCGCTCATATGGCTATGTTGTATGGAAAAC-3>
[0024]gadB1-R: 5，~CGTGAATTCTTAGTGCGTGAACCCGTATT~3，
[0025]其中上游引物酶切位點為NdeI CgadBl-F中下劃線部分)，下游引物酶切位點為EcoRI (gadBl-R中下劃線部分)。
[0026]PCR擴增條件:94°C變性 5min，34個循環(95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s)，最后 72°C延伸IOrnin0
[0027]擴增產物純化后，用NdeI和EcoRI對PCR產物和載體pET28a進行雙酶切，兩者的回收產物，用T4連接酶22°C下連接4h，化學轉化到JM109細胞中，待平板上長出轉化子之后，挑取轉化子液體培養，提取質粒，通過酶切和PCR驗證獲得重組質粒pET28a-gadBl (圖1)，然后將重組質粒轉到BL21 (DE3)細胞，得到BL21 (DE3)/pET28a-gadBl工程菌。
[0028]實施例二:定點突變
[0029]定點突變原理:點突變質粒的構建采用Dpn I法(圖2)。根據待突變的氨基酸位點來設計PCR點突變引物，以pET-28a-gadBl質粒為模板，以設計的相關的正向引物及其互補引物(反向引物)，通過PCR擴增出產物。
[0030]E91Q-正向引物:CGCCATCGATAAATCCCAGTATCCTCGGACCGCT[0031 ] E9IQ-反向引物:GCGGTAGCTATTTAGGGTCA TAGGAGCCTGGCGA
[0032]E312S-正向引物:AGCTACTTGGGTGGTAGTCTACCTACGATGGCC
[0033]E312S-反向引物:GGCCATCGTAGGTAGACTACCACCCAAGTAGCT ；
[0034]其中下劃線部分分別代表突變體基因編碼的91位谷氨酰胺和312位絲氨酸所對應的密碼子。PCR擴增體系為:質粒DNA0.5 μ L，5XPrimer star Buffer5 μ L，引物各
0.5 μ L，dNTP2 μ L, Primer star0.25 μ L, ddH20 補至 25 μ L, PCR 擴增條件 95°C變性 lmin,循環 18 次(95°C 40s, 500C 15s,68°C 6min30s), 72°C IOmin0
[0035]PCR產物用Dpn I酶在37°C處理3h，去除模板DNA，消化產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，得到相關突變株的轉化子，提取質粒，經過EcoRI單酶切和突變基因PCR擴增、測序，得到正確突變株，將構建成功的重組質粒轉入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到待表達的突變株。
[0036]實施例三:野生酶和突變酶的表達純化
[0037]表達:BL21(DE3)/pET28a-gadBl、BL21 (DE3)/pET28a_gadBlE91Q、BL21 (DE3) /pET28a-gadBIe312s接種于含有30mg/L卡拉霉素的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養至OD600至3.0~5.0，將其轉接種到含有30mg/L卡拉霉素的裝液量為500mL LB液體培養基的2L三角瓶中，控制初始OD6tltl為0.02，在37°C、200rpm下培養至OD6tltl在0.7~0.9范圍內，加入ImM IPTG進行誘導，然后28°C、200rpm誘導表達培養8h。
[0038]提取:菌液在AOOOrpnufC的條件下,離心20min,棄上清液；然后加入40mL、pH8.0裂解緩沖液吹打混勻菌體，之后在4000rpm、4°C離心20min，倒掉上清液，重復2次。稱量菌體的濕重，加入菌體濕重10倍體積的裂解緩沖液，超聲破碎15min，向破碎液中加入l%Triton X-100 (把膜上的目的蛋白分離下來)和ImM PMSF (防止目的蛋白分解)，在冰上放置Ih后，在4°C、12000rpm離心60min，收集上清即為粗酶液，最后用孔徑0.22 μ m水系膜過濾，即得Ni柱上樣樣品。
[0039]純化:采用N1-NTA親和層析柱對上一步所得的樣品進行分離純化。經過上樣、漂洗和洗脫，收集含有目的蛋白的洗脫液，SDS-PAGE分析(圖3)，然后通過透析除去小分子即得到純酶。測定純酶的濃度。
[0040]所涉及緩沖液配制:
[0041]裂解緩沖液:50mM NaH2PO4.2H20, 300mM NaCl，ImM PMSF (溶解在無水乙醇中配成200mM的母液在-20°C中保存)，IOmM咪唑，用NaOH調至pH8.0。[0042]漂洗緩沖液:50mMNaH2PO4.2H20, 300mM NaCl，ImM PMSF, 20mM 咪唑，用 NaOH 調至ρΗ8.00
[0043]洗脫緩沖液:50mMNaH2PO4.2Η20，300mM NaCl，ImM PMSF, 250mM 咪唑，用 NaOH調至ρΗ8.00
[0044]透析緩沖液:0.02M、pH4.6的HAC-NaAC緩沖液。
[0045]實施例四:野生酶和突變酶的最適pH測定
[0046]將上一步得到的純酶液稀釋至濃度為2.5mg/mL，然后分別進行酶促反應。酶促反應總體積為500 μ L，取490 μ L0.2Μ的不同pH(3.0~7.0)的緩沖液，其中含有0.01mM PLP、IOOmM L-谷氨酸鈉，加入10 μ L酶液，在反應之前分別把緩沖液和酶液在40°C下預熱5min，然后混勻，在40°C下反應30min，最后迅速煮沸終止反應，離心，用5%三氯乙酸(TCA)稀釋5倍，在4°C冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC檢測。
[0047]得到的結果如附圖4:相關的突變酶與野生酶相比，有效pH作用范圍拓寬；因此能夠更好的運用突變體酶，在PH5.5~6.5的條件下，催化GABA的生物合成。
[0048]實施例五:野生酶和突變酶體外的催化能力比較
[0049]為了測定突變體酶在偏中性條件下的生物催化能力，將純化的野生型酶和突變體酶分別在PH6.5下催化L-谷氨酸鈉發生脫羧反應2h，結果發現在pH6.5下，突變酶GadBlE91Q將L-谷氨酸轉變成GABA的轉化率為野生酶GadBl的5.7倍；突變酶GadBlE312S將L-谷氨酸轉變成GABA的轉化率為野生酶G`adBl的3.6倍。
【權利要求】
1.一種谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于酶活性中心附近的酸性氨基酸谷氨酸突變為中性氨基酸。
2.權利要求1所述的谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于:核苷酸序列如SEQID N0.1。
3.權利要求1或2所述的谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于:第312位谷氨酸突變為絲氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
4.權利要求1所述的谷氨酸脫羧酶突變體其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0.3。
5.權利要求1或4所述的谷氨酸脫羧酶突變體，其特征在于--第91位谷氨酸突變為谷氨酰胺，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4。
6.獲得權利要求3或5所述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，其特征在于:在中國專利CN201110020606.8中公布的gadBl基因序列基礎上，對其編碼的氨基酸進行取代，所述氨基酸取代點分別為第312位的谷氨酸和第91位的谷氨酸。
7.權利要求1，2，4任一所述突變體基因及其所編碼的酶在生物合成GABA的應用。
8.—種生產權利要求3或5所述谷氨酸脫羧酶突變體的方法，其特征是將SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列以pET28a或能表達該酶的質粒為表達載體，以大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)或能表達該酶的菌株為表達宿主，實現突變體基因gadBIe312s和gadBl酬的高`效表達。
【文檔編號】C12P13/00GK103484444SQ201310438163
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】史鋒, 謝一龍, 李永富, 王小元 申請人:江南大學