一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有胰蛋白胨0.5g/L，α-乳糖2.5g/L，Zn2+1.3g/L，VB40.1g/L，乳化橄欖油50g/L(誘導產(chǎn)生脂肪酶），培養(yǎng)基初始pH=7.1。該方法通過將發(fā)酵種子液接種于上述產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量10%，于25℃，轉速120r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，具有脂肪酶產(chǎn)率高，脂肪酶活力高等優(yōu)點。
【專利說明】一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。
【背景技術】
[0002]莫勒菌(Moelleriella)系昆蟲病原真菌的重要成員，由于它能殺死粉風和介殼類昆蟲而控制種群數(shù)量，這使得它能成為有效的生物防治劑。隨著研究的不斷推進，近年來人們發(fā)現(xiàn)莫勒菌的代謝產(chǎn)物具有殺蟲、抑菌、抗腫瘤和抗瘧原蟲等活性，這表明該菌在生物農(nóng)藥或醫(yī)藥上具有很大應用價值。[0003]脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，能在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸脂肪酶系一類分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不但能夠催化酯水解反應而且能催化酯合成反應和轉酯反應。微生物脂肪酶比動物脂肪酶解作用的PH和溫度范圍更為寬泛，以便工業(yè)化生產(chǎn)獲得高純度酶制劑。脂肪酶廣布于微生物界，據(jù)不完全統(tǒng)計，迄今有65屬微生物能夠產(chǎn)生脂肪酶。伴隨微生物脂肪酶研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了多種具有不同酶學性質和底物特異性的微生物脂肪酶，它們在水解、酯化、轉酯及酯類手性合成等反應中均表現(xiàn)出較好應用前景。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。
[0005]本發(fā)明首先提供了一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有胰蛋白胨0.5g/L，α -乳糖2.5g/L，Zn2+L 3g/L，VB40.lg/L,乳化橄欖油50g/L,培養(yǎng)基初始pH=7.1。
[0006]其次，本發(fā)明還提供了一種赭色小莫勒菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法，所述方法包含以下步驟:
Ca)將赭色小莫勒菌活化后接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制得發(fā)酵種子液；搖床溫度:25V 土 1°C，種子培養(yǎng)周期為24h。搖床溫度:25°C 土1°C。所述種子培養(yǎng)基含有:土豆汁200g/L，葡萄糖20 g/L ;制備方法為準確稱取已削皮切塊的土豆200g，加熱熬汁，八層紗布過濾，向土豆汁中加入20g葡萄糖,并稀釋至1000ml。
[0007](b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于所述赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量10%，于25°C，轉速120 r/min下培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為96h。
[0008]土豆200g，加熱熬汁，八層紗布過濾，向土豆汁中加入20g葡萄糖，并稀釋至1000ml。
[0009]本發(fā)明采用的赭色小莫勒菌為赭色小莫勒菌(#oe77erii?77a ocAracea)(邱君志等，赭色小莫勒菌在中國的發(fā)現(xiàn).菌物學報，2009.28 (I): 148-150)。
[0010]采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡ld，發(fā)酵周期4d，發(fā)酵產(chǎn)生結果赭色小莫勒菌產(chǎn)酯酶為22U/mL左右。
[0011]本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，具有脂肪酶產(chǎn)率高，脂肪酶活力高(22U/mL)等優(yōu)點。【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為脂肪酶酶活測定的對硝基苯酚標準曲線 。
【具體實施方式】
[0012]為了使本發(fā)明所述的內容更加便于理解，下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0013]實施例1
單因素實驗確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分
(I)種子培養(yǎng)基:準確稱取去皮馬鈴薯切塊200g，熬汁過濾(八層紗布)，加入葡萄糖20g，再稀釋至1000ml，分裝于250mL的三角瓶中，每個三角瓶含100mL。0.1MPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養(yǎng)基預處理。
[0014](2)發(fā)酵種子的制作:將_80°C冰箱中儲存的赭色小莫勒菌接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，于25°C下培養(yǎng)120h，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基，25°C，轉速120 r/min下培養(yǎng)24h，即為種子發(fā)酵液；將富集均勻的種子發(fā)酵液以10%的接種量接種至單因素篩選培養(yǎng)基，250C，轉速120 r/min下培養(yǎng)96h，即為發(fā)酵液。
[0015](3)酶液的制備:取步驟(2)下的發(fā)酵液在4°C下，8000 r/min離心lOmin，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在在波長410nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/
mLo
[0016](4)脂肪酶酶活測定:在pH 8.0、50 °C條件下，每Imin水解p-NPP釋放I μ mol對硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量為I個脂肪酶活力單位(U)。
[0017]方法:溶液A: 150 mg p-NPP溶于50 mL異丙醇；溶液B:500 mL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯膠。
[0018]取2個試管(分別是對照管和樣品管)，各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL(緩慢混合，該溶液至少可穩(wěn)定2 h)。50 °C水浴中預熱5 min，然后在對照管中加入已滅活的酶液0.05 mL，樣品管中加入酶液0.05 mL，立即混勻計時。在水浴中準確反應10 min時馬上測定410 nm下酶水解產(chǎn)生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)；V為反應試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應時間；m為酶液質量或體積，g或mL)。
[0019](5)標準曲線的制作:精確配制p-nitrophenol 2mmol/L標準溶液；首先在試管中加入等體積的底物緩沖液以及不同體積的異丙醇，在50°C保溫5 min，再在加入不同體積的p-nitrophenol標準液。反應10min后立即在波長410處測定吸光度。反應體系為2.5mL(p-nitrophenol和異丙醇0.25mL，底物緩沖液為2.25mL)。每個濃度做3平行實驗，為空白對照。在波長410nm處測定吸光值，以OD41tl值為橫坐標,p-nitrophenol含量為縱坐標繪制標準曲線。，經(jīng)統(tǒng)計處理得到的線性回歸方程，y=45.592x, R2=0.9940，結果見圖1。
[0020]標準曲線制作表格如下:
【權利要求】
1.一種赭色小莫勒菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有胰蛋白胨0.5g/L，α -乳糖 2.5g/L，Zn2+L 3g/L,VB40.lg/L，乳化橄欖油 50g/L，培養(yǎng)基初始pH=7.1。
2.一種赭色小莫勒菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于方法包含以下步驟: (a)將赭色小莫勒菌活化后接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制得發(fā)酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于如權利要求1所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量為10%，于25°C，轉速120 r/min下培養(yǎng)。
3.如權利要求2所述的方法其特征在于，所述種子培養(yǎng)基含有:土豆汁200g/L，葡萄糖。20 g/L ;所述培養(yǎng)條件為搖床溫度:25°C ±1°C，種子培養(yǎng)周期為24h。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(b)的培養(yǎng)時間為96h。
【文檔編號】C12R1/645GK103540577SQ201310440716
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權日:2013年9月25日
【發(fā)明者】邱君志, 涂潔, 李小霞, 孟麗雪, 曹麗萍, 何肖云, 郭慶豐, 董冬, 張以盼, 姚靈丹 申請人:福建農(nóng)林大學