一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，該微生物即淡紫擬青霉菌（Paecilomvces?lilacinus）三炬03菌株，菌種專利保藏號CCTCC?No:M2010165。該方法包括利用微生物菌即淡紫擬青霉菌三炬03菌株，以蝦殼粉為原料，通過微生物發酵生產甲殼低聚糖：①在一定溶氧條件下；②在培養到一定菌體密度時添加一定量菌絲生長抑制劑去氧膽酸鈉的條件下，促進菌體胞外幾丁質酶的分泌，提高對甲殼素降解水平；③在發酵中后期流加補料工藝的條件下，用蝦、蟹殼為原料發酵生產甲殼低聚糖。所得到的甲殼低聚糖可用于醫藥，農業、食品領域，整個生產工藝簡便高效，具有廣泛的工業化發展前景，為蝦、蟹殼找到了一條綠色的應用途徑。
【專利說明】一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種微生物菌株及其發酵生產甲殼低聚糖的方法。
【背景技術】
[0002]當前國內對甲殼素的利用，主要以殼聚糖為主，而甲殼低聚糖作為一種功能性低聚糖，在醫藥、食品等領域具有廣泛的應用前景，其市場價格比殼聚糖高10倍左右。甲殼低聚糖在國內已有生產，大多是采用酸堿水解法，但產物純度低、浪費大、環境污染嚴重，也有采用酶解法，大都是采用復合酶法，其成本昂貴、規模較小。國外也只有日本等少數幾個國家有規模生產。近年對甲殼低聚糖的功能、性質研究的深入，其應用在國內外受到廣泛的關注，市場前景廣闊。
[0003]甲殼低聚糖生產的原料，來源于海產品加工廠的蝦、蟹殼等廢料。我國海域面積極其遼闊，海產品生產量很大，這些資源很好很充足，但卻迄今仍未有效地被開發和利用，因而對環境造成潛在的威脅。所以合理開發利用這一資源，不僅具有經濟學意義，還有很重要的生態學意義。
[0004]傳統的制備甲殼低聚糖的方法是脫乙酰基化學法，由于生產過程耗費能源多、所需設備復雜、采用大量的酸堿用量，同時也污染環境。因此，人們開始尋找生物方法脫乙酰基，現在大都采用酶解法，由于至今沒有單一、高效，專一性的酶，需要采用復合的酶解，成本較昂貴，而且在酶解過程沒有科學、規范化、合適的酶反應系統，離大規模工業化生產尚
有一定距離。

【發明內容】

[0005]針對傳統的制備方法是脫乙酰基化學法，其生產過程耗費能源多、所需設備復雜、采用大量的酸堿用量，同時也污染環境等問題，以及現在采用的生物酶解法，該生產法缺乏廉價、高效、專一性酶和合理的反應系統，使生產缺乏產業化能力的現狀。本發明提供一種用微生物菌發酵生產甲殼低聚糖的方法，該方法利用一種用微生物菌即淡紫擬青霉菌Paecilomyces Iilacinus在人為調控條件下耗氧深層發酵降解奸、蟹殼,生產出較高濃度甲殼低聚糖，有效避免了傳統甲殼低聚糖生產過程采用大量的酸堿用量，有效地提高了能源的利用率，同時又能實現廉價、低成本工業化生產甲殼低聚糖。
[0006]本發明的目的是這樣實現的:在用微生物發酵生產甲殼低聚糖的過程中，通過采用特定發酵微生物菌株(Paeci lomvces Iilacinus三炬03菌株)，菌種專利保藏號CCTCCNO:M2010165)及對該發酵微生物菌株的菌體形態進行控制(添加0.075%Deoxycholic acid sodium salt,其中文名為去氧膽酸鈉)，來改變發酵代謝平衡,促進胞外幾丁質酶的分泌，增加發酵產物甲殼低聚糖的產生，同時通過流加補料方式，來提高發酵產物甲殼低聚糖的濃度，再通過添加表面活性劑(Tween-80)的方式，來確保產物的穩定和促進菌體與產物的分離，最后通過離心除菌、膜過濾或濃縮噴霧干燥、精制等工藝生產出不同質量規格的產品。
[0007]本發明用于發酵生產甲殼低聚糖的菌種，該菌為淡紫擬青霉菌(Paecilomvceslilacinus)三炬03菌株,菌種專利保藏號CCTCC NO:M2010165。菌種保藏時間為2010年6月30日，地點為:中國典型培養物保藏中心(武漢大學)
[0008]本發明用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，包括如下步驟:
[0009](I)原料配備:將新鮮的蝦殼或蟹殼制成含原料2-5%重量比的發酵原液，并滅菌；
[0010](2)菌種制備:將淡紫擬青霉菌(Paecilomvces lilacinus)三炬03菌株由斜面培養逐步轉入種子罐培養；
[0011](3)在滅菌后的發酵原液中添加2-10%體積比的種子罐培養液，發酵獲得甲殼低聚糖發酵液；
[0012](4)從甲殼低聚糖發酵液中分離提取甲殼低聚糖。
[0013]在本發明的較佳實施例中，步驟(1)包括:
[0014]a、原料的制備:新鮮的蝦殼或蟹殼曬干，粉碎成120目的干粉備用；
[0015]b、發酵原液配制:以重量比2-5%的蝦、蟹殼粉與水混合均勻，再加入0.01-0.1%蛋白胨、0.1-1%葡萄糖、0.1-1%磷酸二氫鉀、0.05-0.5%硫酸鎂，制成發酵原液；
[0016]C、發酵原液滅菌 :采用蒸汽加熱滅菌。
[0017]在本發明的較佳實施例中，步驟(2)包括:斜面保藏菌種一活化生產斜面一一級二角瓶擴培一二級二角瓶擴培一種子培養一成熟菌種，接種量為5%發酵液量逐級接種。每一級的種子接種之前都要進行菌體形態的觀察、純度的檢測，并嚴格控制逐級接種的菌齡。
[0018]在本發明的較佳實施例中，步驟(3)包括:
[0019]a、接種發酵:往滅菌好的發酵液中接種入5%種子罐培養好的發酵菌，攪拌通風發酵，剛接種后通風量為1:0.25 (V / V.min)，在發酵的過程，根據OD值和二氧化碳的產生量,逐步增加通風量至1:0.35 (V / V.min)；
[0020]b、加藥調控:當OD值達到一定值時，添加入0.075% Deoxycholic acid sodiumsalt (去氧膽酸鈉)，再經40min后,把通風量提高到1:0.55 (V / v.min),并逐步提高發酵溫度至31°C，在發酵過程定期測定幾丁質酶活和還原糖含量，及甲殼低聚糖的生成量；
[0021]C、流加補料:當發酵液還原糖的含量達55mg / ml時,開始流加補料,補料成分為10%蝦、蟹殼粉和0.1%硫酸鎂混合懸浮液。把補料置于流加罐中，通入蒸汽升溫至121°C，保溫30分鐘滅菌，冷卻后備用，在發酵的中后期時，按5%的量分三次逐步流加入發酵罐。當還原糖的含量達120mg / ml時,流加入一定量的吐溫80,繼續發酵到還原糖含量基本穩定(三次測定含量基本一致)時，為發酵結束。發酵結束時，把發酵液的溫度冷卻到18°C以下；
[0022]在本發明的較佳實施例中，前述步驟b中，當發酵微生物菌數量達到一定值時，通過添加藥品來調整菌體的形態，達到改變微生物的代謝平衡。當發酵到一定周期時，通過測定OD值來確定藥品的添加時間，即:發酵液稀釋10倍后，在波長為505nm下測定OD值，當 OD 值為 0.4-0.45 時，開始添加抑制劑(0.075% Deoxycholic acid sodium salt),來抑制菌絲的生長，使菌體內蛋白質的代謝平衡發生改變，胞外酶合成加快，幾丁質酶(Chitinase)的含量明顯增加，這樣可顯著增加甲殼素的降解速度，產物中甲殼低聚糖的含量得到有效提聞。[0023]在本發明的較佳實施例中，步驟(4)包括:
[0024]a、離心去菌體:冷卻后的發酵液，直接泵入離心機，在離心機5000rpm中，離心30分鐘，獲得上清液，把上清液泵入儲罐中備用，抽樣檢測含甲殼低聚糖量；
[0025]b、膜過濾:把上清液經兩道膜過濾可獲得較高濃度、較高純度的甲殼低聚糖。可以選擇不同孔徑的膜，來進行分離，這樣可進一步獲得更高純度和濃度的產品，以適用于不同用途。或
[0026]C、真空濃縮:也可把上清液泵入雙效蒸發濃縮罐中，進行真空濃縮，濃縮至濃縮液甲殼低聚糖含量在15~20%時，泵入儲罐備用；
[0027]d、噴霧干燥:將步驟b或c獲得的甲殼低聚糖濃縮液，采用噴霧干燥機，通過調節進料口溫度為150°C，出料口溫度70~75°C，進行噴霧干燥，制得甲殼低聚糖干燥粉產品，甲殼低聚糖收率可達96%以上，水溶性好。
[0028]e、產品精制:噴霧干燥的粉末中，還含有一定量的無機鹽成分，因此甲殼低聚糖3000~4000分子量的含量純度為93.6%。該產品作為農用、畜牧食用，純度已完全可行，如需進一步提高含量，可通過2倍的食用乙醇進行純化，即可獲得99%含量甲殼低聚糖產品，完全水溶。
[0029]本發明篩選的微生物菌即淡紫擬青霉菌，能分泌一定量的胞外甲殼素酶，在人為的發酵調控條件下，使其具有持續降解甲殼素的能力，使甲殼素被降解形成一定分子量(3000~4000)和濃度的甲殼低聚糖。在發酵過程中蝦、蟹殼(甲殼素)一方面為該菌繁殖提供C / N營養，另一方面轉化為發酵代謝產物(甲殼低聚糖)。本發明運用微生物發酵法技術生產甲殼低聚糖，有效避免了傳統甲殼低聚糖生產過程采用大量的酸堿用量，有效地提高了能源的利用率，以及避免用酶法較高昂生產成本。可以較廉價地獲取純度較高的甲殼低聚糖產品，該產品可應用于醫藥、農業、食品等領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為菌株形態，其中A為顯微鏡(400X)觀察照片；B、C分別為平板菌落正面及背面照片；
[0031]圖2為本發明一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0032]實施例1
[0033]菌種從多種土壤中分離獲得多種淡紫擬青霉菌株，用平板分析甲殼降解能力好的菌株，此菌株為來源南靖亞熱帶原始森林土壤，分離獲得的淡紫擬青霉菌株，再通過鈷-60和紫外線交替誘變，獲取能直接降解蝦、蟹殼粉末，形成甲殼低聚糖(3000~4000分子量)產品的新淡紫擬青霉菌株SJ-03，該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號:CCTCC NO:M2010165o
[0034]其菌株形態見圖1.[0035]I)菌株 SJ_0318SrRNA 序列:
[0036]TGGTGATTCATGATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCC
【權利要求】
1.用于發酵生產甲殼低聚糖的菌種，該菌為淡紫擬青霉菌(Paecilomvceslilacinus)三炬03菌株,菌種專利保藏號CCTCC N0:M2010165。
2.如權利要求1所述的菌種的用途，其用于發酵生產甲殼低聚糖。
3.一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，包括如下步驟: (O原料配備:將新鮮的蝦殼或蟹殼制成含原料2-5%重量比的發酵原液，并滅菌； (2)菌種制備:將權利要求1中的菌種由斜面培養逐步轉入種子罐培養； (3)在滅菌后的發酵原液中添加2-10%體積比的種子罐培養液，發酵獲得甲殼低聚糖發酵液； (4)從甲殼低聚糖發酵液中分離提取甲殼低聚糖。
4.如權利要求3所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征在于，步驟(1)包括: a、原料的制備:新鮮的蝦殼或蟹殼曬干，粉碎成120目的干粉備用； b、發酵原液配制:以重量比2-5%的蝦、蟹殼粉與水混合均勻，再加入0.01-0.1%蛋白胨、0.1-1%葡萄糖、0.1-1%磷酸二氫鉀、0.05-0.5%硫酸鎂，制成發酵原液； C、發酵原液滅菌:采用蒸汽加熱滅菌。
5.如權利要求3所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征在于，步驟(2)包括:斜面保藏菌種一活化生產斜面一一級三角瓶擴培一二級三角瓶擴培一種子培養—成熟菌種，接種量為5%發酵液量逐級接種。
6.如權利要求3所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征在于，步驟(3)包括: a、接種發酵:往滅菌好的發酵液中接種入5%種子罐培養好的發酵菌，攪拌通風發酵，剛接種后通風量為1:0.25 (v/v.min)，在發酵的過程，根據OD值和二氧化碳的產生量，逐步增加通風量至I:0.35 (v/v.min)； b、加藥調控:當OD值達到一定值時，添加入0.075%去氧膽酸鈉，再經40min后，把通風量提高到1:0.55 (v/v.min)，并逐步提高發酵溫度至31°C，在發酵過程定期測定幾丁質酶活和還原糖含量，及甲殼低聚糖的生成量； C、流加補料:當發酵液還原糖的含量達55mg/ml時,開始流加補料,補料成分為10%蟲下、蟹殼粉和0.1%硫酸鎂混合懸浮液；把補料置于流加罐中，通入蒸汽升溫至121°C，保溫30分鐘滅菌，冷卻后備用，在發酵的中后期時，按5%的量分三次逐步流加入發酵罐；當還原糖的含量達120mg/ml時，流加入適量的吐溫80，繼續發酵到還原糖含量基本穩定時，為發酵結束；發酵結束時，把發酵液的溫度冷卻到18°C以下。
7.根據權利要求6所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征在于:步驟b中，發酵液稀釋10倍后，在波長為505nm下測定OD值，當OD值為0.4-0.45時，開始添加抑制劑0.075%去氧膽酸鈉，來抑制菌絲的生長，使菌體內蛋白質的代謝平衡發生改變。
8.如權利要求3所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征在于，步驟(4)包括: a、離心去菌體:冷卻后的發酵液，直接泵入離心機，在離心機5000rpm中，離心30分鐘，獲得上清液，把上清液泵入儲罐中備用，抽樣檢測含甲殼低聚糖量； b、膜過濾:把上清液經兩道膜過濾獲得較高濃度、較高純度的甲殼低聚糖；或C、真空濃縮:把上清液泵入雙效蒸發濃縮罐中，進行真空濃縮，濃縮至濃縮液甲殼低聚糖含量在15~20%時，泵入儲罐備用； d、噴霧干燥:將步驟b或c的甲殼低聚糖濃縮液，采用噴霧干燥機，通過調節進料口溫度為150°C，出料口溫度70~75°C，進行噴霧干燥，制得甲殼低聚糖干燥粉產品。
9.如權利要求8所述的一種用微生物發酵生產甲殼低聚糖的方法，其特征在于，步驟(4)還包括: e、產品精制:通 過2倍的食用乙醇進行純化，獲得99%含量甲殼低聚糖產品，完全水溶。
【文檔編號】C12R1/79GK103695315SQ201310475664
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年10月12日 優先權日:2013年10月12日
【發明者】尤越, 林克明 申請人:福建三炬生物科技股份有限公司