一種腦梗塞早期診斷標志物及其應用的制作方法【專利摘要】一種腦梗塞早期診斷標志物及其應用。由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列；所述的多種核酸分子至少包含編碼hsa-miR-106B-5P、hsa-miR-4306、hsa-miR-320e、hsa-miR-320d中的任一個核酸分子。還提供了一種用于區分至少一個腦梗塞患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的試劑盒，包含上述的腦梗塞早期診斷標志物，其中，所述的至少一種對照血漿來自健康個體。本發明的有益效果是，有效用于觀察腦梗塞早期發生及發展，提供了一種腦梗塞早期診斷標志物。【專利說明】一種腦梗塞早期診斷標志物及其應用【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種腦梗塞診斷標志物。【
背景技術：
】[0002]腦血管病是一類嚴重威脅人類健康和壽命的常見病。在我國，血管性疾病、腫瘤和慢性呼吸系統疾病是導致死亡的主要病因。與西方國家不同，我國腦血管病占絕大多數，因腦卒中死亡的人數超過冠心病死亡人數的3倍；而年齡調整后的首次腦卒中發病率與發達國家比較并無明顯差異(LiuWP,NgKC,HuangJJ.Carotidarteryinjurywithcerebralinfarctionfollowingheadandnckblunttruma:reportofacas.TheYaleJournalofBiologyandMedicine,2005，78:149-153.)。缺血性腦血管病約占全部腦血管病的60%-80%，主要由腦動脈粥樣硬化引起管腔狹窄，是一種發病率、致殘率、致死率、復發率較高的疾病。近年來，國內外文獻表明腦梗死有年輕化趨勢，通常將18-45歲發病的腦梗死定義為青年腦梗死，年發病率為6-20/10萬(KittnerSJ.Strokeintheyoung:comingofage.Neurolosy,2002,59(I):6_7.)。研究資料提示,青年腦梗死的發病率在歐美發達國家占全部腦血管患者的5%~8%。在我國及發展中國家約占10%左右；男性明顯高于女性，國外研究男女分別為71%和29%，國內報道男:女=2.63:1(KwonSU,KimJS,LeeMC,etal.1schemicstrokeinkoreanyoungaults.ActaNeurolScand,2000,101(I):19-24.)。[0003]腦梗塞嚴重危害患者的生活質量，溶栓治療是目前最科學有效的方法(國家“九五”攻關課題協作組.急性腦梗塞六小時以內的靜脈溶栓治療[J].中華神經科雜志，2002,35(4):210-213.)。盡早進行溶栓治療，以搶救缺血半暗帶，盡快使閉塞血管再通，恢復腦組織血供是目前治療急性缺血性腦卒中較好方法，并取得了良好的效果，治療后并發癥、致殘率較傳統被動的支持療法有明顯減低。靜脈溶栓靜脈推注或靜脈滴注仍是目前國內外應用最廣泛的溶栓方法。靜脈溶栓要求的技術設備簡單、方便快捷、操作技術容易掌握、創傷相對較小，可在短時間內完成、費用較低、患者易于接受。但靜脈溶栓用藥劑量較大，對纖溶系統影響大，出血較多，尤其對大血管的血栓溶栓效果較差，再通率較低，比較合適彌散性微血栓的溶栓。動脈溶栓的一般方法是采用Seldinger技術穿刺股動脈或頸動脈，借助DSA圖像示蹤，將微導管導航進入腦血管，可進行超選擇性動脈內溶栓治療(LisboaRC,JovanvicBD,AlbertsMJ.AnalysisoftheSafetyandEfficacyofIntra-ArterialThrombolyticTherapyinIschemicstroke.Stroke,2002,33(12):2866-2871.)。大腦中動脈是高度特異性的、易形成血栓栓塞的部位，在腦梗發作6h內施行動脈內溶栓，能夠在腦組織不可逆性損傷之前對缺血性腦組織進行缺血再灌注，從而改善腦梗的預后。超選擇性動脈內溶栓治療用藥劑量小、局部藥物度高、溶栓效果確切、再通時間短、對纖溶系統影響小、時間窗長，較為適合大血管的單一血栓或少量血的栓塞以及術后暫不適宜靜脈溶栓的患者。但動脈溶栓需要DSA等昂貴的檢查設備、操作復雜、耗時長、需訓練有索的介入和神經專科醫師的配合，這使得動脈溶栓難以在更多醫院開展，甚至許多符合條件的患者也不能及時被施行動脈溶栓治療。最近幾年的研究證明腦梗死動脈內溶栓較靜脈內溶栓的血管再通率高，為55%-78%。根據RejaneC等對1988年-2002年的27個動脈溶栓試驗的結(其中包括852例動脈溶栓患者和100例對照患者)，再通率較高為72.2%，死亡率較低(27.2%-40%)，癥狀性顱內出血率略高(9.5%-9.3%)。結論認為:腦梗死動脈溶栓的臨床療效顯著。動脈溶栓組較對照組有較好的預后，再通率較高(72.2%);死亡率較低(27.2%-40%)?[0004]超早期腦梗死診斷已成為治療腦梗死成功的關鍵(MoonisM.ThrombolyticTherapyforAcuteIschemicStroke:IssuesandAnswers[J].NeuralIndia,2002,50Suppl:S50-56.)。為及時確診腦梗塞以便及時實施溶栓治療，核磁共振是目前最重要和常用的輔助檢查。在安全有效實施溶栓治療的同時，我們發現部分超急性腦梗塞患者的核磁共振檢查早期無明顯異常改變，臨床決策常因此受影響，導致錯失及時溶栓、獲得良好預后的機會，針對此類病例進行整理分析并對照以往溶栓病例進行研究。如果100%嚴格執行磁共振檢查符合標準，必然會有部分病例失去及時溶栓的機會。對于影像學檢查而言，CT排除出血和明顯梗塞征象是必須的，MRI上DWI高信號是確診超急性腦梗塞的可靠依據、但不應當是絕對和必須的要求。如果由于復查MRI延時過多，即使能夠行溶栓處理，血管再通機會也會減少、可能失去獲得良好預后的機會。對于病情相對較嚴重的腦梗塞病例，癥狀體征符合超急性腦梗塞診斷，應及時調整診斷。[0005]據此，我們認為時間窗概念示含糊的，影像學的檢查是滯后的。腦梗死的發生發展首先示缺血腦組織的病理生理的改變。從缺血腦組織發生病理生理的改變到患者出現不適，再到患者肢體相應功能出現障礙的時間往往要顯著大于時間窗。因為沒有人能確定腦梗從哪一時間點開始發生，即使患者一感覺不適就去就診，這種感覺因人差異太大，而且往往被誤診為高血壓等其他疾病，若待出現肢體功能障礙再開始計算時間窗，我們認為時間窗已被大大延遲，拖延了治療的最佳時機。因此，從分子水平來檢測腦梗塞應該無論從特異性及靈敏度均較目前的時間窗來說更為準確，甚至可以從分子水平來推算出其實際的時間窗。[0006]作為新的切入點，miRNA為疾病診斷與治療開辟了新途徑。目前常用的血清標志物幾乎都是蛋白質，而且檢測它們的傳統方法需要繁重的實驗室勞動，沒有任何基于血清的檢測廣泛適用于疾病的診斷，特別是用于腫瘤的早期診斷。自1993年在線蟲中發現miRNA以來，人們逐漸認識到miRNA與人類多種疾病的發生、發展密切相關；在不同類型疾病中，miRNA的水平及調節作用是不同的。近年來，科學家們開始注意到血液中的miRNA具有穩定性高、可重生性及在不同疾病中的特異性，并進行了一系列研究，取得了重要進展。血清miRNA作為診斷和預后的標記物，可應用于多種疾病的早期檢測，且檢測損傷小、靈敏度高、穩定性好(HuZhibin,XiChen,GuangfuJin,KeZen,ChenYuZhang,andHongbingShen.SerummiRNAsignaturespredictsurvivalofNSCLC.CancerRes.,2010;70:3002;PatriciaA.Porter-Gill,Y1-PingFu,AlpanaKaushiva,DouglasPrice,WilliamDahut,WilliamFigg,andLudmilaProkunina-01sson.TissueandserummiRNAprofilingfordetectionofbladder,breastandprostatecancer.CancerRes.，2011;71:LB-350.)。MiRNA幾乎參與了各種疾病發生的所有重要信號通路，參與了疾病發生發展的各個階段，[0007]在疾病的發生發展中具有重要的作用。[0008]外周血miRNA的表達穩定性:Patrick等(PatrickS.Mitchell,RachaelK.Parkin,EvanM.KrohjBrianR.Fritz,StaciaK.Wyman,EraL.Pogosova-AgadjanyanjAmeliaPeterson,JenniferNoteboom,KathyC.0’Briant，AprilAlien，DanielW.Lin,NicoleUrban,CharlesW.Drescher,BeatriceS.Knudsen，DerekL.Stirewalt,RobertGentleman,RobertL.Vessella,PeterS.Nelson,DanielB.Martin,andMuneeshTewar1.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.PNASj2008;105:10513-10518.)在人工miRNA與內源性miRNA對照實驗中，分別在2類miRNA中直接加入血漿或加入抗核糖核酸酶制劑后加入血漿。反應前后的TaqmanRT-PCR定量檢測數據顯示。外周血中存在核糖核酸酶。而內源性miRNA本身的結構形態決定了其具有對抗核糖核酸酶的能力。Chen等(ChenSuo,AgusSalim,Kee-SengChia,etal.Modifiedleast-variantsetnormalizationformiRNAmicroarray.RNA,2010;16:2293-2303.)研究獲得了類似的結論。[0009]另有一些系列實驗(例如:室溫下過夜、反復凍存-解凍、煮沸、過酸或過堿等)，論證了外周血miRNA在溫度、酸堿環境及物理狀態等條件改變的情況下，其表達仍能維持穩定(BaggishAL,HaleA,WeinerRB,LewisGD,SystromD,WangF，WangTJ,andChanSY.DynamicregulationofcirculatingmicroRNAduringacuteexhaustiveexerciseandsustainedaerobicexercisetraining.J.Physiol.，2011;589:3983-3994.)。[0010]此外，外周血miRNA的表達不存在明顯的性別差異.也不存在顯著的個體差異，因此便于設定參照值以進行檢測比對。血清和血漿中miRNA的表達不存在差異。因此在臨床實踐中可通過提取血清或血漿來檢測miRNA。[0011]miRNA作為肝、肌肉、腦損傷的診斷標志物:研究人員將肝、肌肉、腦特異性的miRNA作為組織損傷的標志進行了研究。采用高敏感度的聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)技術檢測循環血液中的特異性miRNA(miR-122、miR_133a及miR-124)濃度，樣本來源于外傷性鼠(接受肝或肌肉毒性藥物)的血清。結果顯示，肝、肌肉、腦損傷會相應地引起血漿中miR-122、miR-133a及miR-124濃度升高；肝損傷時miR-122的特異性及敏感性較丙氨酸氨基轉移酶要高，因為在其他器官損傷中并未發現血miR-122升高，而以往檢測方法中丙氨酸氨基轉移酶及谷氨酸氨基轉移酶的升高也會出現在其他損傷組織中。在小鼠外傷所致腦損傷的8h內血miR-124濃度開始升高，并于24h達到高峰。這說明血miRNA可作為組織損傷新的診斷標志物。在對乙酰氨基酚導致的肝損傷鼠模型中發現，miR-192、miR-122的血清水平在對照組和實驗組的血漿及肝組織中也極大不同(OmarF.Laterza,LeeLim,Philipff.Garrett-Engele,KaterinaVlasakova,NagarajaMuniappa,WesleyK.Tanaka,JasonM.Johnson,JosephF.Sina,ThomasL.Fare,FrankD.Sistare,andWarrenE.Glaab.PlasmaMicroRNAsasSensitiveandSpecificBiomarkersofTissueInjury.Clin.Chem.，2009;55:1977-1983;KaiWang,ShileZhang,BruzMarzolf,PamelaTroisch,AmyBrightman,ZhiyuanHu,LeroyE.Hood,andDavidJ.Galas.CirculatingmicroRNAs,potentialbiomarkersfordrug-1nducedliverinjury.PNAS,2009;106:4402-4407.)。[0012]血清中含有來自各種組織器官及各種疾病的游離miRNA，這些血清miRNA表達譜可以作為疾病診斷新的血清標記物，并且其可能比目前所應用的疾病的早期診斷方法更為靈敏特異。【
發明內容】[0013]本發明提供了一種腦梗塞早期診斷標志物，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列；所述的多種核酸分子至少包含編碼hsa-miR-106B_5P、hsa-miR-4306、hsa_miR-320e、hsa_miR-320d中的任一個核酸分子。[0014]本發明提供了一種腦梗塞早期診斷試劑盒，包含上述的腦梗塞早期診斷標志物。[0015]本發明提供了一種用于區分至少一個腦梗塞患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的試劑盒，包含上述的腦梗塞早期診斷標志物，其中，所述的至少一種對照血漿來自健康個體。[0016]優選地，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-106B-5P、hsa-miR-4306、hsa_miR-320e、hsa_miR-320d的四個核酸分子。[0017]本發明的有益效果是:有效用于觀察腦梗塞早期發生及發展，提供了一種腦梗塞早期診斷標志物。【專利附圖】【附圖說明】[0018]下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。[0019]圖1為三組樣品正常人(ZC)，CT_腦梗塞(CT-)患者和CT+腦梗塞(CT+)患者相關的miRNA芯片聚類圖；[0020]圖2為標志物表達量梯度變化圖。【具體實施方式】`[0021]實施例1[0022]總RNA抽提(mirVanaTMRNAIsolationKit(AppliedBiosystemp/nAM1556))[0023]1.取100~200ill低溫冷藏的血清樣本，置于冰上融化，且充分混勻。加入10倍體積的lysis/bindingbuffer勻衆器徹底混勻。[0024]2.加入1/10體積的Homogenateadditive,潤旋混均,冰上放置10分鐘。以上操作均在冰上。[0025]3?力[]A與Iysis(不計Homogenateadditive)相同體積的acid-phenol:chloroform(300ullysis/300ulacid-phenol:chloroform),潤旋30-60秒，室溫1000Og離心5分鐘,如分相不好，則重新離心。取上清置一新管中，記體積。[0026]4.加入1.25倍體積100%乙醇，渦旋混均，反復過純化柱，體積不超過700ul，1000Og離心15秒。[0027]5.加入350ulwashI,離心5~10秒,清洗純化拄，1000Og離心15秒,棄過濾液。[0028]6.DNaseIlOuI和BufferRDD70UI加入膜上(QIAGEN#79254)，20_3(TC放置15分鐘。[0029]7.加入350ulwashI,離心5~10秒,清洗純化拄，1000Og離心15秒，棄過濾液。[0030]8.加入500ulwash2/3,離心5~10秒,清洗純化柱二次，1000Og離心15秒,棄過濾液，離心I分鐘。[0031]9.將離心柱放置到新的收集管中，柱中心加入IOOiiL95°C預熱的ElutionSolution或nuclease-free水，室溫最高轉速離心20-30秒，收集管中液體即為提取的TotalRNA，可放置在-70°C保存。[0032]實施例2[0033]miRNA芯片的制備[0034]1.樣品RNA熒光標記[0035]實驗采用微陣列雜交芯片miRCURYTMLNAArray(Exiqon,V10.0)包含人類已經確定的677個miRNA探針，每個探針重復4次。將miRCURYTMLNAArrayPowerLabeling試劑盒各組分置于冰上解凍15~20min，短暫離心后漩渦混勻。將IUg總RNA(溶于3uL水)，0.5uL緩沖液和0.5uLCIP酶加入離心管，冰上混勻，PCR儀上37°C孵育30min,95°C滅活酶活性并使RNA變性，冰上迅速冷卻，混合物置冰上2min，短暫旋轉混勻反應物，再加入L標記緩沖液，1.5iiL熒光標記物(Hy3TM)，2iiLDMSO和2yL標記酶，冰上混勻；混合物置PCR儀上16°C避光反應Ih，65°C孵育15min。反應停止后，標記物混勻置冰上待用。[0036]2.芯片雜交[0037]將12.L上述標記的RNA樣品，90iiL2X雜交緩沖液，77.5iiL無核酸酶緩沖液(共180yL)加入PCR管，混勻，95°C避光孵育2min;將混合物置冰上2min，輕柔旋轉混勻。將試劑盒中的雜交載片取出，取180yL雜交樣品加至預先準備好的雜交帶上，并用IX雜交緩沖液補充液體至低于雜交帶上緣5mm處；將另一個雜交帶剪去一半，套入雜交裝置上端，整個雜交裝置順向倒置迅速浸入95°C熱水3~5s，取出，置于56°C烤箱內，以2r/min旋轉過夜。徹底雜交后，拆除裝置，以試劑盒提供的洗滌緩沖液A、B、C及蒸餾水室溫下洗漆玻片，最后玻片1000r/min離心5min干燥,隨即進行芯片信號掃描。[0038]3.芯片掃描與數據處理及分析[0039]綠色突光信號用AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner掃描，GenePixproV6.0軟件分析綠色熒光強度。采用中值校正法獲得校正數值。以兩樣本miRNA熒光校正值之比值≥1.5為表達上調，比值<0.67為表達下調。[0040]實施例3[0041]生物信息學分析[0042]數據預處理后，根據各張芯片的全局均值進行片間校正，使得個各張芯片的全局均值相同；用芯片顯著性分析挑選差異表達基因。篩選條件為:錯誤發現率FDR控制在5%以內，倍數變化不低于2倍。采用Clusterf.0對芯片數據進行聚類分析。分析結果發現，三組樣品(每組100個標本)中存在兩兩差異的miRNA總共有42個。具體參見圖1。圖1為三組樣品正常人(ZC)，MR1-腦梗塞(MR1-)患者和MRI+腦梗塞(MRI+)患者相關的miRNA芯片聚類圖。[0043]實施例4[0044]熒光實時定量PCR驗證芯片結果[0045]1.cDNA的制備[0046]使用ABI公司的TaqMan?MicroRNAReverseTranscriptionKit進行反轉錄，所有操作在冰上完成。總反應體系為15ill:1OOmMdNTPs0.15uI,MultiScribeTMReverseTranscriptasel.00UI,IOXReverseTranscriptionBufferl.50UI,RNaseInhibitor0.19uI,Nuclease-freewater4.16uI,miRNA或U65XRTPrimer3uI,RNAsample5uI。反應條件為16°C30min,42°C30min,85°C5min。[0047]2.實時熒光定量PCR樣品模板濃度的優化[0048]取待測各樣品的cDNA分別稀釋5、10和15倍。不同稀釋濃度的樣本cDNAl.33UI,分別加入miRNA或U620XRealTimelUI,TaqMan2XUniversalPCRMasterMixlOUI,Nuclease-freewater7.67uI，總反應體系為20yI。7300HT熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，設置反應條件為95°CIOmin,95°C15s及60°Clmin，共40個循環。同時行熒光定量，檢測目的基因miRNA和內參基因(U6)在不同濃度稀釋樣本中的擴增情況。選擇當反應達到域值時，目的基因和內參基因擴增循環數均位于15~30個循環之間的樣本濃度為最佳稀釋濃度。[0049]3.實時熒光定量PCR[0050]最適稀釋濃度的樣本cDNAl.33UI,加入miRNA或U620XRealTimelU1，TaqMan2XUniversalPCRMasterMixlOUI,Nuclease-freewater7.67UI,總反應體系為20ill。設置反應條件為95°C10min，95°C15s及60°Clmin，共40個循環。反應結束后分析PCR反應曲線，得到Ct值，即熒光達到閾值所需的PCR循環數。PCR完成后，在ABI7300SystemSDSSoftwarel.3.1.21軟件上分析,查看每個基因的擴增情況,記錄相應的Ct值。計算方法:以U6rRNA為陽性內對照基因來校正PCR模板的細胞拷貝數(目標基因ACt值=目標基因Ct值-同一樣本U6Ct值)，消除組間的加樣量誤差，重復3次。目標組的ACt平均值減去其對照組的ACt平均值得到每個目的基因相對循環數(AACt值)，即AACt目標基因=處理組ACt目標基因-對照組ACt目標基因，基因相對表達量采用2-AACt方法計算。[0051]結果我們發現僅hsa-miR-25_5P,hsa-miR-22_3P，hsa-miR-21_5P，hsa-miR-16_5P，hsa-miR-1246,hsa-miR-122_5P，hsa-miR-106B_5P,hsa-miR-71-5P,hsa-miR-7b_5P,hsa-miR-92a_3P,hsa-miR-574_5P,hsa_miR-451a,hsa-miR-4306,hsa_miR-320e,hsa_miR-320d,hsa-miR-30d_5P,hsa-miR-26b_5p等17個miRNA存在兩兩差異。[0052]實施例5[0053]熒光實時定量PCR檢測臨床樣本[0054]1.臨床收集107患者血清樣本，利用miRNAPurificationKit(CW0627,cwbiotech)取200UI血衆或血清樣本,加入5倍體積BufferRLM,震蕩混勻30秒。[0055]2.樣品中加入BufferRLM后反復吹打幾次，使其充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復合物完全分離。[0056]3.可選步驟:4°C12,OOOrpm(~13，400Xg)離心5分鐘,取上清,轉入一個新的離心管(自備)中(如樣品中含較多蛋白、脂肪、多糖等，可選做此步驟)。[0057]4.以每200UIBufferRLM加入200UI氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置5分鐘。[0058]5.4°C，12000rpm離心15分鐘，樣品分為三層:紅色有機相，中間層，無色水相，將上層無色水相移到一個新的離心管(自備)中。[0059]6.向步驟5得到的溶液中加入1/3倍體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉入已裝入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱RM(SpinColumnRM)中。若一次不能將全部溶液加入吸附柱，請分多次轉入。12，OOOrpm離心30秒，離心后棄掉吸附柱RM，保留流出液。[0060]7.向步驟6得到的溶液中加入2/3倍體積的無水乙醇，混勻。[0061]8?將上步所得溶液和沉淀一起轉入已裝入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱RS(SpinColumnRS)中。若一次不能將全部溶液加入吸附柱，請分多次轉入。12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。[0062]9.向吸附柱RS中加入700illBufferRffT(使用前檢查是否加入無水乙醇)，室溫12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。[0063]10.向吸附柱RS中加入500UIBufferRW2(使用前檢查是否加入無水乙醇)，室溫12，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱RS重新放回收集管中。[0064]11?重復步驟10。[0065]12.12，OOOrpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱RS置于室溫數分鐘，以徹底晾干。[0066]13.將吸附柱RS置于一個新的無RNase離心管(CollectionTubel.5ml)中，向吸附柱中間部位加入30-50uIRNase-FreeWater,室溫放置I分鐘，12，OOOrpm離心I分鐘，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在_70C，防止降解。[0067]14.使用ABI公司的TaqMan#)MicroRNAReverseTranscriptionKit進行反轉錄，所有操作在冰上完成。總反應體系為15Ul:100mMdNTPs0.15yl，MultiScribeTMReverseTranscriptasel.00U1,10XReverseTranscriptionBufferl.50UI,RNaseInhibitor0.19uI,Nuclease-freewater4.16uI,miRNA或U65XRTPrimer3uI,RNAsample5uI。反應條件為16°C30min,42°C30min,85°C5min。[0068]15.最適稀釋濃度的樣本cDNAl.33ii1，加入miRNA或U620XRealTimelUI,TaqMan2XUniversalPCRMasterMixlOUI,Nuclease-freewater7.67UI,總反應體系為20ill。設置反應條件為95°C10min，95°C15s及60°Clmin，共40個循環。反應結束后分析PCR反應曲線，得到Ct值，即熒光達到閾值所需的PCR循環數。PCR完成后，在ABI7300SystemSDSSoftwarel.3.1.21軟件上分析,查看每個基因的擴增情況,記錄相應的Ct值。計算方法:以U6rRNA為陽性內對照基因來校正PCR模板的細胞拷貝數(目標基因ACt值=目標基因Ct值-同一樣本U6Ct值)，消除組間的加樣量誤差，重復3次。目標組的ACt平均值減去其對照組的ACt平均值得到每個目的基因相對循環數(AACt值)，即AACt目標基因=處理組ACt目標基因-對照組ACt目標基因，基因相對表達量采用2-AACt方法計算。[0069]結果我們發現，僅hsa-miR-106B_5P,hsa-miR-4306,hsa_miR-320d和hsa-miR-320e四個miRNA在腦梗塞發生時其表達量呈現梯度變化，可有效用于觀察腦梗塞早期發生及發展，可作為腦梗塞早期診斷標志物。[0070]上述提到的miRNA的核酸序列列在表1中。[0071]【權利要求】1.一種腦梗塞早期診斷標志物，其特征在于，由多種核酸分子組成，每種核酸分子編碼至少一個microRNA序列；所述的多種核酸分子至少包含編碼hsa-miR-106B_5P、hsa-miR-4306、hsa_miR-320e、hsa_miR-320d中的任一個核酸分子。2.一種腦梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的腦梗塞早期診斷標志物。3.一種用于區分至少一個腦梗塞患者的血漿和至少一個健康個體的血漿的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1中所述的腦梗塞早期診斷標志物，其中，所述的至少一種對照血漿來自健康個體。4.如權利要求1所述的腦梗塞早期診斷標志物，其特征在于，所述的多種核酸分子包含編碼hsa-miR-106B-5P、hsa-miR-4306、hsa-miR-320e、hsa-miR-320d的四個核酸分子。【文檔編號】C12Q1/68GK103667445SQ201310485722【公開日】2014年3月26日申請日期:2013年10月16日優先權日:2013年10月16日【發明者】石磊,王萬華申請人:石磊