一種可持續光合產氫的轉調控miRNA基因藻及其構建方法
【專利摘要】本發明是從綠藻miRNAs文庫中篩選或針對影響光合效率的綠藻功能基因設計調控miRNAs，構建能夠通過光強或溫度等手段誘導表達調控miRNAs的轉基因藻，以miRNAs對其靶基因的抑制作為手段，間斷調控綠藻光合系統II的活性，控制藻細胞內的低氧環境，從而使綠藻細胞能夠持續產氫；以上述方法構建的轉調控miRNA基因藻在產氫過程中不需要交替更換培養基，從而克服了現有綠藻為了持續產氫需要交替更換培養基從而造成其生長和產氫能力大大下降的缺陷，具有產業化應用前景。
【專利說明】—種可持續光合產氫的轉調控miRNA基因藻及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種可持續光合產氫的轉調控miRNA基因藻及其構建方法。
【背景技術】
[0002]在20世紀四十年代，Gafforn及其合作者首次發現柵藻利用其可逆氫酶，既能在厭氧條件下吸收氫氣固定二氧化碳，又能在光照條件下放出氫氣【Gaffron H, RubinJ.Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae.J.Gen.Physiol.，1942(26):219-240.】。隨后在許多綠藻(如萊茵衣藻、小球藻等)均發現光合放氫現象。由于這些綠藻能從自然界最豐富的資源(光和水)中獲得氫能，而且綠藻中氫酶的活性高達藍藻和光合細菌氫酶活性的100倍以上，國際能源組織(IEA)在1998年的評估報告中，將綠藻光合制氫稱為最有應用前景的生物制氫途徑【Carolyn CE.Annual Report ofIEA, 1998:15-31.】。然而，由于綠藻氫酶活性受到光合放氧的抑制，使得其持續放氫時間只能維持幾秒到幾分鐘，大大制約了綠藻光合制氫產業的發展前景。
[0003]“如何才能使綠藻細胞持續放氫”已經成為綠藻光合制氫產業的瓶頸問題。美國國家可再生能源實驗室(NREL)和加州大學伯克利分校的Melis小組于2000年在缺硫條件下培養萊茵衣藻時，發現光合放氧速率發生可逆下降現象，但線粒體的呼吸耗氧卻不受影響，使封閉的萊茵衣藻生物反應器中的藻細胞處于厭氧環境，解除了衣藻光合放氧對氫酶的抑制作用，從而使持續放氫時間達到70小時以上，萊茵衣藻的放氫效率大大提高【Melis A, Zhang L, Forestier M et al.Sustained photobiological hydrogen gasproduction upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algalChlamydomonas reinhardti1.Plant Physiol.2000 (22): 127-135.】。由此引起人們對綠藻缺硫放氫現象的極大關注。進一步研究表明:當萊茵衣藻在缺硫條件下培養時，其藻細胞光合系統IKPSII)的活性受到抑制，進一步誘導呼吸耗氧，從而解除氧對綠藻氫酶的抑制，實現綠藻持續放氫過程。基于綠藻能在缺硫環境下持續放氫的理論，目前國際上設計出的綠藻光合制氫生物反應器均是使用兩步交替法制氫，即在有硫培養基中生長，在去硫培養基中放氫，這樣交替更換培養基來達到持續產氫的目的。然而，由于綠藻與培養基分離困難，將藻固定化后其生長和放氫能力又會大大下降，所以這種制氫途徑沒有產業化應用前景。

【發明內容】

[0004]本發明要解決的一個技術問題是提供一種可持續光合產氫的轉調控miRNA基因藻的構建方法；本發明要解決的另一技術問題是利用上述方法構建一種可持續光合產氫的轉調控miRNA基因藻。
[0005]本發明提供了一種可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，包括如下步驟:
[0006](I)轉基因受體藻的篩選和培養；[0007](2)篩選或設計調控miRNAs:根據表達量發生變化的miRNAs建立小RNA庫，并從中篩選出預測的靶基因是與光系統II相關的且表達量均顯著上調的miRNAs，或根據影響光合效率的綠藻靶基因序列設計并合成調控該基因的人工miRNAs ；
[0008](3)分別構建含有步驟(2)的各調控miRNAs的綠藻核表達載體或綠藻葉綠體表達載體；
[0009](4)步驟(3)中得到的綠藻核表達載體或綠藻葉綠體表達載體的遺傳轉化；
[0010](5)轉基因綠藻的篩選。
[0011]所述轉基因受體藻為細胞壁缺陷型萊茵衣藻或細胞色素b缺陷型萊茵衣藻，其培養條件如下:采用TAP培養基，在溫度為22-25°C、光照強度為90μ E/m2/S的條件下連續光照通氣培養，藻細胞對數生長期濃度為1-2 X IO6細胞/mL時離心收集。
[0012]所述步驟(2)的調控miRNAs為預測的靶基因為細胞色素P450CYP3/CYP5/CYP6/CYP9亞家族的miR1150.3，預測的靶基因為磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的miR1166.1，靶基因為組成PSII復合體的0EE2蛋白的編碼基因的人工調控miRNAs，靶基因為與葉綠體類囊體膜相關的VIPPl蛋白的編碼基因VIPPl的人工調控miRNAs。
[0013]步驟(3)是先將各調控miRNAs的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，得到調控miRNAs表達骨架；再利用調控miRNAs表達骨架構建綠藻核表達載體或綠藻葉綠體表達載體。
[0014]步驟(3)中綠藻核表達載體的構建方法:使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化上述調控miRNAs表達骨架，得到相應的基因，將相應的基因插入經Pmac I和Nhe I消化的PH105載體并用EcoR I酶切，獲得調控miRNA基因表達框架，將調控miRNA基因表達框架插入pSP124的EcoR I位點，即獲得綠藻核表達載體。
[0015]步驟(3)中綠藻葉綠體表達載體的構建方法:通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架；通過Nco I和Pst I雙酶切上述調控miRNAs表達骨架，獲得相應的基因；將相應的基因與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒p423框架通過連接酶進行連接獲得質粒，使用EcoR V和Sma I雙酶切前述質粒，獲得相應的基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，即獲得綠藻葉綠體表達載體。
[0016]步驟(3)中含有調控miR1150.3的綠藻核表達載體的構建方法如下:
[0017]將miR1150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表達骨架；
[0018]使用限制性內切酶Nhe I 和 Pmac I 消化 miRNA-cre-MIR1162_miR115(X 3 表達骨架，可獲得miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的 PH105 載體，獲得 pH105-miR1150.3，用 EcoR I 酶切 pH105_miR1150.3，獲得調控miRNA 基因表達框架 HSP70A-RBCS2:: miR1150.3:: RBCS2,將其插入 pSP124 的 EcoR I位點，構建得到附圖1所示的調控miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因綠藻核表達載體pH105-miR1150.3-124 ；
[0019]步驟(3)中含有調 控miR1166.1的綠藻核表達載體的構建方法如下:[0020]將miRl 166.1的成熟序列代替cre_MIRl 162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表達骨架；
[0021]使用限制性內切酶Nhe I 和 Pmac I 消化 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1 表達骨架，獲得miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的 PH105 載體，獲得 pH105-miR1166.1，用 EcoR I 酶切 pH105_miR1166.1，獲得調控miRNA 基因表達框架 HSP70A-RBCS2:: miR1166.1:: RBCS2,將其插入 pSP124 的 EcoR I位點，構建得到附圖2所示的調控miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因綠藻核表達載體pH105-miR1166.1-124 ； [0022]步驟(3)中含有與靶向0EE2匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下:
[0023]將與0EE2相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIRl 162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - 0EE2表達骨架；
[0024]使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre_MIRl 162 - 0EE2表達骨架，獲得miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得PH105-0EE2，用EcoR I酶切pH105_0EE2，獲得調控miRNA基因表達框架HSP70A-RBCS2:: 0EE2:: RBCS2，將其插入pSP124的EcoR I位點，構建得到附圖3所示的調控 miRNA-cre-MIRl 162-0EE2 基因綠藻核表達載體 ρΗ105_0ΕΕ2_124 ；
[0025]步驟(3)中含有與靶向VIPPl匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下:
[0026]將與靶基因VIPPl相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl表達骨架；
[0027]使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化miRNAs-cre_MIR1162 - VIPPl表達骨架，可獲得miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得PH105-VIPP1，用EcoR I酶切pH105_VIPPl，獲得調控miRNA基因表達框架HSP70A-RBCS2:: VIPPl:: RBCS2，將其插入pSP124的EcoR I位點，構建得到附圖4所示的調控 miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1 基因綠藻核表達載體 pH105-VIPPl_124。
[0028]步驟(3)中含有調控miR1150.3的綠藻葉綠體表達載體的構建方法如下:
[0029]將miRl 150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3表達骨架；
[0030]通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表達骨架，獲得完整調控miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒P423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表達盒5’ atpA:: miRl 150.3:: 3’ rbcL 的 p423miR1150.3 質粒，使用 EcoR V 和 Sma I 雙酶切p423miRl 150.3 質粒，獲得 miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3 基因表達盒，將其與經 EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖5所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表達盒的綠藻葉綠體表達載體pmiR1150.3chl ；
[0031] 步驟(3)中含有調控miR1166.1的綠藻葉綠體表達載體的構建方法如下:
[0032]將miRl 166.1的成熟序列代替cre_MIRl 162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1表達骨架；
[0033]通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1表達骨架，獲得完整調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒P423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因表達盒5’ atpA:: miR1166.1:: 3’ rbcL 的 p423miR1166.1 質粒，使用 EcoR V和 Sma I 雙酶切p423miR1166.1 質粒，獲得 miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1 基因表達盒，將其與經 EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖6所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因表達盒的葉綠體表達載體pmiR1166.1chl ；
[0034]步驟(3)中含有與靶向0EE2匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下:
[0035]將與0EE2相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIRl 162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2表達骨架；
[0036]通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIRl 162-0EE2表達骨架，獲得完整人工調控miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒p423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因表達盒 5’atpA:: miR0EE2:: 3’rbcL 的 p423miR0EE2 質粒，使用 EcoR V 和 Sma I 雙酶切p423miR0EE2質粒，獲得miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖7所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因表達盒的葉綠體表達載體pmiR0EE2chl ；
[0037]步驟(3)中含有與靶向VIPPl匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下:
[0038]將與靶基因VIPPl相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl表達骨架；
[0039]通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1表達骨架，獲得完整人工調控miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒p423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因表達盒5，atpA:: miRVIPPl:: 3’rbcL 的 p423miRVIPPl 質粒，使用 EcoR V 和 Sma I 雙酶切p423miRVIPPl質粒，獲得miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖8所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因表達盒的葉綠體表達載體pmiRVIPPlchlo
[0040]步驟(4)的遺傳轉化方法采用珠磨法或基因槍法；步驟(5)的篩選在含有10 μ g/ml的2601^(^11抗性平板或15(^8/1111的壯觀霉素抗性平板上進行，篩選獲得陽性藻落后進行分子檢測鑒定。
[0041]本發明還提供了一種可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻，它由上述所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法制備而成。
[0042]本發明是從綠 藻miRNAs文庫中篩選或針對影響光合效率的綠藻功能基因設計調控miRNAs，構建能夠通過光強或溫度等手段誘導表達調控miRNAs的轉基因藻，以miRNAs對其靶基因的抑制作為手段，間斷調控綠藻光合系統II的活性，控制藻細胞內的低氧環境，從而使綠藻細胞能夠持續產氫；以上述方法構建的轉調控miRNA基因藻在產氫過程中不需要交替更換培養基，從而克服了現有綠藻為了持續產氫需要交替更換培養基從而造成其生長和產氫能力大大下降的缺陷，具有產業化應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1為調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因衣藻核表達載體pH105-miR1150.3-124 構建示意圖。
[0044]圖2為調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因衣藻核表達載體pH105-miR1166.1-124 構建示意圖。
[0045]圖3為調控miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因衣藻核表達載體ρΗ105_0ΕΕ2_124構建
示意圖。
[0046]圖4 為調控 miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1 基因衣藻核表達載體 pH105-VIPPl_124 構
建示意圖。
[0047]圖5為調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因衣藻葉綠體表達載體pmiR1150.3chl構建不意圖。
[0048]圖6為調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因衣藻葉綠體表達載體pmiR1166.1chl構建不意圖。
[0049]圖7為調控miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2基因衣藻葉綠體表達載體pmiR0EE2chl構
建示意圖。
[0050]圖8為調控miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl基因衣藻葉綠體表達載體pmiRVIPPlchl
構建示意圖。
[0051 ] 圖9為根據萊茵衣藻缺硫脅迫培養前后miRNAs的表達量的變化篩選的miRNAs序列及其預測的靶基因。
[0052]圖10為WMD3平臺設計的靶向0EE2的候選人工miRNAs。[0053]圖11為WMD3平臺設計的靶向VIPPl的候選人工miRNAs。
[0054]圖12為轉基因衣藻1166.1的DNA-PCR產物電泳圖，共有兩條泳道:其中M為marker DL2000 ；1 為轉基因衣藻 1166.1 的 DNA-PCR 產物。
[0055]圖13為轉基因衣藻P的DNA-PCR產物電泳圖，共有三條泳道:其中M為markerDL2000 ；1為陽性對照(質粒pH105-0EE2-124) ；2為轉基因衣藻P的DNA-PCR產物。
[0056]圖14萊茵衣藻cc-849和轉基因衣藻1166.1在室溫及熱激處理后氫氣產量檢測示意圖。
[0057]圖15萊茵衣藻cc-849和轉基因衣藻P氣體檢測組成成份圖a:萊茵衣藻cc_849(對照組)氣體檢測組成成份；b:轉基因衣藻P氣體檢測組成成份。
[0058]圖16空氣氣體GC檢測組成成份圖。
[0059]圖17萊茵衣藻cc-849和轉基因衣藻P在室溫及熱激處理下的氫氣產量檢測示意圖。
【具體實施方式】[0060]以下對綠藻的代表物種萊茵衣藻進行舉例說明。
[0061]實施例1轉基因受體藻株的選擇與培養
[0062]本發明選擇的轉基因操作的受體為細胞壁缺陷型萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii, cc-849,購自美國Duck大學衣藻遺傳中心)和細胞色素b缺陷型萊茵衣藻(cc-2654,購自美國Duck大學衣藻遺傳中心)。
[0063]上述萊茵衣藻培養時使用的培養基為TAP培養基，所述TAP培養基的組分如下:Tris2.42g, 4XBei jerinck salts (每升含 16g NH4Cl, 2g CaCl2.2H20, 4gMgSO4.7H20) 25mL, IM磷酸鉀緩沖液lmL，Trace微量元素混合液(每升含11.4g H3BO3, 5.6gMnCl2.4H20, 22g ZnSO4.7H20, 4.99g FeSO4.7H20, 1.61g CoCl2.6H20, 1.57g CuSO4.5H20, 1.1g (NH4) 6Mo7024.4H20, 50g Na2EDTA, 20%(m/v) KOH 調 ρΗ6.5-6.8)lmL,溶解到 975mL 水中，使用冰醋酸調pH至6.95-7.05，用水定容至IL (下同)。
[0064]萊茵衣藻的培養條件如下:溫度為22_25°C，在光照強度為90 μ E/m2/s的條件下連續光照培養，通氣量可調整(0.5L/min)，藻細胞對數生長期濃度為1_2X 106cells/mL時離心收集。
[0065]實施例2篩選或設計調控miRNAs
[0066](I)胞內miRNAs的篩選
[0067]萊茵衣藻通過缺硫脅迫培養后，其產氫量提高，檢測其miRNAs的表達量，將表達量發生變化的miRNAs進行統計，建立了小RNA庫(BMC Genomics, 2012，13:108),并且發現建立的小RNA庫中的衣藻miRNAs表達量發生了明顯的變化(2倍以上)，其中絕大多數miRNAs表達量發生了上調，從建立的小RNA庫中篩選了一些預測的靶基因主要是與光系統 II 相關且表達量均顯著上調的 miRNAs，如 miRNA909.l，miR1150.3，miR1166.l，miR1158。圖9為挑選的miRNAs及其預測的靶基因。這里優選選擇miRl 150.3和miRl 166.1進行下一步構建骨架，miR1150.3 的序列為:UGCAGCGGCGACUGGGGCCGA，miR1166.1 的序列為:UGGACCUCGCGGCCCUGGAGG。
[0068](2 )人工mi croRNA序列的設計[0069]采用在線的人工調控miRNAs設計網站(網址http: //wmd3.weigelworld.0rg/CR1-bin/webapp.cgi),將影響光合效率的綠藻$巴基因序列作為$巴基因提交(影響綠藻光合效率的靶基因蛋白包括PSII復合體的組成蛋白(如Dl蛋白、0EE2蛋白等)、天線色素復合體蛋白、碳固定相關蛋白、葉綠體類囊體膜相關蛋白(如VIPPl蛋白)等光合放氫相關的功能蛋白)，并從網站回饋的候選人工調控miRNAs郵件包中挑選與靶基因相匹配的最優化的人工調控miRNAs進行研究。
[0070]本實施例選擇的是光系統II組成蛋白的編碼基因0EE2序列(GenBank基因登錄號:5716532)和葉綠體類囊體膜相關蛋白的編碼基因VIPPl序列(GenBank基因登錄號:5719360)作為靶基因提交，然后，從郵件包中選擇與靶基因0EE2相匹配的最優化的人工調控miRNA對應的DNA序列(圖10，第二行)，并將郵件包中DNA序列的胸腺嘧啶(T)轉換為RNA專用的尿嘧啶(U )，更換后的序列為:UCUAACGUGAAUAGGUGGCAA。從郵件包選擇與靶基因VIPPl相匹配的最優化的人工調控miRNA對應的DNA序列(圖11，最后一行)，并將郵件包中DNA序列的胸腺嘧啶(T)轉換為RNA專用的尿嘧啶(U)，更換后的序列為:UUGACCAUCUUAGACUUGCUC。其余影響光合效率的綠藻靶基因均可按此方法設計人工mi RNAs。
[0071]實施例3調控miRNAs表達骨架的構建及合成
[0072]綠藻miRNAs在細胞內表達時，是先轉錄出包含骨架結構的前體，因此要過表達胞內miRNAs時，也需要為設計的“調控miRNA”選擇一個表達骨架。在本實施例中，選擇在萊茵衣藻中表達豐度高的天然cre-MIR1162M10006223作為篩選的miRNAs的骨架前體。將從小RNA庫中篩選的胞內調控miRNAs成熟序列分別代替cre_MIR1162M10006223中成熟的miRNAs序列，可獲得完整調控miRNAs表達骨架。
[0073]在本實施例中，從庫中篩選了 miR1150.3及miR1166.1進行研究，其余庫中的miRNAs均可按此方法進行構建與合成。分別將miR1150.3和miR1166.1的成熟序列代替cre-MIR1162M10006223的 成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，分別獲得靶向目的基因的完整調控miRNAs的新序列，SP含有miR1150.3的完整調控miRNA表達骨架命名為miRNA-cre-MIR1162_miR1150.3，基因序列如SEQ ID N0.1所示，以及含有miR1166.1的完整調控miRNA表達骨架命名為miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1，基因序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0074]SEQ ID N0.1
[0075]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCGGG
[0076]Nco I Nhe I
[0077]ACCCAGUCGCCGCUGCACGCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGG
[0078]ACCCCUCGGGACCCGGUACGUCGUGCAGCGGCGACUGGGGC
[0079]CGAGGUCGCGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCAG
[0080]Pmac I Pst I
[0081]SEQ ID N0.2
[0082]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCgucaa
[0083]Nco I Nhe I
[0084]gggccgcgagguccacgCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGGACCCCUCG
[0085]GGACCCGGUACGUCGUGGACCUCGCGGCCCUGGAGGGGUC[0086]GCGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCAG
[0087]Pmac I Pst I
[0088]在本實施例中，分別將實施例2設計的與靶基因0EE2和VIPPl相匹配的最優化的人工調控miRNA代替cre-MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上NcoI和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，分別獲得靶定0EE2基因的完整人工調控miRNA表達骨架命名為miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2，基因序列如SEQ ID N0.3所示；以及靶定VIPPl基因的完整人工調控miRNA表達骨架命名為miRNA-cre-MIRl 162 -VIPPl，基因序列如SEQ ID N0.4所不。
[0089]SEQ ID N0.3
[0090]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCggcaa
[0091]Nco I Nhe I
[0092]ccuauucacguuagacgCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGGACCCCUCG
[0093]GGACCCG⑶ AC⑶ C⑶ CUAAC⑶GAAUAG⑶GGCAAG⑶ CG
[0094]CGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCAG
[0095]Pmac I Pst I
[0096]SEQ ID N0.4
[0097]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCCGC
[0098]Nco I Nhe I
[0099]CAGUCUAAGAUGGUCAACGCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGG
[0100]ACCCCUCGGGACCCGGUACGUCGUUGACCAUCUUAGACUUG
[0101]CUCCGGUCGCGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCA
[0102]Pmac I Pst I
[0103]G
[0104]然后分別將上述設計好的miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3、miRNA-cre-MIRl162-miRl166.1、miRNA-cre-MIRl162 - OEE2 和 miRNA-cre-MIRl162 -VIPPl送上海生物工程有限公司進行人工合成，并通過測序進行驗證。
[0105]實施例4調控miRNAs綠藻表達載體的構建
[0106](I)調控miRNAs衣藻核表達載體的構建
[0107]可通過Nhe I和Pmac I雙酶切實施例3中設計并合成的完整miRNAs表達骨架，如 miRNA-cre-MIRl162-miRl150.3,miRNA-cre-MIRl162-miRl166.l、miRNA-cre_MIR1162 -0EE2 或 miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl。載體 pH105【Wu JX et al.Efficient expressionof green fluorescent protein (GFP) mediated by a chimeric promoter inChlamydomonas reinhardti1.Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2008(26): 242-247】克隆有HSP70A-RBCS2啟動子序列和RBCS2終止子序列，中間攜帶有Pmac 1、Nhe 1、Xba I和Sal I等多克隆酶切位點，可以插入外源基因并在衣藻核基因組中表達° 載體 pSP124 [Lambreras v, Stevens DR, Purton S.Efficient foreign geneexpression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron.PlantJ.1998; 14(4): 441-447】含有表達盒RBCS2:: ble:: RBCS2，可使轉化的宿主細胞獲得腐草霉素和Zeomycin抗性，在本發明中作為衣藻轉化的篩選標記。[0108]使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化實施例3中設計并人工合成的完整miRNA 表達骨架 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3，可獲得 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因(166bp)，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得pH105-miR1150.3，通過EcoR I酶切pH105_miR1150.3，獲得調控miRNA基因表達框架(HSP70A-RBCS2:: miRl150.3:: RBCS2),將其插入 pSP124 的 EcoR I 位點，獲得調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3 基因衣藻細胞核表達載體 pH105-miRl 150.3-124 (圖1)。
[0109]使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化實施例3中設計并人工合成的完整miRNA 表達骨架 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1，可獲得 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因(166bp)，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得pH105-miR1166.1，通過EcoR I酶切pH105_miR1166.1，獲得調控miRNA基因表達框架(HSP70A-RBCS2:: miR1166.1:: RBCS2),將其插入 pSP124 的 EcoR I 位點，獲得調控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1 基因衣藻細胞核表達載體 pH105_miR1166.1-124 (圖 2)。
[0110]使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化實施例3中設計并人工合成的完整人工 miRNA 表達骨架 miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2,可獲得 miRNA-cre-MIR1162_0EE2 基因(166bp)，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得pH105_0EE2。通過EcoR I酶切PH105-0EE2，獲得調控miRNA基因表達框架(HSP70A-RBCS2:: 0EE2:: RBCS2)，將其插入pSP124的EcoR I位點，獲得調控miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因衣藻細胞核表達載體PH105-0EE2-124 (圖 3)。
[0111]使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化實施例3中設計并人工合成的完整人工 miRNA 表達骨架 miRNA-cre-MIRl 162 -VIPPl，可獲得 miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1 基因(167bp)，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得pH105_VIPPl。通過EcoRI 酶切 pH105-VIPPl，獲得調控 miRNA 基因表達框架(HSP70A-RBCS2:: VIPPl:: RBCS2)，將其插入pSP124的EcoR I位 點，獲得調控miRNA-cre-MIR1162_VIPPl基因細胞核衣藻表達載體 PH105-VIPP1-124 (圖 4)。
[0112](2)調控miRNAs基因衣藻葉綠體表達載體的構建
[0113]質粒p423 (購自美國Duck大學衣藻中心)上攜帶有aadA基因表達盒(5’ atpA:: aadA:: 3’ rbcL)，aadA基因作為衣藻遺傳轉化的篩選標記，賦予宿主細胞壯觀霉素抗性。萊茵衣藻葉綠體表達載體p423chl由深圳大學生命科學學院構建(構建方法見專利ZL200810066705.8)，攜帶有chlB基因外顯子5’和3’端序列，在衣藻遺傳轉化過程中，作為同源轉化片段，可使外源目的基因定點整合入葉綠體DNA的chlB基因的5’和3’端序列之間的位置。
[0114]通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切實施例3中設計并人工合成的完整miRNA表達骨架miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3，可獲得完整調控 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3 基因(166bp)，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒p423框架通過連接酶進行連接，構建得到含 miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3 基因表達盒(5，atpA:: miR1150.3:: 3，rbcL)的p423miR1150.3質粒。使用EcoR V和Sma I雙酶切上述構建的p423miR1150.3質粒，獲得miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表達盒的萊茵衣藻葉綠體表達載體pmiR1150.3chl(見圖5)。
[0115]含有aadA基因表達盒和miRNAs-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因表達盒的萊茵衣藻葉綠體表達載體pmiR1166.1chl (見圖6)、含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162 -0EE2基因表達盒的萊茵衣藻葉綠體表達載體pmiR0EE2chl (見圖7)及含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl基因的表達盒萊茵衣藻葉綠體表達載體pmiRVIPPlchl(見圖8)構建過程同上。
[0116]實施例5調控miRNAs在萊茵衣藻細胞的遺傳轉化
[0117]1.“珠磨法”遺傳轉化
[0118]米用QIAGEN⑧Plasmid Purification Kit 提取調控 miRNA 核表達質粒。“珠磨法”具體步驟如下:
[0119](I)將細胞壁缺陷型萊茵衣藻cc-849在連續光照和TAP培養基中培養至對數期，細胞數約為l-2X106cells/ml(TAP培養基配方及培養條件見實施例1)，室溫(20_25°C )下5000rmp離心5min,棄上清,得到藻細胞沉淀；
[0120](2)用滅過菌的新鮮TAP培養基重懸藻細胞沉淀，調整細胞濃度至2X IO8細胞/ml，得到藻細胞懸浮液；
[0121](3)吸取270μ I藻細胞懸浮液至1.5ml EP管中(內含已滅菌的合金錫珠)，加入I μ g酶切成線狀的含調控miRNA的衣藻細胞核表達載體(pH105-miR1150.3-124，pH105-miR1166.1-124，ρΗ105_0ΕΕ2_124 或 pH105-VIPPl_124)(均為 200 μ g/μ I)以及30 μ 150% (m/v)聚乙二醇(PEG6000)到EP管中，得到衣藻細胞/合金錫珠/外源DNA混合物；同時建立一個不添加PEG6000的樣品組；此外，還建立一個不添加DNA的對照組；
`[0122](4)將上述衣藻細胞/合金錫珠/外源DNA混合物置于振蕩器上以最高速振蕩25s ；
[0123](5)將振蕩后的衣藻細胞/合金錫珠/外源DNA混合物轉移到含有IOml新鮮TAP培養基的離心管中，在IOOrpm搖床弱光下過夜培養(22-25°C)，使細胞恢復；
[0124](6) 3000rmp室溫(20-25°C )離心5min，收集細胞，棄上清；用500μ I新鮮TAP培養基小心重懸細胞，加入3.5ml0.5% TAP培養基，混勻后倒在含有10 μ g/ml的Zeomycin的TAP固體平板上，置于光照培養箱(22-25°C，90y E/m2/s)里倒置培養約3周，待平板上長出綠色的單克隆。
[0125]2.“基因槍法”遺傳轉化
[0126]“基因槍”遺傳轉化在無菌超凈工作臺中使用基因槍(Bio-Rad)進行。具體步驟如下:
[0127](I)萊茵衣藻cc-2654在TAP培養基中培養至對數生長期(1_2X 106cells/ml)，5000rmp室溫(20_25°C )離心5min，收集藻細胞；棄上清；用滅過菌的新鮮TAP培養基重懸藻細胞沉淀，調整細胞濃度至2X108cells/ml，得到藻細胞懸浮液；吸取300 μ I藻細胞懸浮液涂布于TAP固體平板中央(直徑為35mm) ;22_25°C光照(90 μ E/m2/s)培養24小時，待平板表面形成一層細胞層。
[0128](2)取100 μ I金粉懸浮液(60mg/mL)，依次加入5μ g含調控miRNA的衣藻細胞葉綠體表達載體(pmiR1150.3chl, pmiR1166.1chl, pmiR0EE2chl 或 pmiRVIPPlchl)(均為100 μ g/μ 1),100μ 12.5Μ CaCljP 40 μ 10.1M亞精胺，通過漩渦振蕩器振蕩2-3分鐘，靜置1分鐘，8，OOOrpm室溫(20-25°C )離心2秒，棄上清；加入280 μ 170%乙醇清洗，棄上清；加入280ul無水乙醇清洗，棄上清；加入100 μ I無水乙醇，輕輕重懸。
[0129](3)取10μ1 DNA金粉包被液用于轟擊；轟擊參數如下所示:可裂膜氦氣壓力IlOOpsi,真空度25inches.Hg,轟擊距離9cm,金粉顆粒直徑IOOnm ；
[0130](4)把轟擊后的平板放置于22_25°C光照培養箱中，光照(90 μ E/m2/s)培養8h。用ImL新鮮TAP培養基將衣藻細胞洗下，涂布于含壯觀霉素抗生素篩選平板培養約3周(22-25°C，90 μ E/m2/s)，待平板上長出綠色單克隆。
[0131]實施例6轉調控miRNAs基因藻的篩選與鑒定
[0132]轉基因綠操由于導入ble基因而具有Zeomycin抗性或是導入aadA基因而具有壯觀霉素抗性，因此可在含有10 μ g/ml的Zeomycin抗性平板或150 μ g/ml的壯觀霉素抗性平板上對實施例5的遺傳轉化方法得到的綠藻進行初步篩選，以獲得轉調控miRNA基因藻。
[0133]初步篩選獲得的轉基因藻進行如下的分子檢測:基因組DNA-PCR檢測、RT-PCR檢測和Western blot檢測。本實施例以實施例5中通過“珠磨法”遺傳轉化獲得的含有miRNA-cre-MIRl 162 - miRl 166.1 基因的轉基因藻 1166.1 和含有 miRNA-cre-MIRl 162 -0EE2基因的轉基因衣藻P為例，轉基因藻采取基因組DNA-PCR檢測，具體步驟如下:
[0134](I)轉基因衣藻總DNA的提取
[0135]分別挑選轉基因衣藻1166.1和轉基因衣藻P分別接種到空白平板TAP培養基上，待單克隆子長出來之后，再接種到液體培養基，待生長到對數期之后，分別提取基因組DNA，基因組 DNA 的提取方法參照 TAKARA Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 說明書。
[0136](2 )基因組 DNA-PCR 檢測
[0137]使用根據萊茵衣藻細胞核表達載體pH105_miR1166.1_124載體序列設計的引物對轉基因衣藻1166.1進行基因組PCR檢測，結果顯示轉基因衣藻1166.1的基因組通過PCR擴增得到約593bp的目的條帶(見圖12)。使用根據萊茵衣藻細胞核表達載體PH105-0EE2-124載體序列設計的引物對轉基因衣藻P進行基因組PCR檢測，結果顯示轉基因衣藻P的基因組通過PCR擴增得到與陽性對照一致的目的條帶(見圖13)。以上實驗結果表明，miRNAs-cre-MIRl 162-miRl 166.1 和 miRNA-cre_MIR1162 - 0EE2 已整合到萊茵衣藻基因組中。
[0138]同樣，也可用同樣的方法鑒定miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3和miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1是否已整合到萊茵衣藻核基因組或葉綠體基因組中。
[0139]實施例7轉基因藻持續產氫調控分析
[0140]將轉基因藻接種到綠藻光合制氫反應器(頂空瓶)內，先檢測頂空瓶的氣密性，接種后光照培養(溫度為22-25°C，光照強度為90 μ E/m2/s)到對數生長期，將培養至對數生長期(濃度為l-2X106cells/mL)的藻液，采用連續熱激(Heat Shock,簡稱HS) (40°C，60min)的方法，采用熱激培養I小時再光照恢復培養(溫度為20-25°C，光照強度為90μ E/m2/s)24小時，重復此操作，共進行三次熱激培養和恢復培養。每次熱激前先測量藻液OD值，從生長曲線對照表確認藻液的生長濃度，每次熱激后再取氣體進行GC檢測。
[0141]本研究利用GC色譜儀對密閉培養的藻液進行氣體分析，當氣體通過TCD檢測器時，將不同氣體進行分離，即設定程序將CO2先放出，再使后續h2、o2、n2的氣體依次過柱，以保證檢測器有單峰依照時間分開出現。
[0142]本實施例以實施例5和實施例6獲得的轉基因衣藻1166.1和轉基因衣藻P為例進行氫氣含量檢測。將培養至對數期(濃度為1-2XlO6ceIlsAiL)的萊茵衣藻cc-849(對照組)、轉基因衣藻1166.1和轉基因衣藻P分別進行熱激處理，同時，還以室溫(RoomTemperature，簡稱RT) (22_25°C )培養的衣藻作為對照組，分別進行氣體檢測。從圖14可以看到轉基因衣藻1166.1的產氫量在經過三次熱激誘導后其產氫量有一個很大的提高，氫含量達到了氣體總體積的11.958%。將峰面積與對照組(cc-849-RT)相對比，轉基因藻1166.1熱激三次之后產氫量增長近I倍。從圖15可以看到萊茵衣藻cc-849和轉基因衣藻P氣體組成部分都包含四個組份:C02、H2、02、N2，且各組分出峰時間基本一致，表明其組份成分一致。從圖15和16可以看出，以空氣作為對照組進行比對，藻液氣體檢測中出峰時間
2.8s左右的單峰為H2。從圖17可以看出，通過熱激培養的轉基因衣藻P氫氣含量比對照組cc-849氫含量高了 1.5倍。以上實驗結果表明，利用熱激和強光恢復處理手段，經過轉調控miRNAs的轉基因藻氫氣·含量得到明顯的提高。
【權利要求】
1. 一種可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，包括如下步驟: (O轉基因受體藻的篩選和培養； (2)篩選或設計調控miRNAs:根據表達量發生變化的miRNAs建立小RNA庫，并從中篩選出預測的靶基因是與光系統II相關的且表達量均顯著上調的miRNAs，或根據影響光合效率的綠藻靶基因序列設計并合成調控該基因的人工miRNAs ； (3)分別構建含有步驟(2)的各調控miRNAs的綠藻核表達載體或綠藻葉綠體表達載體； (4)步驟(3)中得到的綠藻核表達載體或綠藻葉綠體表達載體的遺傳轉化； (5)轉基因綠藻的篩選。
2.根據權利要求1所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于，所述轉基因受體藻為細胞壁缺陷型萊茵衣藻或細胞色素b缺陷型萊茵衣藻，其培養條件如下:采用TAP培養基，在溫度為22-25°C、光照強度為90μ E/m2/S的條件下連續光照通氣培養，藻細胞對數生長期濃度為1-2 X IO6細胞/mL時離心收集。
3.根據權利要求2中所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)的調控miRNAs為預測的靶基因為細胞色素P450CYP3/CYP5/CYP6/CYP9亞家族的miR1150.3，預測的靶基因為磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的miR1166.1，靶基因為組成PSII復合體的OEE2蛋白的編碼基因的人工調控miRNAs，靶基因為與葉綠體類囊體膜相關的VIPPl蛋白的編碼基因VIPPl的人工調控miRNAs。
4.根據權利要求3所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于，步驟(3)是先將各調控miRNAs的成熟序列代替cre-MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，得到調控miRNAs表達骨架；再利用調控miRNAs表達骨架構建綠藻核表達載體或綠藻葉綠體表達載體。
5.根據權利要求4所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于，步驟(3)中綠藻核表達載體的構建方法:使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化上述調控miRNAs表達骨架，得到相應的基因，將相應的基因插入經Pmac I和Nhe I消化的PH105載體并用EcoR I酶切，獲得調控miRNA基因表達框架，將調控miRNA基因表達框架插入pSP124的EcoR I位點，即獲得綠藻核表達載體。
6.根據權利要求4所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于，步驟(3)中綠藻葉綠體表達載體的構建方法:通過Nco I和Pst I雙酶切質粒P423切除aadA基因，獲得質粒p423框架；通過Nco I和Pst I雙酶切上述調控miRNAs表達骨架，獲得相應的基因；將相應的基因與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒p423框架通過連接酶進行連接獲得質粒，使用EcoR V和Sma I雙酶切前述質粒，獲得相應的基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，即獲得綠藻葉綠體表達載體。
7.根據權利要求5所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于， 步驟(3)中含有調控miRl 150.3的綠藻核表達載體的構建方法如下: 將miR1150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表達骨架； 使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre-MIR1162_miR1150.3表達骨架，可獲得miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得pH105-miR1150.3，用EcoR I酶切pH105-miR1150.3，獲得調控miRNA基因表達框架 HSP70A-RBCS2:: miR1150.3:: RBCS2，將其插入 pSP124 的 EcoR I 位點，構建得到附圖1所示的調控 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3 基因綠藻核表達載體 pH105_miR1150.3-124 ；步驟(3)中含有調控miR1166.1的綠藻核表達載體的構建方法如下: 將miR1166.1的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表達骨架； 使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre-MIR1162_miR1166.1表達骨架，獲得 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1 基因，將其插入經 Pmac I 和 Nhe I 消化的 pH105 載體，獲得pH105-miR1166.1，用EcoR I酶切pH105_miR1166.1，獲得調控miRNA基因表達框架HSP70A-RBCS2:: miR1166.1:: RBCS2，將其插入 pSP124 的 EcoR I 位點，構建得到附圖 2 所示的調控 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1 基因綠藻核表達載體 pH105_miR1166.1-124 ；步驟(3)中含有與靶向0EE2匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下: 將與0EE2相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - 0EE2表達骨架； 使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre_MIRl 162 - 0EE2表達骨架，獲得miRNA-cre-MIR1162-0EE2基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得PH105-0EE2，用EcoR I酶切pH105_0EE2，獲得調控miRNA基因表達框架HSP70A-RBCS2:: 0EE2:: RBCS2，將其插入pSP124的EcoR I位點，構建得到附圖3所示的調控 miRNA-cre-MIR1162-0EE2 基因綠藻核表達載體 ρΗ105_0ΕΕ2_124 ；步驟(3)中含有與靶向VIPPl匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下: 將與靶基因VIPPl相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - VIPPl表達骨架；使用限制性內切酶Nhe I和Pmac I消化miRNAs-cre_MIR1162 - VIPPl表達骨架，可獲得miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因，將其插入經Pmac I和Nhe I消化的pH105載體，獲得PH105-VIPP1，用EcoR I酶切pH105_VIPPl，獲得調控miRNA基因表達框架HSP70A-RBCS2:: VIPPl:: RBCS2，將其插入pSP124的EcoR I位點，構建得到附圖4所示的調控 miRNA-cre-MIR1162-VIPPl 基因綠藻核表達載體 pH105-VIPPl_124。
8.根據權利要求6所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于， 步驟(3)中含有調控miR1150.3的綠藻葉綠體表達載體的構建方法如下:將miR1150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表達骨架； 通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表達骨架，獲得完整調控miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒P423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因表達盒5’ atpA:: miR1150.3:: 3’ rbcL 的 p423miR1150.3 質粒，使用 EcoR V和 Sma I 雙酶切p423miRl 150.3 質粒，獲得 miRNA-cre_MIRl 162_miRl 150.3 基因表達盒，將其與經 EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖5所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因表達盒的綠藻葉綠體表達載體pmiR1150.3chl ； 步驟(3)中含有調控miR1166.1的綠藻葉綠體表達載體的構建方法如下: 將miR1166.1的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表達骨架； 通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表達骨架，獲得完整調控miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒P423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因表達盒5’ atpA:: miR1166.1:: 3’ rbcL 的 p423miR1166.1 質粒，使用 EcoR V和 Sma I 雙酶切p423miR1166.1 質粒，獲得 miRNA-cre-MIR1162_miR1166.1 基因表達盒，將其與經 EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連·接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖6所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIR1162_miR1166.1基因表達盒的葉綠體表達載體pmiR1166.1chl ； 步驟(3)中含有與靶向0EE2匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下: 將與0EE2相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - 0EE2表達骨架； 通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIR1162-0EE2表達骨架，獲得完整人工調控miRNA-cre-MIR1162-0EE2基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒P423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIR1162-0EE2基因表達盒5’ atpA:: miR0EE2:: 3’ rbcL 的 p423miR0EE2 質粒，使用 EcoR V 和 Sma I 雙酶切p423miR0EE2質粒，獲得miRNA-cre-MIR1162_0EE2基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖7所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIR1162_0EE2基因表達盒的葉綠體表達載體pmiR0EE2chl ；步驟(3)中含有與靶向VIPPl匹配的人工調控miRNA的綠藻核表達載體的構建方法如下: 將與靶基因VIPPl相匹配的人工調控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同時在上游加上Nco I和Nhe I酶切位點，下游加上Pmac I和Pst I酶切位點，構建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - VIPPl表達骨架； 通過Nco I和Pst I雙酶切質粒p423切除aadA基因，獲得質粒p423框架，通過Nco I和Pst I雙酶切miRNA-cre-MIR1162-VIPPl表達骨架，獲得完整人工調控miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因，將其與上述經過Nco I和Pst I雙酶切的質粒P423框架通過連接酶進行連接，構建得到含miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因表達盒·5，atpA:: miRVIPPl:: 3’rbcL 的 p423miRVIPPl 質粒，使用 EcoR V 和 Sma I 雙酶切p423miRVIPPl質粒，獲得miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因表達盒，將其與經EcoR V雙酶切的p423chl質粒用連接酶進行連接，通過Xho I酶切篩選正向連接的質粒，構建得到附圖8所示的含有aadA基因表達盒和miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因表達盒的葉綠體表達載體pmiRVIPPlchlo
9.根據權利要求1所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法，其特征在于，步驟(4)的遺傳轉化方法采用珠磨法或基因槍法；步驟(5)的篩選在含有10μ g/ml的Zeomycin抗性平板或150 μ g/ml的壯觀霉素抗性平板上進行，篩選獲得陽性藻落后進行分子檢測鑒定。
10.一種可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻，其特征在于，它由權利要求1-9任一項所述的可連續光合放氫的轉調控miRNAs基因綠藻的構建方法制備而成。
【文檔編號】C12N1/13GK103571868SQ201310541659
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】胡章立, 李輝, 莊曉珊, 張立, 舒龍飛 申請人:深圳大學