一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量rt-pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，包括：（1）陽性標準品；（2）陰性對照；（3）RT-PCR反應液；（4）反應酶混合液；（5）探針溶液；（6）無RNase水。本試劑盒對甘蔗條紋花葉病毒的檢測有高度的特異性，與其他植物病毒無交叉反應；檢測的靈敏度達102拷貝，可直接用于甘蔗植株、脫毒種苗等樣本的定量檢測甘蔗條紋花葉病毒；利用本發明試劑盒檢測快速簡單，準確性好，靈敏度高，檢測結果可靠穩定。
【專利說明】一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測植物病毒的試劑盒，具體涉及一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，屬于植物病毒檢測【技術領域】。
【背景技術】[0002]甘鹿條紋花葉病毒streakmosaic virus, SCSMV)屬于馬鈴薯 Y 病毒科/7Oacerirw1S屬，是引起甘鹿花葉病的病原物之一。感病植株一般出現黃綠相間不規則的花紋、條斑或斑駁，長短、大小不一，布滿整個葉片，尤以新葉基部癥狀最為明顯。感病植株葉片黃化，植株矮化，分蘗減少，節間縮短，造成甘蔗產量及蔗莖含糖量降低。SCSMV主要通過植株無性繁殖材料長距離傳播的，傳播蟲媒尚未確定。該病毒有著廣泛的寄主范圍，可以侵染玉米、高粱、狼尾草等植物。目前該病毒主要分布于印度、巴基斯坦、泰國、緬甸、越南、孟加拉、斯里卡蘭、印尼等亞洲國家。在我國的廣東、云南、海南甘蔗種質資源圃有檢測到SCSMV，生產蔗區種植的甘蔗尚未發現。
[0003]為防止國外SCSMV株系隨著蔗莖種苗引種入境以及在國內進一步擴散傳播，為我國甘蔗脫毒種苗質量安全提供技術支撐，必需具有一種快速、可靠、靈敏的檢測試劑盒及檢測方法。國內外有關SCSMV檢測技術主要利用血清學反應和常規的RT-PCR技術。血清學反應方法具有操作簡單、高通量的優點，但需要制備高質量的血清和靈敏度不高等缺點，在實際中很難應用。常規的RT-PCR方法需要進行PCR后處理，接觸溴化乙錠(EB)等有毒試劑，且只能終點定性檢測，無法對病毒滴度進行準確定量。隨著分子檢測技術的發展，實時熒光定量RT-PCR以其高靈敏度、高特異性和高準確度等優點，被廣泛應用于植物病害的檢測。與常規PCR相比，它具有特異性更強、檢測周期更短、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。有關檢測甘蔗條紋花葉病毒的實時熒光定量RT-PCR試劑盒及其方法未見報道。
[0004]本發明選擇甘蔗條紋花葉病毒外殼蛋白(CP)基因保守區序列，設計用于熒光定量RT-PCR檢測的引物及探針，通過對反應體系的優化，設計用于檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光RT-PCR試劑盒。
[0005]
【發明內容】

[0006]本發明目的是提供一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，該試劑盒能快速準確的對待測樣品的甘蔗條紋花葉病毒進行定量檢測。該試劑盒不僅可使用于目前市場上的所有類型熒光定量PCR儀，而且能夠靈敏、特異的對甘蔗條紋花葉病毒進行定量檢測。
[0007]為了實現本發明的目的，本發明的技術方案如下:
本發明采用Taqman探針建立熒光定量RT-PCR檢測甘蔗條紋花葉病毒試劑盒，通過制備RNA標準樣品與待測樣品同時檢測得到待測樣品的初始病毒拷貝數，對病毒進行定量檢測。
[0008]本發明提供了一種利用熒光定量RT-PCR方法檢測甘蔗條紋花葉病毒的引物對QPCR-Fl、QPCR-Rl和Taqman探針QPCR-P1，所述的引物對序列如下:
QPCR-Fl:5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’，
QPCR-Rl:5’ -GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’ ；
Taqman探針QPCR-Pl的序列如下:
5，-FAM-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-TAMRA-3，。
[0009]本發明還提供一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成:
(1)陽性標準品:采用T7RNA聚合酶體外轉錄合成含有目的檢測基因的RNA作為標準樣品，I X 101°拷貝/ μ L，50 μ L/瓶，-20°C冷凍保存；
(2)陰性對照:采用無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性對照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存備用；
(3)町-?0?反應液:每個反應包括2\1?1'-?0?緩沖液10μ LUO mmol dNTPs 0.4 μ L、25 mmol MgCl2 1.6 μ L 以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對 QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 各0.4 μ L,共12.8 μ L，50個反應體系共計640 μ L，-20 1:保存備用；
(4)反應酶混合液:每個反應體系包括AMV逆轉錄酶液0.4μL、Taq酶0.4 yL，含量為5 U/ μ L，共0.8 μ L，50個反應體系共計40 μ L，_20°C保存備用；` (5 )探針溶液:Taqman探針QPCR-PI采用5 ’ -FAM和3 ’ -TAMRA修飾，合成后采用無RNase水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個反應體系0.8 μ L, 50個反應體系共計40 yL,_20°C保存備用;
(6)無 RNase 水:2X IOmL/ 瓶。
[0010]本發明的優點和有益效果主要體現在:本試劑盒對甘蔗條紋花葉病毒的檢測有高度的特異性，與其他甘蔗病毒無交叉反應；檢測的靈敏度達IO2拷貝，可以在甘蔗田間樣品和脫毒種苗等樣本中檢測甘蔗條紋花葉病毒；利用本發明試劑盒檢測操作簡單快速，從樣品病毒核酸提取至完成檢測，耗時不超過3小時。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是甘蔗條紋花葉病毒RNA標準品熒光定量RT-PCR的動力學曲線。圖中橫坐標代表熒光定量RT-PCR擴增循環數，縱坐標代表熒光信號強度，擴增曲線分別是RNA標準品 IXlO9 拷貝 / μ UlXlO8 拷貝 / μ UlXlO7 拷貝 / μ UlXlO6 拷貝 / μ UlXlO5 拷貝 /μ UlXlO4 拷貝 / μ UlXlO3 拷貝 / μ L 和 IX IO2 拷貝 /yL。
[0012]圖2是甘蔗條紋花葉病毒RNA標準品熒光定量RT-PCR的標準曲線。橫坐標x代表標準品拷貝數的對數值，縱坐標y代表RT-PCR擴增循環數；y= -3.243x+42.12 ;R代表相關系數，決定系數R2=0.997。
【具體實施方式】
[0013]為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以說明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業途徑獲得。
[0014]實施例1 一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，包括Taqman 探針 QPCR-Pl 和引物對 QPCR-Fl、QPCR-Rl，其中 Taqman 探針 QPCR-Pl 序列為5，- CACCATCACGAAATCAATGCAGCA _3 ’，探針的5 ’端和3 ’端分別采用熒光基團FAM和TAMRA 進行修飾；引物對 QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 序列為 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和5’ -GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’ ；該試劑盒包括下列試劑:
(I)陽性標準品:利用常規RT-PCR擴增方法擴增獲得甘蔗條紋花葉病毒CP完整基因，PCR產物純化克隆到pGEM-T載體，然后用&0RI酶切線性化重組質粒，采用T7 RNA聚合酶體外轉錄合成含有CP基因的RNA，用DNase I酶消化剩余的DNA，然后將轉錄RNA產物純化，得到甘蔗條紋花葉病毒的RNA作為標準樣品。用核酸蛋白分析儀測定體外轉錄產物的含量為100 ng/μ L，轉錄產物大小為913 bp，根據公式計算RNA標準樣品的拷貝數為1.94X IO11拷貝/ μ L，并稀釋成標準樣品I X 101°拷貝/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存。
[0015](2)陰性對照:采用無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性對照，用核酸蛋白分析儀測定提取的總RNA濃度，并稀釋成濃度為100 ng/yL作為陰性樣品，50 μ L/瓶，-20 1:冷凍保存備用。
[0016](3)RT-PCR 反應液:每個反應包括 2XRT-PCR 緩沖液 10 μ LUO mmol dNTPs 0.4μ L.25 mmol MgCl2 1.6 μ L，以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對 QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 各 0.4μ L，共12.8 μ L，50個反應體系共計640 μ L, -20 °C保存備用。
[0017](4)反應酶混合液:每個反應體系包括AMV逆轉錄酶液0.4 yL、Taq酶0.4 μ L，含量為5 U/μ L，共0.8 μ L，50個反應體系共計40 μ L, -20 °C保存備用。
[0018](5)探針溶液=T`aqman探針QPCR-Pl采用5’ -FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無RNase水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個反應體系0.8 μ L, 50個反應體系共計40 μ L,-20 °C保存備用。
[0019](6)無 RNase 水:2X 10 mL/瓶。
[0020]實施例2甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒檢測應用
I)標準品RNA稀釋:將甘鹿條紋花葉病毒RNA標準品用無RNase水按10倍稀釋成I X IO9^l X IO2拷貝/ μ L的一系列RNA標準品。
[0021]2)標準曲線方程建立
以此稀釋后RNA標準品為模板，每個標準樣品處理重復3次。并以無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片總RNA為陰性對照，以無RNase水為空白對照。按上述試劑盒內組分，熒光定量RT-PCR反應總體系為20 μ L，包括RT-PCR反應液12.8 μ L，反應酶混合液0.8 yL，探針溶液0.8 μ L，標準樣品RNA 1.0 μ L，無RNases水補至20 μ L ;然后放于ABI公司7500定量PCR儀進行熒光定量RT-PCR擴增。擴擴增程序為:第一階段為RNA樣品反轉錄反應:42 V 5 min反轉錄，95 V 10 s終止反轉錄；第二階段為PCR反應:95 V 5 S，60 V 34s，40個循環，在60 °C進行單點熒光檢測。獲得如圖1所示的擴增曲線，然后繪制如圖2所示的標準曲線，構建標準曲線方程。本實施例構建的標準曲線方程為Υ=_3.2436Χ+42.127，決定系數R2為0.9976，擴增效率為103.37%，滿足熒光定量RT-PCR正常的標準曲線要求。檢測靈敏度可IO2拷貝/yL。將熒光定量RT-PCR方法獲得產物用常規電泳檢測，只能檢測到IO4拷貝/ μ L，比常規的RT-PCR檢測靈敏度至少高100倍。[0022]3)待測樣品RNA提取:采用TEIZOL--試劑盒提取幾份待測甘蔗葉片rna，在核酸蛋白分析儀上測定RNA的光吸收值，計算提取的RNA濃度，然后統一稀釋成100 ng/ μ L。
[0023]4)熒光定量RT-PCR擴增:以待測樣品的RNA為模板，熒光定量RT-PCR反應總體系和擴增程序同上述標準曲線方程建立。在ABI公司7500定量PCR儀進行熒光定量RT-PCR擴增，獲得待測樣品的甘蔗條紋花葉病毒標準品熒光定量RT-PCR的動力學曲線。將待測樣品的Ct值代入標準曲線方程轉化成初始病毒分子拷貝數，即一個分子拷貝數代表一個甘蔗條紋花葉病毒，從而定量分析甘蔗樣品中感染甘蔗條紋花葉病毒的數量，結果如表1所示。檢測結果表明，具有花葉病癥狀的福農39號、云蔗07-2384、新臺糖22、云蔗05-49這4個田間樣品證實感染了甘蔗條紋花葉病毒，病毒含量達IO4IO7拷貝/μ L。為了進一步證實感染的病毒是甘蔗條紋花葉病毒，我們將熒光定量RT-PCR產物進行克隆和測序，核苷酸序列提交http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/比對,結果證實是甘鹿條紋花葉病毒,屬于馬鈴薯Y病毒科禾本科屬(Foacevirus)。本發明建立的檢測甘蔗條紋花葉病毒熒光定量RT-PCR方法具有很好的重復性，同一樣品的Ct值變異系數小于2 %。
[0024]利用本發明的Taqman探針熒光定量一步法RT-PCR試劑盒進行檢測時，可以準確快速的得到樣品的甘蔗條紋花葉病毒初始拷貝數，可以應用于甘蔗田間樣品檢測、脫毒種苗質量監控和甘蔗抗性鑒定。
[0025]表1待測樣品Ct值及穩定性
【權利要求】
1.一種檢測甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，包括Taqman探針QPCR-Pl和引物對QPCR-Fl、QPCR-Rl，其中Taqman探針QPCR-Pl序列為5’ -CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-3’，探針的5’端和3’端分別采用熒光基團FAM和TAMRA 進行修飾；引物對 QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 序列為 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和5’ -GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’。
2.一種用于甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成 : (1)陽性標準品:采用T7RNA聚合酶體外轉錄合成含有目的檢測基因的RNA作為標準樣品，I X 101°拷貝/ μ L，50 μ L/瓶，-20°C冷凍保存； (2)陰性對照:采用無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性對照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存備用； (3)町-?0?反應液:每個反應包括2\1?1'-?0?緩沖液10μ LUO mmol dNTPs 0.4 μ L、.25 mmol MgCl2 1.6 μ L，以及權利要求1所述的引物對，10 ymol/L的QPCR-Fl和QPCR-Rl各0.4 μ L，共12.8 μ L，50個反應體系共計640 μ L，-20 1:保存備用； (4)反應酶混合液:每個反應體系包括AMV逆轉錄酶液0.4μL、Taq酶0.4 yL，含量為5 U/ μ L，共0.8 μ L，50個反應體系共計40 μ L，-20 1:保存備用； (5)探針溶液:如權利要求1所述的Taqman探針QPCR-P1，采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無RNase水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個反應體系0.8 μ L, 50個反應體系共計40 μ L，_20°C保存備用； (6)無RNase 水:2X 10 mL/ 瓶。
【文檔編號】C12R1/94GK103555859SQ201310548333
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優先權日:2013年11月7日
【發明者】高三基, 付衛林, 肖勝華, 劉營航, 陳復資, 陳如凱, 傅華英 申請人:福建農林大學