耐高溫醋酸菌及其發酵生產醋酸的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株耐高溫的巴氏醋桿菌及其發酵生產醋酸的應用，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號為CGMCC?No.8189。本發明的醋桿菌能夠在25-45℃下生長和產酸，利用該菌株以乙醇為主要原料進行液態深層發酵生產醋酸，發酵過程溫度和通氣量控制分為三個階段，發酵結束所得醋酸濃度可達60-180g/L，乙醇轉酸率達到85%-101%。本發明利用耐高溫的醋酸菌進行醋酸發酵生產，采用較高的發酵溫度，節省了冷卻用電和冷卻用水的消耗，同時具有較高的生產效率，降低了生產成本。該耐高溫醋酸菌及其發酵工藝適用于糧食醋、果醋等多種食醋的發酵生產。
【專利說明】耐高溫醋酸菌及其發酵生產醋酸的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株耐高溫醋酸菌，還涉及利用該菌株以乙醇為底物發酵生產醋酸的應用，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]醋酸是一種重要的工業原料，在食品、醫藥、化工等領域具有廣泛的應用。食用醋酸一般利用微生物發酵法進行生產。
[0003]醋酸菌(Acetic acid bacteria)是醋酸發酵的主要工業用菌,能夠將乙醇氧化成醋酸。常見的有醋桿菌屬葡萄糖桿菌屬以及葡萄糖酸桿菌屬(Gluconacetobacter)等,其中醋桿菌屬和葡萄糖桿菌屬的醋酸菌由于具有較高的乙醇氧化能力，常用于醋酸的液態純種發酵生產。
[0004]醋酸發酵需要在適宜的條件下進行才能獲得較高的生產效率。通常，醋酸發酵最適溫度為30-32 V，發酵溫度過高，醋酸菌易老化，甚至造成醋酸菌死亡，導致醋酸發酵速率降低。由于醋酸發酵伴隨著菌體的生長代謝，發酵過程產生大量的熱，發酵液溫度會逐漸升高，需要利用冷卻裝置對發酵罐進行降溫、控溫，以保證醋酸發酵的正常進行。多數國家和地區夏季溫度較高，眾多食醋生產企業在高溫季節都會產生更多的降溫成本，如果發酵溫度控制不當會影響發酵效率，甚至造成減產、停產等。據測算，如果發酵溫度能夠由30°C提高到37 °C，發酵冷卻成本可以降低約50%。醋酸發酵溫度的控制一方面要適合菌體生長，另一方面要控制最佳的發酵溫度以獲得較高的醋酸生成速率，因此，選育耐高溫醋酸菌，在較高的溫度下進行醋酸發酵生產對食醋釀造工業具有重要的現實意義。
[0005]從自然界中篩選和誘變選育是最常用的菌種選育方法。孫文瑛等篩選到一株具有耐高溫(36 °C)高乙醇(11%)的醋酸菌，經優化后其醋酸產量達到48.6 g/L，產酸量較低(孫文瑛，陳雄，王志，等.耐高溫高醇醋酸菌的篩選及其發酵工藝的初步優化，中國釀造，2011，1，44-47) 。邵建寧等通過紫外線、硫酸二乙酯逐級誘變選育得到了兩株醋酸菌，在培養溫度40 °C，培養基乙醇濃度12% (v/v)條件下發酵，酒精轉化率分別達到70%和75%，但產酸速率和原料利用率較低，不能滿足工業生產要求(邵建寧，王秉峰，路等學，等.耐高溫高酒度醋酸菌選育研究.甘肅科學學報，2005，17 (4):12-14)。本發明利用從山西老陳醋醋醅中篩選得到的具有耐高溫特點的巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189，根據其生長和發酵特性，將醋酸發酵過程中溫度和通氣量控制分為前期、中期、后期三個階段，前期控制發酵溫度為菌體最適生長溫度，能夠在較短時間內獲得較高的菌體濃度；中期控制發酵溫度為菌體最適產酸溫度，能夠保證較高的醋酸生成速率；后期適當降低發酵溫度保證殘醇的消耗，防止醋酸過氧化。利用該耐高溫醋酸菌及其發酵工藝發酵所得醋酸濃度可達60-180 g/L,酒精轉化率達到85%以上，具有極高的工業應用價值。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題之一是提供一株耐高溫的醋酸發酵菌株，為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案:
本發明一方面涉及醋酸菌，所述的醋酸菌為保藏編號為CGMCC N0.8189的巴氏醋桿菌或者其傳代物。
[0007]在本發明的一個方面，所述的醋酸菌主要特征如下:在固體培養基上，該菌菌落較小，顏色呈乳白色，表面光滑、濕潤，粘稠，邊緣較整齊；在顯微鏡下觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，易串聯生長；該菌株能夠在25-45 °C下生長和產酸，可以以乙醇為底物發酵生產醋酸。
[0008]本發明另一方面還涉及上述醋酸菌在發酵制備醋酸中的應用。
[0009]在本發明的一個優選實施方式中，所述的發酵底物為乙醇或者含有乙醇的酒。
[0010]在本發明的一個優選實施方式中，所述的發酵過程分為三個階段，第一階段發酵溫度為30-37 °C，優選為32-35 °C，每分鐘通氣量為1:0.05-0.1 v/v (液體與氣體的體積比)；第二階段發酵溫度為30-45 °C，優選為35 °C或以上，進一步優選為35-38 °C，每分鐘通氣量為1:0.08-0.2 v/v (液體與氣體的體積比);第三階段發酵溫度為25-35 °C，優選為28-30 °C，每分鐘通氣量為1:0.06-0.12 v/v (液體與氣體的體積比)。
[0011]在本發明的一個優選實施方式中，所述的發酵包括如下步驟:
(I)一級種子培養:利用250-1000 mL的搖瓶，裝有種子培養基30-100 mL，接入巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189進行搖瓶培養，搖床轉速為100-300轉/分鐘，溫度為33-42 V，培養時間為20-30小時。
[0012]一級種子培養基組成為:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇4-9% (v/v)，醋酸5-10 g/L, MgSO4 0.2 g/L, CaCl2 0.3 g/L。
[0013](2)二級種子培養:利用50-1000 L發酵罐進行二級種子培養，接種量為5%-15%(體積比)。溫度為33-40 °C，培養時間為20-30小時。
[0014]二級種子培養基組成為:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇5-9% (v/v)，醋酸0-15 g/L, MgSO4 0.1 g/L, CaCl2 0.2 g/L。
[0015](3)醋酸發酵:在發酵罐中進行，發酵罐接種量為5%-30% (v/v)，發酵過程分為三個階段，第一階段(前期)發酵溫度為30-37 °C，每分鐘通氣量為1:0.05-0.1 v/v (液體與氣體的體積比)；第二階段(中期)發酵溫度為30-45 °C，每分鐘通氣量為1:0.08-0.2v/v (液體與氣體的體積比)；第三階段(后期)發酵溫度為25-35 °C，每分鐘通氣量為1:
0.06-0.12 v/v (液體與氣體的體積比)。發酵方式可以是分批發酵、補料分批發酵或分割發酵。
[0016]發酵培養基組成為:葡萄糖20-35 g/L，酵母膏15-25 g/L，乙醇7-14% (v/v)，醋酸0-10 g/L,MgSO4 0.1 g/L, CaCl2 0.2 g/L。還可以直接利用以水果為主要原料經酒精發酵獲得的果酒進行果醋發酵。
[0017]分批發酵時間48-120小時，發酵結束醋酸濃度可達到60-150 g/L，乙醇轉酸率達到85%以上。
[0018]補料分批發酵過程中連續補加乙醇，控制發酵液中乙醇濃度為10-40 g/L，發酵結束醋酸濃度可達到60- 180 g/L，發酵時間50- 150小時，乙醇轉酸率達到85%以上。
[0019]分割發酵每次取出發酵液20% -50% (體積比)，補充同體積的新鮮發酵培養基，發酵結束醋酸濃度可達到60-150 g/L， 發酵時間24-100小時，乙醇轉酸率達到85%以上。[0020]本發明的特點與優點在于:
(I)利用該菌株在較高溫度下進行醋酸發酵生產，與30°C條件下發酵相比，可降低發酵冷卻費用，促進企業節能減排，在降低生產成本上的具有較大優勢。
[0021](2)較高的發酵溫度能提高醋酸的生成速率。利用該菌株進行醋酸發酵具有發酵速率快、乙醇轉化率高等優點，可以顯著提高生產效率和原料利用率，提高企業效益。
【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為45 °C條件下耐高溫醋酸菌在固體培養基上產生的透明圈。
[0022]圖2為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189和醋酸菌ASl.41在37 °C條件下進行醋酸發酵的比較。
[0023]圖3為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189以酒精為原料分批發酵生產醋酸的過程曲線。
[0024]圖4為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189以蘋果酒為原料分批發酵生產蘋果醋的過程曲線。
[0025]圖5為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189以蘋果酒為原料分割發酵生產蘋果醋的過程曲線。
[0026]微生物信息
巴氏醋桿菌de tobac ter pas teuri ) CP-A13,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8189，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期2013年09月16日。
【具體實施方式】
[0027]實施例1耐高溫醋酸發酵菌株的獲得 (I)微生物富集培養
取山西老陳醋醋酸發酵進行到第3-6天的醋醅樣品1-3 g，取樣位置距醋醅表層15 cm處，加入到裝有100 mL富集培養基的搖瓶中，在搖床轉數180轉/分鐘，42 °C條件下富集培養36小時。
[0028]富集培養基組成:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇4% (v/v)，醋酸5 g/L。
[0029](2)連續高溫高濃度乙醇馴化培養
將上述步驟(1)獲得的發酵液轉按10% (v/v)的接種量轉接入裝有100 mL馴化培養基的搖瓶中，在搖床轉數180轉/分鐘，42 °C條件下馴化培養，36小時后轉接入新鮮的馴
化培養基中。
[0030]馴化培養基組成為:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇7%-12% (v/v)，醋酸15-30 g/L, MgSO4 0.2 g/L, CaCl2 0.3 g/L。
[0031](3)重復步驟(2) 5-10 次。
[0032](4)取100 UL (3)所得發酵液，均勻涂布于選擇性固體培養基表面，在45 °C條件下培養，獲得能夠耐受高溫的醋酸發酵菌株。
[0033]選擇性固體培養基組成為:葡萄糖30 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，乙醇12% (v/v), CaCO3 5 g/L，瓊脂 25 g/L。
[0034]圖1為45 °C條件下耐高溫醋酸菌在固體培養基上產生的透明圈。[0035]實施例2巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189和醋酸菌ASl.41醋酸發酵性能的比較
(I)制備種子液
分別從斜面取巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189和醋酸菌ASl.41接種于種子培養基中，在37 °C，160轉/分鐘條件下搖床培養24小時，按10% (v/v)的接種量轉接入新鮮的種子培
養基中進行放大培養。
[0036]種子培養基組成:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L,乙醇3.5% (v/v)。
[0037](2)醋酸發酵
按10% (v/v)的接種量，將(I)中獲得巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189和醋酸菌ASl.41種子液分別接種至發酵罐中進行醋酸發酵。發酵過程中控制發酵溫度為37 °C，通風量為1: 0.1 (v/v) /min0
[0038]發酵培養基組成為:葡萄糖30 g/L，酵母膏20 g/L，乙醇7% (v/v)，醋酸10 g/L, MgSO4 0.1 g/L, CaCl2 0.2 g/L。
[0039]利用巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189發酵62 h，醋酸終濃度為72 g/L，初始醋酸濃度10 g/L，則乙醇轉酸率為88.6 %，平均產酸速率約為I g/ (L*h)。
[0040]利用醋酸菌ASl.41發酵100 h，醋酸終濃度為52 g/L，初始醋酸濃度10 g/L，則乙醇轉酸率為60 %，平均 產酸速率約為0.42 g/ (L ? h)。
[0041]圖2為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189和醋酸菌ASl.41在37 °C條件下進行醋酸發酵的比較。
[0042]實施例3利用巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189分批發酵生產醋酸
(I)制備種子液
從斜面取巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189接種于種子培養基中，在37 1:，160轉/分鐘條件下搖床培養25小時。按10% (v/v)的接種量轉接入新鮮的種子培養基中進行放大培養。
[0043]種子培養基組成:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L,乙醇3.5% (v/v)。
[0044](2)醋酸發酵
按12% (v/v)的接種量，將(I)中獲得種子液接種至發酵罐中進行醋酸發酵。
[0045]發酵培養基組成為:葡萄糖30 g/L，酵母膏20 g/L，乙醇8% (v/v)，醋酸3 g/L,MgSO4 0.1 g/L, CaCl2 0.2 g/L。
[0046]發酵過程中控制發酵溫度為:前期(持續20小時)33 °C，中期(持續38小時)37°C，后期30 V (持續4小時)；通風量:前期1: 0.07 (v/v)/min，中期1: 0.11 (v/v)/min，后期 1: 0.08 (v/v)/min。
[0047]發酵62 h結束，醋酸終濃度在74 g/L，初始醋酸濃度3 g/L，則乙醇轉酸率為88.8%，平均產酸速率約為1.15 g/ (L ? h)。
[0048]圖3為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189以酒精為原料分批發酵生產醋酸的過程曲線。
[0049]實施例4利用巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189分批發酵生產蘋果醋
(I)制備種子液
從斜面取巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189接種于種子培養基中，在35 1:，180轉/分鐘條件下搖床培養24小時。按10% (v/v)的接種量轉接入新鮮的種子培養基中進行放大培養。
[0050]種子培養基組成:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L,乙醇3.5% (v/v)。
[0051](2)蘋果醋發酵按10% (v/v)的接種量，將(I)中獲得種子液接種至發酵罐中，以蘋果酒為原料發酵生產蘋果醋。
[0052] 蘋果酒中乙醇含量為8% (v/v)。
[0053]發酵過程中控制發酵溫度為:前期(持續24小時)32 °C，中期(持續36小時)35°C，后期28 V (持續4小時)；通風量:前期1: 0.08 (v/v)/min，中期1: 0.12 (v/v)/min,后期 1: 0.1 (v/v)/min。
[0054]發酵64 h結束，醋酸終濃度為75 g/L,平均產酸速率1.17 g/ (L ? h)，乙醇轉酸率約為93 %。
[0055]圖4為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189以蘋果酒為原料分批發酵生產蘋果醋的過程曲線。
[0056]實施例5利用巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189分割發酵生產蘋果醋
(I)制備種子液
從斜面取巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189接種于種子培養基中，在35 1:，160轉/分鐘條件下搖床培養28小時。按10% (v/v)的接種量轉接入新鮮的種子培養基中進行放大培養。
[0057]種子培養基組成:葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L,乙醇3.5% (v/v)。
[0058](2)起始蘋果醋發酵
按15% (v/v)的接種量，將(I)中獲得種子液接種至發酵罐中，在35 °C條件下以蘋果酒為原料進行發酵。蘋果酒乙醇含量為8% (v/v)。發酵過程中控制發酵溫度為35 °C。
[0059](3)蘋果醋分割發酵
步驟(2)發酵60 h后取出30% (體積比)的發酵液，補充同體積的新鮮蘋果酒，進行分割發酵，發酵過程控制發酵溫度為:前期(持續6小時)35 °C;中期(持續12小時)37 °C，后期 35 °C (持續 4 小時)；通風量:前期 1: 0.1 (v/v)/min,中期 1: 0.13 (v/v)/min,后期 1: 0.1 (v/v) /min。
[0060]發酵24小時后重復步驟(3)進行下一次分割發酵，每次獲得蘋果醋中醋酸濃度可達到75 g/L,乙醇轉酸率達到93%以上。
[0061]圖5為巴氏醋桿菌CGMCC N0.8189以蘋果酒為原料分割發酵生產蘋果醋的過程曲線。
[0062]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書所限定的保護范圍為準。
【權利要求】
1.醋酸菌，所述的醋酸菌為保藏編號為CGMCCN0.8189的巴氏醋桿菌或者其傳代物。
2.根據權利要求1所述的醋酸菌，所述的醋酸菌主要特征如下:在固體培養基上，該菌菌落較小，顏色呈乳白色，表面光滑、濕潤，粘稠，邊緣較整齊；在顯微鏡下觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，易串聯生長；該菌株能夠在25-45 °C下生長和產酸，可以以乙醇為底物發酵生產醋酸。
3.權利要求1或2所述的醋酸菌在發酵制備醋酸中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，所述的發酵底物為乙醇或者含有乙醇的酒，優選的，所述發酵底物乙醇可用糧食或者水果為原料進行酒精發酵獲得，如玉米、大米、糯米、高粱、山楂、草莓、荔枝、西瓜、蘋果、梨或者大棗。
5.根據權利要求4所述的應用，所述的發酵過程溫度和通氣量控制分為三階段，第一階段發酵溫度為30-37 °C，優選為32-35 °C，每分鐘通氣量為1:0.05-0.1 v/v (液體與氣體的體積比)；第二階段發酵溫度為30-45 °C，優選為35 °C或以上，進一步優選為35-38°C，每分鐘通氣量為1:0.08-0.2 v/v (液體與氣體的體積比)；第三階段發酵溫度為25-35°C，優選為28-30 °C，每分鐘`通氣量為1:0.06-0.12 v/v (液體與氣體的體積比)。
【文檔編號】C12P7/54GK103614318SQ201310549668
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】熊賢平, 王敏, 鄭宇 , 申雁冰, 韓玥 申請人:天地壹號飲料股份有限公司