鹽穗木金屬硫蛋白基因及其重組蛋白與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開鹽穗木金屬硫蛋白基因及其重組蛋白與應用。所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因具有如序列表SEQ?I?D?NO.1所示的堿基序列，全長為234bp，其編碼由序列表中序列表SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列中78個氨基酸組成的蛋白質。本發明還公開了含有該基因的重組表達載體和表達轉化體，以及鹽穗木金屬硫蛋白的制備方法和應用。本發明從新疆鹽堿植物鹽穗木體內克隆獲得新的金屬硫蛋白基因，通過基因工程表達轉化體生產獲得的重組金屬硫蛋白，含有14個半胱氨酸，不形成二硫鍵，豐富的巰基能螯合鋅、銅、鎘等重金屬、清除自由基、抵抗電離輻射或紫外線照射，具有廣泛的應用領域。
【專利說明】鹽穗木金屬硫蛋白基因及其重組蛋白與應用
發明領域
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】。具體的說，本發明涉及一種鹽穗木金屬硫蛋白及其基因，以及含有該基因的重組表達載體、重組表達轉化體，以及一種重組鹽穗木金屬硫蛋白及其制備及應用【技術領域】。【背景技術】
[0002]金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一類廣泛存在于生物體內的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白。與其結合的金屬主要是鎘、銅和鋅，廣泛地存在于從微生物到人類各種生物中，其結構高度保守。1957年Margoshes和Valles在研究鎘的生物學作用時，從蓄積鎘的馬腎中首次分離出該物質。MT具有以下幾個特征:分子量低，一般為6~7kD;能螯合金屬離子，蛋白通過硫酯鍵與金屬結合后，具有特殊的光吸收特征；半胱氨酸含量高，約占氨基酸殘基總數的23 %~33 %，但不形成二硫鍵，分子中缺乏芳香族氨基酸和組氨酸；半胱氨酸殘基在氨基酸序列中具有較為保守的排列方式。金屬硫蛋白豐富的巰基含量及重金屬結合能力決定了其功能的多樣性。
[0003]近年來,對MT的研究和應用已經涉及到醫藥、農業、食品保健及化妝品添加劑、生物工程、環境保護等諸多領域，前景十分廣闊。目前的研究證實了金屬硫蛋白具有重金屬解毒功能、清除自由基、抗輻射和紫外線照射、參與體內微量元素的代謝、防止細胞癌變以及環保作用。隨著對金屬硫蛋白結構、功能等研究的深入，其用途日益擴大，對其需求量也越來越大。目前國內生產MT的廠家，主要從兔肝中提取，由于MT原料需求特別，且生產工藝復雜，導致目前MT產量不大且價格昂貴。所以迄今為止一直缺乏一種高產量、低成本、安全性高、適宜于規模化生產MT的技術和方法。
[0004]綜上所述，克隆金屬硫蛋白基因，利用基因工程方法生產金屬硫蛋白是降低生產成本的一條有效途徑，及對其在醫藥、食品保健及化妝品等領域的應用具有重要的意義。
[0005]鹽穗木(Halostachys caspica)為藜科鹽穗木屬，是生長在荒漠、半荒漠鹽堿地上的重要鹽生、旱生稀鹽多汁半灌木植物，對鹽分適應性極強，是鹽土荒漠主要植物之一。在高鹽和重金屬脅迫下，其體內的金屬硫蛋白基因表達水平呈明顯上升趨勢。目前還沒有鹽穗木金屬硫蛋白及其基因的報道。

【發明內容】

[0006]針對天然金屬硫蛋白含量少，傳統生產工藝復雜、提取得率低的現狀，本發明提供一種新的鹽穗木金屬硫蛋白及其基因，含有該基因的重組表達載體、轉化體，以及重組鹽穗木金屬硫蛋白及其制備方法和應用。
[0007]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一:提供一種鹽穗木金屬硫蛋白基因，所述的鹽糖木金屬硫蛋白基因具有如序列表SEQ ID N0.1所不的喊基序列，全長為234bp，其編碼由序列表中序列表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列中78個氨基酸組成的蛋白質，富含半胱氨酸。[0008]本發明技術方案之二:提供一種鹽穗木金屬硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQID N0.2所示，來源于新疆鹽生植物鹽穗木的金屬硫蛋白。
[0009]進一步，本發明提供鹽穗木金屬硫蛋白基因的獲得方法，通過提取鹽處理的鹽穗木總RNA，反轉錄cDNA，PCR擴增獲得，其具體包括如下步驟:
[0010](I)根據鹽穗木鹽抑制差減文庫中Hc6fl2的EST (GenBank登錄號HS586469.1)序列的反向互補序列，設計引物用于擴增鹽穗木金屬硫蛋白基因的開放讀碼框；引物中分別引入EcoRI和XhoI酶切位點。
[0011](2)取300mM NaCl處理的鹽穗木同化枝，應用RNAsimple Total RNA Kit提取總RNA ；以Oligo (dT)為引物，按TaKaRa M-MLV操作說明合成cDNA的第一鏈，以該cDNA第一鏈產物為模板進行RT-PCR反應，反應程序:94°C 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，30個循環；將PCR產物，連接到克隆載體PMD18-T上，轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑取陽性單菌落進行菌液PCR和雙酶切鑒定并測序，得到如序列表中SEQ I D N0.1所示的帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA的基因全長序列。 [0012]根據本發明，所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因全長為234bp，起始密碼子為ATGj*止密碼子為TGA ;該序列無內含子，具有完整的開放閱讀框，編碼78個氨基酸；編碼產物，SP本發明鹽穗木金屬硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQ I D N0.2所示；分子量為7.7kD，等電點為4.78 ;含14個半胱氨酸和15個甘氨酸。
[0013]本發明鹽穗木金屬硫蛋白基因也可以是編碼由序列表中SEQ I D N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的其它任何核苷酸序列。而本發明鹽穗木金屬硫蛋白不僅限于序列表中SEQ I D N0.2所示的氨基酸序列，還可以是SEQ I D N0.2所示的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基且具有相同的金屬硫蛋白活性的由序列2衍生的蛋白質的核苷酸序列。
[0014]本發明技術方案之三:提供一種重組表達載體，包含上述的本發明的鹽穗木金屬硫蛋白基因的核苷酸序列；該重組表達載體的載體骨架優選原核表達載體，更優選pET_32a(+)。
[0015]本發明技術方案之四:提供一種重組表達轉化體，包含上述的任何一種本發明的核苷酸序列或重組表達載體；該重組表達轉化體優選細菌，更優選大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。
[0016]本發明技術方案之五:提供一種重組鹽穗木金屬硫蛋白的制備方法，培養誘導上述本發明的重組轉化體，獲得重組的鹽穗木金屬硫蛋白:具體通過將提取的質粒pET32a-HcMT5 u L轉化感受態細胞E.coli BL21，氨芐青霉素篩選獲得陽性克隆；將含重組質粒的陽性克隆在37°C培養過夜，再以1%比例接種，37°C培養2~3h，當菌液的吸光度值A600達到0.6時，加入IPTG至終濃度0.5M，于37°C誘導6h ;取培養液1.5mL, 12000rpm離心3min,收集沉淀，沉淀用pH7.4的50 y L PBS重懸，然后加入等體積的SDS緩沖液振蕩后，置沸水浴中5min, 12000rpm離心IOmin,采用SDS-PAGE電泳檢測結果,證實獲得純化的重組鹽糖木金屬硫蛋白。
[0017]本發明的大腸桿菌E.coliBL21(DE3)重組表達轉化體經IPTG誘導后表達出約25kD的目的融合蛋白，證實了本發明的鹽穗木金屬硫蛋白基因是一個具有表達功能的基因。[0018]本發明技術方案之六:提供上述方法所制備而得的重組鹽穗木金屬硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。獲得的重組鹽穗木金屬硫蛋白屬于I I型金屬硫蛋白，其所編碼的鹽穗木金屬硫蛋白成熟肽為78個氨基酸，分子量為7.7kD，等電點為4.78，含14個半胱氨酸和15個甘氨酸。
[0019]具體的，制備的重組鹽穗木金屬硫蛋白的氨基酸序列:
[0020]MSCCGGNCGC GAGCKCGSGC GGCKMFPDFG ENTSNPTVL I SGVAPK I SYAEGSEMGVAVENDGCKCGPNC QCNPCTCK
[0021]本發明技術方案之七:提供所述的重組鹽穗木金屬硫蛋白在制備重金屬螯合解毒劑、食品保健營養素、化妝品添加劑中的應用。[0022]通過實施本發明具體的
【發明內容】
，可以達到以下有益效果:
[0023](I)本發明提供一種鹽穗木金屬硫蛋白基因及其重組蛋白，源于新疆鹽生植物鹽穗木，根據鹽穗木鹽抑制差減文庫中Hc6fl2的EST序列的反向互補序列，設計引物用于擴增鹽穗木金屬硫蛋白基因的開放讀碼框；引物中分別引入EcoRI和XhoI酶切位點，提取總RNA,將PCR產物，連接到克隆載體pMD18-T上，轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑取陽性單菌落進行菌液PCR和雙酶切鑒定并測序，得到如序列表中SEQ I D N0.1所示的帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA的基因全長序列；所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因全長為234bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA ;該序列無內含子，具有完整的開放閱讀框，編碼78個氨基酸；獲得編碼產物，即本發明鹽穗木金屬硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQI DN0.2所示；分子量為7.7kD，等電點為4.78 ;含14個半胱氨酸和15個甘氨酸。
[0024](2)本發明提供的重組鹽穗木金屬硫蛋白基因轉化體能耐受和富集重金屬，重組鹽穗木金屬硫蛋白能清除羥自由基，具有明顯的量效關系，并能有效地清除氧自由基。重組鹽穗木金屬硫蛋白在制備重金屬螯合解毒劑、化妝品添加劑、食品保健營養素等方面中具有廣泛的應用前景；針對天然金屬硫蛋白含量少，傳統生產工藝復雜、提取得率低的現狀，本發明提供的重組金屬硫蛋白體現出廣闊的應用領域和深遠的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1所示為鹽穗木總RNA的提取圖。
[0026]圖2所示為鹽穗木HcMT基因的克隆圖。圖中，M是標準核酸分子量MarkerDLlOOOO ；泳道I是大約234bp大小的基因片段。
[0027]圖3所示為重組鹽穗木金屬硫蛋白的表達與純化圖。圖中，M是標準蛋白質分子量marker ;泳道I是含有質粒pET32a_HcMT沒有誘導的重組轉化體；泳道2是0.3mM IPTG誘導的含有質粒pET32a-HcMT重組轉化體表達產物；泳道3是純化后的穿過液；泳道4是純化的重組鹽穗木金屬硫蛋白。
[0028]圖4所示為重組轉化體對重金屬的耐受圖。圖中，A為含有鹽穗木金屬硫蛋白基因的重組轉化體能耐受Cu的脅迫情況圖，B為含有鹽穗木金屬硫蛋白基因的重組轉化體能耐受Zn的脅迫情況圖。
[0029]圖5所示為重組鹽穗木金屬硫蛋白清除羥自由基的效果圖。
[0030]圖6所示為重組鹽穗木金屬硫蛋白清除氧自由基的效果圖。【具體實施方式】
[0031] 下面，用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不限于下述的實施例。
[0032]本發明中涉及到的主要原輔材料和設備有:
[0033]主要試劑:本發明中選用的所有材料、試劑都為本領域熟知選用的。包括Taq酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、DNA Marker、蛋白質Marker、蛋白胨、酵母浸出粉、丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、異丙基-P-D-硫代半乳糖苷、Trizol試劑、Oligo dT-Adaptor引物、RNase 抑制劑、RNase M-MLV (RNase H_)、TIANGEN 公司的 RNAsimple Total RNA Kit、Oligo (dT)、TaKaRa M-MLV、大腸桿菌 DH5a 等。
[0034]主要儀器:PCR儀、高壓滅菌鍋、氣浴恒溫振蕩器、電子天平、微波爐、超純水儀、超凈工作臺、恒溫培養箱、熱空氣消毒柜、臺式冷凍離心機、電泳儀、凝膠成像儀等。
[0035]本發明中選用的所有材料、試劑和儀器都為本領域熟知選用的，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0036]實施例一:鹽糖木金屬硫蛋白基因的克隆
[0037]1.鹽穗木總RNA的提取
[0038]操作前實驗臺用紫外燈照射30min后，稱取300mM NaCl預處理的0.1g鹽穗木同化枝，放入無RNA酶的研缽中液氮研磨,粉末移入裝有ImLTrizol試劑的Eppendorf管中，蓋緊蓋激烈震蕩15s，15~30°C室溫放置3~5min，4°C、12000r/min離心20min，小心的將上清移入干凈Eppendorf管中，加入氯仿0.2mL抽提蛋白質,震蕩15s,室溫放置3~5min,4°C、12000rpm離心lOmin，溶液分成上、中、下三層，其中無色上層即為含RNA層。將此層移入潔凈的1.5mL的Eppendorf管中，加入異丙醇0.5mL, 15~30°C室溫放置lOmin, 4°C、12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀部分加入70%乙醇溶液(無RNA酶水配置)lmL，洗滌，4°C>7500r/min離心5min。棄上清，待沉淀干燥后，加入無RNA酶水，輕輕混勻，使其充分溶解，A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果參見附圖1，其余_80°C冰箱保存。
[0039]2.反轉錄合成cDNA
[0040]EP管中配制下列模板RNA/引物混合液:10 ii L總RNA, 10 U L OligodT-Adaptor弓丨物，31.5 ii L無RNase的水，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷2min以上。離心數秒使模板RNA/引物的變性液聚集于管底。再加入51.5 ii L上述RNA/引物變性溶液，20 u L5 XM-MLV緩沖液，20 u L dNTP, 2.5u L RNase 抑制劑，6 u L RNase M-MLV (RNase H-)。42°C 保溫 Ih,70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷2min以上。
[0041]3.PCR擴增鹽穗木金屬硫蛋白基因(HcMT)
[0042]以上述合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶EcoRI和XhoI位點，PCR擴增鹽穗木金屬硫蛋白基因(HcMT)。
[0043]上游引物Fl:CCGGAATTCATGTCTTGCTGTGGTGG
[0044]下游引物Rl:CCGCTCGAGTCATTTGCAGGTGCAAGGG
[0045]PCR 反應體系:13.9 ii L dd H2O, 2 ii LlO X Taq 緩沖液，1.6 ii L dNTPs, 0.6 U LMg2+,
0.4u L Primer (Fl) ,0.4u L Primer (F2), I U L cDNAoPCR反應程序:94°C預變性5min，94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 30個循環。最后72°C溫育IOmin0
[0046]4.PCR產物的電泳檢測及序列分析
[0047]取5 ii LPCR擴增產物加6 X Loading Buffer，在1%瓊脂糖凝膠進行電泳，結果參見附圖2，M是標準核酸分子量Marker DL10000 ;泳道I是大約234bp大小的基因片段。采用PCR產物回收試劑盒TIANquick Mini Purification Kit回收PCR產物，連接T載體，進行測序分析結果證明約234bp大小的基因片段是鹽穗木金屬硫蛋白基因(HcMT)的開放閱讀框序列。
[0048]5.原核表達載體的構建
[0049]將回收的PCR產物HcMT基因與表達載體pET32a分別進行雙酶切，輕彈管壁，混勻并離心，37°C酶切6小時。
[0050]在一微量離心管中分別依次加入下列試劑:
[0051]
【權利要求】
1.一種鹽穗木金屬硫蛋白基因，其特征在于，所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因具有如序列表SEQ ID N0.1所不的喊基序列，其編碼氣基酸序列如表SEQ IDN0.2所不。
2.一種鹽穗木金屬硫蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ I D N0.2所示。
3.—種重組表達載體，其特征在于，包含權利要求1所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，該重組表達載體的載體骨架優選pET-32a(+)原核表達載體。
5.一種重組表達轉化體，其特征在于，包含權利要求1所述的核苷酸序列或權利要求3~4任一項所述的重組表達載體。
6.根據權利要求5所述的重組表達轉化體，其特征在于，其為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。
7.—種重組鹽穗木金屬硫蛋白的制備方法，培養誘導權利要求5所述的重組表達轉化體，獲得重組的鹽穗木金屬硫蛋白，其特征在于，具體通過將提取的質粒pET32a-HcMT5 u L轉化感受態細胞E.coli BL21，氨芐青霉素篩選獲得陽性克隆；將含重組質粒的陽性克隆在37 °C培養過夜，再以I %比例接種，37 °C培養2~3h，當菌液的吸光度值慫㈨達到0.6時，加A IPTG至終濃度0.5M，于37°C誘導6h ;取培養液1.5mL, 12000rpm離心3min,收集沉淀，沉淀用PH7.4的50 ii L PBS重懸，然后加入等體積的SDS緩沖液振蕩后，置沸水浴中5min，12000rpm離心IOmin,采用SDS-PAGE電泳檢測結果,證實獲得純化的重組鹽穗木金屬硫蛋白。
8.—種如權利要求1-3 任一項所述的重組鹽穗木金屬硫蛋白在制備重金屬螯合解毒劑中的應用。
9.一種如權利要求1-3任一項所述的重組鹽穗木金屬硫蛋白在制備食品保健營養素中的應用。
10.一種權利要求1-3任一項所述的重組鹽穗木金屬硫蛋白在制備化妝品添加劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103614386SQ201310566742
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】劉忠淵, 哈斯亞提汗·阿布都拉, 孟紅恩, 張富春 申請人:新疆大學