一種烯醇脫氫酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種烯醇脫氫酶及其編碼基因，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應用。所述烯醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼基因如SEQ?ID?No.2所示。本發明提供了一種來源于約克氏菌WZY002（Yokenella?sp.WZY002）的烯醇脫氫酶基因核苷酸序列；該烯醇脫氫酶基因可與表達載體連接構建得到含該基因的胞內表達重組質粒，再轉化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌；該重組大腸桿菌經細胞破碎，分離純化獲得重組烯醇脫氫酶；該重組烯醇脫氫酶具有還原烯醛、烯酮、芳香醛和芳香酮等底物生成對應的醇的能力；利用重組大腸桿菌或重組烯醇脫氫酶為生物催化劑同時催化醇的氧化和醛的還原，可以生成巴豆醛、苯甲醇、橙花醇和香葉醇。
【專利說明】一種烯醇脫氫酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種烯醇脫氫酶及其編碼基因，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應用。
(二)【背景技術】
[0002]a, (6-不飽和化合物如烯醇、烯醛和烯酮等在化學工業的許多領域中具有重要應用，常用于生產精細化學品、藥物和香精香料等。目前，a，(6-不飽和烯醇通常是利用化學催化劑對烯醛或烯酮進行選擇性加氫而制備?；瘜W法還原a，3-不飽和烯醛或烯酮制備烯醇往往選擇性較低，并且伴隨著副產物飽和醇的生成。作為化學法的替代，生物催化法制備a，3 -不飽和烯醇具有高效、經濟、選擇性高、條件溫和等優點，已越來越受研究者所重視。與化學催化劑只能催化還原反應不同，生物催化劑既可以用于a，(6-不飽和烯醛或烯酮的選擇性加氫，也可以用于a，(6-不飽和烯醇的選擇性氧化制備烯醛或烯酮。
[0003]用于生物法制備a，0 -不飽和烯醇的生物催化劑既可以是整細胞，也可以是酶。因為細胞內含有多種酶，整細胞催化往往會遇到副反應的問題，副反應的存在會降低目標反應產物的得率。對于像烯醛還原生成烯醇這種一步反應來說，酶法催化更具優勢，既可以徹底避免副反應的問題，也可以克服細胞膜阻礙底物和產物跨膜傳遞的問題。因而，通過基因工程技術高產烯醇脫氫酶，將為其在生物法制備a，(6-不飽和化合物中的應用奠定良好的基礎。
[0004]烯醇脫氫酶能夠催化烯醛或烯酮的還原生成烯醇，也能夠催化烯醇的氧化生成烯醛或烯酮。烯醇脫 氫酶屬于含鋅中鏈醇脫氫酶家族，以NAD (P) H為輔酶，一般來說都具有芐醇脫氫酶的活力。目前，已從微生物中發現多種烯醇脫氫酶，如醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。這些野生菌中烯醇脫氫酶含量極低，利用其作為生物催化劑進行大規模的工業化生產存在一定的難度，因而構建烯醇脫氫酶基因工程菌從而大量生產重組烯醇脫氫酶具有重要意義。
(三)
【發明內容】

[0005]本發明目的是提供一種烯醇脫氫酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉化得到的重組基因工程菌，及其在生物法制備a，(6-不飽和醇/醛中的應用。
[0006]本發明采用的技術方案是:
[0007]一種烯醇脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]SEQ ID N0.1:
[0009]MSIIKSYAAK EAGSELELYE YDAGELRPED VEVQVDYCGI
[0010]CHSDLSMIDN EffGFSQYPLV AGHEVIGRVA ALGSAAQEKG
[0011]VKVGQRVGVG WTARSCGHCD ACISGNQINC LEGAVATILN
[0012]RGGFAEKLRA DffQffVIPLPE SIDIESAGPL LCGGITVFKP[0013]LLMHHITATS RVGVIGIGGL GHIAIKLLHA MGCEVTAFSS
[0014]NPSKEQEVLA MGADKVVNSR DPDALNALAG QFDLIINTVN
[0015]VDLDffQPYFE ALAYGGHFHT VGAVMKPLPV PAFTLIAGDR
[0016]SISGSATGTP YELRKLMKFA GRSKVSPTTE LFPMSQINEA[0017]IQHVRDGKAR YRWLQADF。
[0018]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上、且具有相同的酶活性，均屬于本發明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0019]本發明所述蛋白的片段、衍生物或類似物是指基本上保持本發明所述的蛋白酶相同的生物學功能或活性的蛋白，可以是下列情形:(I ) 一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；(II) 一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代；(III)成熟蛋白與另一種化合物(比如延長蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合進成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用來純化此蛋白的序列或蛋白原序列)。
[0020]所述蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是純天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如:細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的蛋白可以是糖基化的。本發明的蛋白還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0021]本發明還涉及所述烯醇脫氫酶的編碼基因。
[0022]具體的，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:
[0023]
【權利要求】
1.一種烯醇脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述烯醇脫氫酶的編碼基因。
3.權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.含有權利要求2或3所示編碼基因的重組載體。
5.一種用權利要求4所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。
6.權利要求2或3所述基因在制備重組烯醇脫氫酶中的應用。
7.權利要求1所述的烯醇脫氫酶在催化還原醛或酮制備相應的醇中的應用；所述的醛為下列之一:巴豆醛、反式2-己烯醛、2-甲基-2-戊烯醛、反式2-辛烯醛、反式2-癸烯醛、香葉醛、橙花醛或苯甲醛；所述的酮為下列之一:4-甲基-3-戊烯-2-酮、3-辛烯-2-酮、2-溴苯乙酮。
8.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述催化還原在pH5.5~9.5、20~70°C條件下進行。
9.權利要求1所述的烯醇脫氫酶在催化氧化巴豆醇制備巴豆醛中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述催化氧化在pH6.1~10.0,20~70°C條件下進行。
【文檔編號】C12P7/24GK103614349SQ201310578047
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年11月18日
【發明者】應向賢, 汪釗, 王一芳, 鄭建永, 章銀軍 申請人:浙江工業大學