本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及假單胞菌基因工程菌株及其構建方法，尤其是一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其構建方法。

背景技術：

我國常見的農作物病害生物達1600種，每年造成的損失約為1000億人民幣，嚴重地影響了我國農業(yè)的發(fā)展。近些年，化學農藥的大規(guī)模使用導致了病蟲害的抗藥性不斷增強。此外，高濃度和毒性的化學農藥的應用，對農田、水環(huán)境也造成了很大的污染，嚴重威脅著我國的糧食安全和生命健康。因此，低毒性、低殘留和不易產(chǎn)生抗藥性的生物農藥獲得了各國政府和農藥企業(yè)的極大關注。

與化學農藥相比，生物農藥具有毒性低、對環(huán)境友好和不易產(chǎn)生抗藥性等明顯優(yōu)勢，已經(jīng)吸引了越來越多學者的關注并逐漸應用到生物防治實踐當中。其中，上海交通大學彭華松課題組率先利用銅綠假單胞菌株M18開發(fā)出了具有廣譜、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和莖腐的生物農藥吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，簡稱PCA，CAS號為2538-68-3)，定名為“申嗪霉素”，主要用于防治水稻紋枯病、小麥赤霉病、黃瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并獲得了農業(yè)部頒發(fā)的新農藥藥證。

但最近相關研究發(fā)現(xiàn)，與PCA相比，另一種吩嗪類抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更好的安全性、穩(wěn)定性及對植物病原菌的抑菌活性，在防治水稻紋枯病和小麥赤霉病等方面具有重要的應用價值。據(jù)報道，目前能合成PCN的微生物菌株有綠針假單胞菌PCL1391，銅綠假單胞菌PAO1，PUPa3，PUP6，MML221等，但由于PCN產(chǎn)率較低，尚未能大規(guī)模推廣應用。上海交通大學彭華松課題組對篩選的一株綠針假單胞菌HT66進行基因工程改造后，PCN的產(chǎn)量已經(jīng)達到1800mg/L并申報了中國發(fā)明專利(CN201310566864.5)，但是該產(chǎn)量距離PCN的工業(yè)化應用還存在一定的距離。因此，通過基因工程技術進一步改造該菌株將有利于提高PCN產(chǎn)量，實現(xiàn)其農業(yè)應用。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其構建方法，克服現(xiàn)有菌株生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量和效率較低的缺陷，提供一種用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具體是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；

或者，敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA單突變株或者雙突變株基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；其中，所述單突變株為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA。

優(yōu)選地，所述lon基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，所述基因工程菌株為HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中，所述基因工程菌株HT66Δlon是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔparS是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的parS基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔlonΔparS是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因而得到基因工程菌株。

更優(yōu)選地，所述基因工程菌株為HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。

第二方面，本發(fā)明還涉及所述高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的構建方法，具體是：敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因中的一個基因或兩個基因，即可；

或者，敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA單突變株或者雙突變株基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；其中，所述單突變株為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA。

優(yōu)選地，所述lon基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，所述構建方法中，敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因中的一個基因的步驟具體包括：

i、擴增lon基因或parS基因片段的上下游同源臂；

ii、采用融合PCR法連接上下游同源臂并插入pK18mobsacB質粒中得lon基因或parS基因重組質粒；

iii、(a)使lon基因重組質粒上的lon基因上下游同源臂片段與HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因組中的lon基因發(fā)生同源重組；

或(b)使parS基因重組質粒上的parS基因上下游同源臂片段與HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基因組中的parS基因發(fā)生同源重組；

篩選陽性克隆，即得。

上述敲除中，所述pK18mobsacB質粒為假單胞菌和大腸桿菌的穿梭質粒。

第三方面，本發(fā)明提供一種基于所述基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法，具體包括如下步驟：將所述基因工程菌株的種子發(fā)酵液接種于KB發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，即可。

優(yōu)選地，所述種子發(fā)酵液的制備具體為：將所述基因工程菌株接種于KB培養(yǎng)基中，置于28℃、180轉/分下培養(yǎng)至OD600為0.5～2.0，即得。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的條件具體為：24～30℃、100～300轉/分鐘、24～72h。

優(yōu)選地，所述種子發(fā)酵液與所述KB發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為(1～10):100。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的具備如下有益效果：

本發(fā)明具體是以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)菌株，通過基因工程技術從HT66菌株基因組中分別或者同時敲除吩嗪合成過程中的lon、parS負調控基因，構建HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS號為550-89-0，簡稱PCN)的產(chǎn)量大幅提高，能夠更加有效由于生物防治。其中，基因工程菌株HT66ΔlonΔparS具有最佳效果。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為綠針假單胞菌HT66和lon敲除突變株中分別以內外部引物PCR擴增lon基因及其上下游片段的電泳圖；

其中，從左到右依次為marker，HT66Δlon，HT66，空白對照；

圖2為HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的生長曲線圖；

圖3為HT66HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖4為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；

圖5為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖6為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；

圖7為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖8為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；

圖9為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖10為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；

圖11為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖12為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生長曲線圖；

圖13為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖14為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；

圖15為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖16為HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖17為HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖18為HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的綠針假單胞菌(Pseudomonas choloraphis)HT66，該菌株已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏單位地址為：中國.武漢.武漢大學，郵編為：430072，保藏日期為：2013年10月12日，保藏編號為：CCTCC NO:M 2013467。

實施例1、lon基因體外突變體的構建

根據(jù)綠針假單胞菌HT66基因組中l(wèi)on基因及其上下游序列設計引物(見表1)：

表1

以該基因組DNA為模板，擴增基因組中的相應片段。

將上下游PCR產(chǎn)物通過融合PCR連接，并將融合PCR產(chǎn)物與pK18mobsacB載體分別使用EcoRI和XbaI酶切，過柱回收，使用T4連接酶連接，獲得體外突變質粒。

用體外突變質粒轉化大腸桿菌S17。將攜帶重組質粒的S17菌株充分活化，接種于含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃，180轉/分培養(yǎng)12h。將充分活化的HT66菌株接種于LB培養(yǎng)基中，28℃，180轉/分培養(yǎng)12h。5000轉/分收集并洗滌兩種菌體，LB培養(yǎng)基重懸并以HT66：S17濃度比為3:1的比例混合與EP管中，靜置1h；取混合菌液點在LB平板中，28℃培養(yǎng)24h；刮取長出來的混合菌落于LB中重懸，稀釋涂布于卡那霉素50mg/L，氨芐霉素100mg/L的LB平板上，28℃培養(yǎng)2～3d后挑取單克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培養(yǎng)1～2d；挑取蔗糖平板上的單克隆，分別點在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及無抗LB平板上，培養(yǎng)12～24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。PCR驗證HT66菌株的lon基因被敲除，并命名為HT66Δlon。

圖1為綠針假單胞菌HT66和lon敲除突變株中分別以內外部引物PCR擴增lon基因及其上下游片段的電泳圖；其中，M，Marker；Δ，lon基因敲除株HT66Δlon；WT，野生株HT66；N，空白對照組。左側引物為內部引物lon-F/lon-R，右側引物為外部引物lon-F1/lon-R2。內外部引物擴增結果表明，lon基因已被成功敲除。

實施例2、parS基因體外突變體的構建

根據(jù)綠針假單胞菌HT66基因組中parS及上下游序列設計引物(見表2)：

表2

以該基因組DNA為模板，擴增基因組中的相應片段。

將上下游PCR產(chǎn)物通過融合PCR連接，并將融合PCR產(chǎn)物與pK18mobsacB載體分別使用BamHI和HindIII酶切，過柱回收，使用T4連接酶連接，獲得體外突變質粒。

用所得體外突變質粒轉化大腸桿菌S17。將攜帶重組質粒的S17菌株充分活化，接種于含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃，180轉/分培養(yǎng)12h。將充分活化的HT66菌株接種于LB培養(yǎng)基中，28℃，180轉/分培養(yǎng)12h。5000轉/分收集并洗滌兩種菌體，LB培養(yǎng)基重懸并以HT66：S17濃度比為3:1的比例混合與EP管中，靜置1h；取混合菌液點在LB平板中，28℃培養(yǎng)24h；刮取長出來的混合菌落于LB中重懸，稀釋涂布于卡那霉素50mg/L，氨芐霉素100mg/L的LB平板上，28℃培養(yǎng)2～3d后挑取單克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培養(yǎng)1～2d；挑取蔗糖平板上的單克隆，分別點在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及無抗LB平板上，培養(yǎng)12～24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。PCR驗證HT66菌株的parS基因被敲除，并命名為HT66ΔparS。

實施例3、lon和parS雙突變株HT66ΔlonΔparS的構建

將攜帶parS重組質粒的S17菌株充分活化，接種于含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃，180轉/分培養(yǎng)12h。將充分活化的HT66Δlon菌株接種于LB培養(yǎng)基中，28℃，180轉/分培養(yǎng)12h。5000轉/分收集并洗滌兩種菌體，LB培養(yǎng)基重懸并以HT66Δlon：S17濃度比為3:1的比例混合與EP管中，靜置1h；取混合菌液點在LB平板中，28℃培養(yǎng)24h；刮取長出來的混合菌落于LB中重懸，稀釋涂布于卡那霉素50mg/L，氨芐霉素100mg/L的LB平板上，28℃培養(yǎng)2～3d后挑取單克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培養(yǎng)1～2d；挑取蔗糖平板上的單克隆，分別點在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及無抗LB平板上，培養(yǎng)12～24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。PCR驗證HT66Δlon菌株的parS基因被敲除，并命名為HT66ΔlonΔparS。

實施例4、假單胞菌HT66及基因工程菌株HT66ΔlonΔparS的生長曲線測定

將菌株充分活化并接種于新鮮的KB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后以最初OD600為0.02的濃度接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，180轉/分培養(yǎng)2～3d，并以一定的時間間隔測定菌液OD600。

圖2為綠針假單胞菌HT66及其不同基因工程菌株的生長曲線。由圖可知，敲除parS基因對菌株的生長影響不打；敲除lon基因會使菌株穩(wěn)定期的OD600值略微下降，其中以雙敲除株HT66ΔlonΔparS的穩(wěn)定期OD600值最低，說明兩個基因對菌體的生長有著復雜的影響。

實施例5、基因工程菌HT66ΔlonΔparS中PCN的生物合成

將活化后的綠針假單胞菌HT66及其基因工程菌株HT66ΔparS、HT66Δlon、HT66ΔlonΔparS分別接種于KB培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫搖床(180轉/分)培養(yǎng)至OD600為0.5～2.0之間時，將上述菌液以1～10:100的體積比，加入到新鮮的KB發(fā)酵培養(yǎng)基中，24～30℃振蕩培養(yǎng)，搖床轉速100～300轉/分鐘，培養(yǎng)24～72h后收取菌液。取發(fā)酵液0.5mL加入3mL乙酸乙酯充分萃取后，取0.2mL有機相吹干后用乙腈溶解，并通過HPLC檢測發(fā)酵液中吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量。

HPLC檢測條件：

流動相為乙腈-25mM乙酸銨，色譜柱為WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5μm；4.6X250mm,Shimadzu,Japan)，檢測波長為254nm，檢測條件：0～2min，8％乙腈-92％25mM乙酸銨，2-20min，乙腈濃度從8％升至60％，乙酸銨濃度從92％下降至40％，20～21min，8％乙腈-92％25mM乙酸銨。

圖3為綠針假單胞菌HT66不同基因工程菌株及野生株中吩嗪-1-甲酰胺的產(chǎn)量變化圖。由圖可知，敲除parS基因導致了PCN的產(chǎn)量由野生株的425mg/L上升到1102mg/L，敲除lon基因使PCN的產(chǎn)量由野生株的425mg/L上升到2053mg/L；兩個基因的雙突變株中PCN產(chǎn)量達到2425mg/L，為野生株的5.71倍。

實施例6

本實施例提供了一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具體是通過敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA單突變株或者雙突變株基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；

其中，綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA單突變株分為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA；上述單突變株及雙突變株相關信息公開于在先申請CN 103642714 A中。

參照實施例1至3提供的方法，將基因工程菌株HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrA的lon基因、parS基因中的一個進行敲除或者兩個同時敲除，即得；包括基因工程菌株HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。上述基因工程菌株生長情況及PCN產(chǎn)量情況如圖4至圖18所示。其中：

圖4為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；

圖5為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖6為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；

圖7為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖8為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；

圖9為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖10為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；

圖11為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖12為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生長曲線圖；

圖13為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖14為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；

圖15為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖16為HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖17為HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖；

圖18為HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量圖。

本發(fā)明具體是以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)菌株，通過基因工程技術從HT66菌株及其已知突變株基因組中分別或者同時敲除吩嗪合成過程中的lon、parS負調控基因，構建lon、parS基因單基因突變株或雙基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS號為550-89-0，簡稱PCN)的產(chǎn)量大幅提高，能夠更加有效由于生物防治。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質內容。