高效全血基因組dna提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速、高效全血基因組DNA提取方法，屬于核酸純化領域。首先向全血中加入紅細胞裂解液，渦旋，直至紅細胞完全裂解，棄上清，吸干殘留液體。加入白細胞裂解液和蛋白酶K，37oC水浴裂解白細胞，直至沉淀溶解。加入氯化鈉和氯仿，離心分離DNA，并將上清液轉移至另一潔凈的EP管中。加入醋酸銨和冰乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗滌后自然干燥，加入TE溶解得到DNA。本發明方法具有快速、高效和無毒的特點。所提取的DNA可用于聚合酶鏈反應（PCR）、甲基化檢測、基因克隆等多種后續分子生物學研究。
【專利說明】高效全血基因組DNA提取方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種快速、高效全血基因組DNA提取方法，屬于核酸純化領域。
【背景技術】
[0003]目前，分子生物學理論和技術發展十分迅速，已經與生物學、醫學、遺傳學和動物學等多個學科密切結合，獲得高純度和完整的基因組DNA是進行后續分子生物學研究的基礎，是其它研究工作的前提。外周血可作為造血系統疾病研究中分子標志，以及用于體外診斷系統的開發，還可用于血液系統外眾多系統疾病的分子監測。從外周血中提取DNA，進行核酸水平的研究是臨床分子生物學重要的研究手段。
[0004]在遺傳性疾病和腫瘤以及心腦血管病等研究中，可以利用外周血作為生物材料，檢測患病個體與正常健康個體之間的DNA差異，例如DNA甲基化分析和基因突變檢測。尋找快速、經濟的DNA提取方法是群體分子生物學實驗面臨的首要問題。然而，從血液中提取DNA面臨的難題之一是DNA易受到多種物質的污染，使得DNA純度下降，致使實驗結果準確性降低。有些傳統的外周血DNA提取方法使用飽和酚等有害物質，且操作復雜，過程繁瑣，用時過長；開放的自動化DNA提取裝置，雖然不再使用飽和酚等有害物質，操作過程也相對比較簡單，但所用儀器和試劑極為昂貴，不適用于普通實驗室大規模DNA的提取。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種快速、高效提取全血基因組DNA方法，保證提取出的基因組DNA完整，并使提取過程高效、快速、無毒。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:
一種高效全血基因組DNA提取方法，包括以下步驟:
(1)按全血:紅細胞裂解液=1:1的體積比，向EP管中的全血中加入紅細胞裂解液，渦旋2分鐘后靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明，然后對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，離心時間為2分鐘，棄去上清液；
(2)向步驟(1)的EP管中再加入占全血體積1/3的紅細胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開，然后對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘，棄去上清液；重復本步驟一次，并用吸水紙吸干殘留液體；
(3)向步驟(2)的EP管中加入占全血體積1/3的白細胞稀釋液，另加入占全血體積1/600的蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解；
(4)向步驟(3)的EP管中分別加入占全血體積1/12的5摩爾/升氯化鈉溶液和占全血體積2/3的氯仿，充分搖勻，然后對溶液進行離心分離，離心轉速為12000轉/分鐘，離心時間為5分鐘，將上層液體轉移至另一潔凈的EP管中；
(5)向步驟(4)的潔凈的EP管中加入占管內溶液I/ 10體積的醋酸銨溶液和2倍體積的冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA，然后對溶液進行離心分離，離心分離的轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘,棄去上清液；
(6)向步驟(5)的潔凈的EP管中加入占全血體積1/3的75%乙醇，對DNA沉淀洗滌，然后進行離心分離，轉速為12000轉/分，離心時間為I分鐘，棄去上清液；重復本步驟兩次；
(7)將步驟(6)的潔凈的EP管倒立放置在放有吸水紙的水平實驗臺上，自然干燥5分
鐘；
(8)向步驟(7)的潔凈的EP管中加入與全血同等體積的TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
[0007]采用上述技術方案的本發明，與現有技術相比，其優點是:
①本發明個步驟中涉及的離心時間、離心機轉速，使全血中基因組DNA的提取過程具有高效、快速、簡便的特點；
②本發明整個過程不需要使用有毒的苯酚的試劑，且所有試劑成本較低，使整個過程不僅安全可靠，而且比較經濟；
②使用本發明方法純化的基因組DNA完整性好，純度高，可用于聚合酶鏈反應(PCR)、實時定量熒光聚合酶鏈反應(Real Time PCR)、芯片分析、分子克隆等分子生物學實驗。
[0008]作為優選，本發明更進一步的技術方案是:
所述紅細胞裂解液中各組分的配方為:
Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M
Sucrose320mM
MgCl25mM
TritonXlOO1%。
[0009]所述白細胞裂解液中各組分的配方為:
Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M
EDTA (PH8.0)4mM
SDS0.2%
NaCl50mM。
·[0010]所述TE緩沖液中各組分的配方為:
Tris-HCl (PH7.6*8.0)IM
EDTA (ΡΗ8.0)0.5Μ。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例對本發明作進一步說明，目的僅在于更好地理解本
【發明內容】
。因此，所舉之例并不限制本發明的保護范圍。
[0012]實施例1:從人的全血中提取DNA。
[0013](I)向600微升人全血中加入紅細胞裂解液600微升，加入的體積比為全血:紅細胞裂解液=1:1，渦旋2分鐘，靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明。對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，離心時間為2分鐘，棄去上清液。其中紅細胞裂解液按下述方法制備:取 IOmllMTris-HCl (ΡΗ7.6)，109.54g Sucrose，1.0lg MgCl2，加 IOml TritonX 100,力卩水至800ml，溶解定容至1000ml。
[0014](2)向步驟(1)的EP管中加入200微升的紅細胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開。對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘，棄上清。重復一次，并用吸水紙吸干殘留液體。
[0015](3)向步驟(2)的EP管中加入200微升白細胞稀釋液，I微升蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解。其中白細胞裂解液按下述方法制備:加IOmlIMTris-HCl (PH7.6), 8ml 0.5 M EDTA, 20ml 10% SDS, IOml 5M NaCl，定容至 1000ml。
[0016](4)向步驟(3)的EP管中加入50微升5摩爾/升氯化鈉溶液和400微升氯仿，充分搖勻。對溶液進行離心分離，離心轉速為12000轉/分鐘，離心時間為5分鐘。將上層液體轉移至另一潔凈EP管中。
[0017](5 )向步驟(4)的EP管中加入I / 10體積醋酸銨溶液和2倍體積冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA。對溶液進行離心分離，離心分離的轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘，
棄上清。
[0018](6)向步驟(5)的EP管中加入200毫升75%乙醇，對DNA沉淀洗滌，于12000轉/
分離心I分鐘，棄上清。重復兩次。
[0019](7)將步驟(6)的EP管倒立放置與放有吸水紙的水平實驗臺上，自然干燥5分鐘。
[0020](8)加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE緩沖液按下述方法制備:取IOml IMTris-HCl (PH8.6), 2ml 0.5 M EDTA，加水至 1000ml。
[0021]依照實施例1所述方法從600微升人全血中提取的DNA，通過其1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現DNA在23130bp處有一條單一亮條帶。
[0022]實施例2:從小鼠的全血中提取DNA。
[0023](I)向600微升小鼠全血中加入紅細胞裂解液600微升，加入的體積比為全血:紅細胞裂解液=1:1，渦旋2分鐘，靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明。對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，離心時間為2分鐘，棄去上清液。其中紅細胞裂解液，其制備方法是:取 IOmllMTris-HCl (PH7.6), 109.54g Sucrose，1.0lg MgCl2，加 IOml TritonXlOO,加水至800ml，溶解定容至1000ml。
[0024](2)向步驟(1)的EP管中加入200微升的紅細胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開。對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘，棄上清。重復一次，并用吸水紙吸干殘留液體。
[0025](3)向步驟(2)的EP管中加入200微升白細胞稀釋液，I微升蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解。其中白細胞裂解液，其制備方法是:加IOmlIMTris-HCl (PH7.6), 8ml 0.5 M EDTA, 20ml 10% SDS, IOml 5M NaCl，定容至 1000ml。
[0026](4)向步驟(3)的EP管中加入50微升5摩爾/升氯化鈉溶液和400微升氯仿，充分搖勻。對溶液進行離心分離，離心轉速為12000轉/分鐘，離心時間為5分鐘。將上層液體轉移至另一潔凈EP管中。
[0027](5 )向步驟(4)的EP管中加入1 / 10體積醋酸銨溶液和2倍體積冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA。對溶液進行離心分離，離心分離的轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘，
棄上清。
[0028](6)向步驟(5)的EP管中加入200毫升75%乙醇，對DNA沉淀洗滌，于12000轉/
分離心I分鐘，棄上清。重復兩次。
[0029](7)將步驟(6)的EP管倒立放置與放有吸水紙的水平實驗臺上，自然干燥5分鐘。[0030](8)加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE緩沖液，其制備方法是:取IOml IMTris-HCl (PH8.6), 2ml 0.5 M EDTA，加水至 1000ml。[0031]依照實施例2所述方法從從600微升小鼠全血中提取的DNA，通過其1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA在23130bp處有一條單一較亮帶。
【權利要求】
1.一種高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)按全血:紅細胞裂解液=1:1的體積比，向EP管中的全血中加入紅細胞裂解液，渦旋2分鐘后靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明，然后對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，離心時間為2分鐘，棄去上清液； (2)向步驟(1)的EP管中再加入占全血體積1/3的紅細胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開，然后對溶液進行離心分離，轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘，棄去上清液；重復本步驟一次，并用吸水紙吸干殘留液體； (3)向步驟(2)的EP管中加入占全血體積1/3的白細胞稀釋液，另加入占全血體積1/600的蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解； (4)向步驟(3)的EP管中分別加入占全血體積1/12的5摩爾/升氯化鈉溶液和占全血體積2/3的氯仿，充分搖勻，然后對溶液進行離心分離，離心轉速為12000轉/分鐘，離心時間為5分鐘，將上層液體轉移至另一潔凈的EP管中； (5)向步驟(4)的潔凈的EP管中加入占管內溶液I/ 10體積的醋酸銨溶液和2倍體積的冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA，然后對溶液進行離心分離，離心分離的轉速為4000轉/分鐘，分離時間為I分鐘,棄去上清液； (6)向步驟(5)的潔凈的EP管中加入占全血體積1/3的75%乙醇，對DNA沉淀洗滌，然后進行離心分離，轉速為12000轉/分，離心時間為I分鐘，棄去上清液；重復本步驟兩次； (7)將步驟(6)的潔凈的EP管倒立放置在放有吸水紙的水平實驗臺上，自然干燥5分鐘； (8)向步驟(7)的潔凈的EP管中加入與全血同等體積的TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
2.如權利要求1所述的高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，所述紅細胞裂解液中各組分的配方為: Tris-HCl (ΡΗ7.6*8.0)0.01M Sucrose320mMMgCl25mM TritonXlOO1%。
3.如權利要求1所述的高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，所述白細胞裂解液中各組分的配方為: Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M EDTA (PH8.0)4mM SDS0.2% NaCl50mM。
4.如權利要求1所述的高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，所述TE緩沖液中各組分的配方為: Tris-HCl (PH7.6*8.0)IM EDTA (ΡΗ8.0)0.5Μ。
【文檔編號】C12N15/10GK103571826SQ201310593112
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月23日 優先權日:2013年11月23日
【發明者】張雪梅, 張志 , 曹蕾 申請人:河北聯合大學