豬帶絳蟲tso45w-4b基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬帶絳蟲TSO45W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，通過全基因合成豬帶絳蟲TSO45W-4B基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構建重組質粒pGEX-TSO45W-4B，電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.longum)，構建豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B)疫苗，為豬囊尾蚴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。
【專利說明】豬帶絳蟲TS045W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及豬帶絳蟲TS045W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法。
【背景技術】
[0002]豬囊尾蝴病(Cysticercosiscellulosae)又稱囊蟲病(Cysticercosis),是由豬帶絳蟲(Taenia solium)的中絳期幼蟲寄生在人體皮下、肌肉、腦、眼等臟器引起的一種嚴重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，已成為全球性的公共衛生問題，我國也是豬囊尾蝴病高發國家之一，以東北、華北、西北、西南地區發病率較高,全國約有200萬~300萬囊蟲病患者，感染率為0.14%~3.20%。藥物及手術治療都有其局限性，研制疫苗防治該病已成為當前研究熱點。
[0003]TS045W-4B基因是豬帶絳蟲六鉤蝴階段重要的免疫原基因，被認為是最具前景的疫苗候選基因。雙歧桿菌(Bifidobacteria，Bb)是人和哺乳動物腸道內重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫調節和營養等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術的發展，以Bb為載體傳遞系統，已在細菌、病毒、腫瘤等領域構建了一系列重組雙歧桿菌。而在寄生蟲領域方面，尚未見豬帶絳蟲重組Bb的報道，因此，本研究擬通過全基因合成豬帶絳蟲TS045W-4B基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1 λ T中，構建重組質粒PGEX-TS045W-4B，電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.1ongum)，構建豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B)疫苗，為豬囊尾蝴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。

【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題是:通過全基因合成豬帶絳蟲TS045W-4B基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1 λ T中，構建重組質粒pGEX-TS045W-4B，電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.1ongum)，構建豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B)疫苗，為豬囊尾蝴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。
[0005]本發明的技術方案是:一種豬帶絳蟲TS045W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，包括以下步驟:
(1)TS045W-4B基因合成和引物設計:根據豬帶絳蟲TS045W-4B基因序列，通過全基因合成的方法，設計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamH I和EcoR I酶切位點和保護性堿基，合成長度為351bp的TS045W-4B基因；
(2)重組質粒pGEX-TS045W-4B的構建及鑒定:合成基因的PCR產物與克隆載體PMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產物轉化至E.coli ToplO感受態細胞，冰浴30min，42°C水浴90s，冰浴冷卻后加入LB培養液，振搖，離心，棄上清，剩余200 μ 1混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養12~16h ;挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養液中，振搖培養，提取質粒，進行PCR鑒定；然后將重組質粒pMD18-T-TS045W-4B與表達載體pGEX-1 λ T分別用BamHI和EcoR I雙酶切，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶連接，轉化至E.coli DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定；
(3)豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B)疫苗的構建及鑒定
①B.1ongum感受態細菌的制備:將B.1ongum凍干粉用無菌水充分溶解后,涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養24~72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養中厭氧培養；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養基中，厭氧培養24~72h ;冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉化，或者加入預冷的甘油，_80°C凍存備用；
②重組質粒PGEX-TS045W-4B電轉化B.1ongum感受態細菌:取備用的重組質粒PGEX-TS045W-4B與B.1ongum感受態細菌混勻，冰浴10~15min后轉移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中，厭氧培養；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養24~72h ；
③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B)疫苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS培養基的EP管中，厭氧培養24~72h ;將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴，期間振蕩使其充分反應；抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
[0006]步驟②中所述電擊參數設置為:電壓1.25KV、場強12.5 KV/cm、電容25 μ F、電阻200 Ω、轉化時間5ms。
[0007]本發明達到的有益效果:通過全基因合成豬帶絳蟲TS045W-4B基因，將該基因定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-Ι λ T中，構建重組質粒pGEX-TS045W-4B，電穿孔法將該質粒導入Bb，構建豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B)疫苗，通過酶切、PCR和測序進行鑒定，證明成功 構建了豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B)疫苗。本發明的疫苗是一種新型疫苗，具有許多優點:①構建的重組Bb疫苗是活疫苗，可在體內長期存活并不斷表達外源抗原，單次接種即可持續誘導對靶抗原的反應，產生持久的免疫應答；②運用分子生物學手段，通過對靶抗原的剪切或修飾，可使新型疫苗理想化；?Bb本身具有廣泛的生理活性，因此，在作為疫苗應用的同時，Bb能夠發揮本身具有的益生功能，達到一劑多用的目的；④生產簡單，所表達的保護性抗原不需純化，無需佐劑，可直接用于免疫接種，免去了蛋白質后處理的復雜工序，從而大大降低了疫苗的成本，適于大批量生產；⑤接種途徑方便，可采用滴鼻、口服等人群易接受的途徑進行免疫；⑥鑒于Bb具有公認的安全性和獨特的可口風味，疫苗可通過添加到酸奶等飲料中的方法進行應用，可望成為廣大人群預防、控制豬囊尾蝴病的一種安全可靠的嶄新手段和途徑。因此，選擇人體正常菌群的雙歧桿菌(Bb)為載體，構建豬帶絳蟲的重組Bb疫苗，可能是預防和控制豬囊尾蝴病較為安全、有效的一種新型疫苗，將該疫苗用于流行區人豬囊尾蝴病的防治具有重大的社會效益和經濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為重組質粒pGEX-TS045W-4B的雙酶切鑒定，其中1:重組質粒PGEX-TS045W-4B的雙酶切產物；2 =DNA分子質量標準；
圖2為重組質粒pGEX-TS045W-4B的測序鑒定；
圖3為B.1ongum中重組質粒pGEX-TS045W_4B的雙酶切鑒定，其中M =DNA分子質量標準；1:重組質粒PGEX-TS045W-4B ；2:重組質粒pGEX-TS045W_4B的雙酶切產物；
圖4為B.1ongum中重組質粒pGEX-TS045W_4B的PCR鑒定，其中M =DNA分子質量標準；I~8:雙歧桿菌中重組質粒pGEX-TS045W-4B的PCR產物；
圖5為B.1ongum中重組質粒pGEX-TS045W_4B的測序鑒定。
【具體實施方式】
[0009]本發明的豬帶絳蟲TS045W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，包括以下步驟:
(I)TS045W-4B基因合成和引物設計:根據豬帶絳蟲TS045W-4B基因序列，通過全基因合成的方法，設計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamH I和EcoR I酶切位點和保護性堿基。由上海英俊生物技術有限公司合成長度為351bp的TS045W-4B基因。
[0010](2)重組質粒PGEX-TS045W-4B的構建及鑒定:合成基因的PCR產物與克隆載體PMD18-T在T4DNA連接酶作用下，16°C連接過夜，連接產物轉化至E.coli ToplO感受態細胞，冰浴30min，42°C水浴90s，冰浴冷卻后加入900 μ ILB培養液，37°C 225rpm振搖45 min，離心，棄上清400 μ I左右，剩余200 μ I混勻涂于含50 μ g/mlAmp的LB瓊脂平板上，37°C倒置培養12~16h。挑取單菌落至含50μ g/ml氨芐青霉素的LB培養液中，37°C 225rpm振搖培養過夜，提取質粒，進行PCR鑒定。然后將重組質粒pMD18-T-TS045W-4B與表達載體pGEX-Ι λ T分別用BamH I和EcoR I雙酶切，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶16°C連接過夜，轉化至E.coli DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定。[0011 ] 重組質粒PGEX-TS045W-4B的酶切鑒定:
重組質粒pGEX-TS045W-4B ^BamH I和及I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到4944 bp的pGEX-Ι λ T載體 片段和351bp的TS045W-4B基因片段，與預期結果相符，見圖1。
[0012]重組質粒PGEX-TS045W-4B的測序鑒定
合成的TS045W-4B基因，亞克隆到pGEX-Ι λ T載體的BamH I和EcoR I位點，測序結果與預期序列100%匹配，見圖2。
[0013](3)豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B)疫苗的構建及鑒定
①B.1ongum感受態細菌的制備:將購買的B.1ongum凍干粉用無菌水充分溶解后,涂布于MRS瓊脂平板上，37°C厭氧培養24~72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于4mlMRS液體培養中，37°C厭氧培養至菌體0D600nm值為0.5左右；按1:25比例接種于含
0.5M蔗糖的 MRS 培養基中，37°C厭氧培養 24 ~72h JM#30min，4°C 10000r/min 離心 lmin，棄上清，沉淀用預冷的0.5M蔗糖清洗2次，再用100 μ 10.5Μ蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉化，或者加入預冷的15%甘油，_80°C凍存備用。
[0014]②重組質粒pGEX-TS045W-4B電轉化B.1ongum感受態細菌:取備用的重組質粒PGEX-TS045W-4B1 μ g與B.1ongum感受態細菌100 μ I混勻，冰浴10~15min后轉移至至Imm的電擊杯中，電擊參數設置為:電壓1.25KV、場強12.5 KV/cm、電容25 μ F、電阻200 Ω、轉化時間5ms ；電擊完畢后立即將混合液轉入到900 μ IMRS液體培養基的EP管中，37°C厭氧培養2h ;將菌液涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上,37°C厭氧培養24~72h。
[0015]③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W_4B)疫苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至Iml含100 μ g/ml氨芐青霉素的MRS培養基的EP管中，37 °C厭氧培養24~72h ;將菌液40C 10000171^11離心51^11，棄上清，沉淀中加入25(^1 25%蔗糖溶液重溶菌體沉淀，37°C溫浴30min，期間每隔5min振蕩I次，使其充分反應；抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
[0016]B.1ongum中重組質粒pGEX-TS045W_4B的酶切鑒定:
從具有氨芐青霉素抗性的B.1ongum中抽提的重組質粒pGEX-TS045W_4B，經BamH I和EcoR I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到4944 bp的pGEX_l λ T載體片段和351bp的TS045W-4B基因片段，與預期結果相符，見圖3。
[0017]B.1ongum 中重組質粒 pGEX_TS045W_4B 的 PCR 鑒定 以從具有氨芐青霉素抗性的漢1ngum中抽提的重組質粒pGEX-TS045W-4B為模板進行PCR擴增可得到450bp的基因片段，除去載體序列99bp，TS045W-4B基因實際的長度為351bp，與預期結果相符，見圖4。
[0018]B.1ongum中重組質粒pGEX_TS045W_4B的測序鑒定:
從具有氨芐青霉素抗性的B.1ongum中抽提的重組質粒pGEX_TS045W_4B，其測序結果與預期序列100%匹配，見圖5。
【權利要求】
1.一種豬帶絳蟲TS045W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，其特征在于:包括以下步驟: (I)TS045W-4B基因合成和引物設計:根據豬帶絳蟲TS045W-4B基因序列，通過全基因合成的方法，設計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamH I和EcoR I酶切位點和保護性堿基，合成長度為351bp的TS045W-4B基因； (2 )重組質粒pGEX-TS045W-4B的構建及鑒定:合成基因的PCR產物與克隆載體PMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產物轉化至E.coli ToplO感受態細胞，冰浴30min，42°C水浴90s，冰浴冷卻后加入LB培養液，振搖，離心，棄上清，剩余200 μ I混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養12~16h ;挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養液中，振搖培養，提取質粒，進行PCR鑒定；然后將重組質粒pMD18-T-TS045W-4B與表達載體pGEX-Ι λ T分別用BamH I和EcoR I雙酶切，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶連接，轉化至Ε.coli DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定； (3)豬帶絳蟲重組Bb (pGEX-TS045W-4B)疫苗的構建及鑒定 ①B.1ongum感受態細菌的制備:將B.1ongum凍干粉用無菌水充分溶解后,涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養24~72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養中厭氧培養；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養基中，厭氧培養24~72h ;冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉化，或者加入預冷的甘油，_80°C凍存備用； ②重組質粒PGEX-TS045W-4B電轉化B.1ongum感受態細菌:取備用的重組質粒PGEX-TS045W-4B與B.1ongum感受態細菌混勻，冰浴10~15min后轉移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中，厭氧培養；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧`培養24~72h ； ③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TS045W-4B)疫苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS培養基的EP管中，厭氧培養24~72h ;將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴，期間振蕩使其充分反應；抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
2.根據權利要求1所述的豬帶絳蟲TS045W-4B基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，其特征在于:步驟②中所述電擊參數設置為:電壓1.25KV、場強12.5 KV/cm、電容`25 μ F、電阻200 Ω、轉化時間5msο
【文檔編號】C12N15/12GK103623399SQ201310617276
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】周必英 申請人:遵義醫學院