一種多形漢遜酵母遺傳操作策略及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種多形漢遜酵母遺傳操作策略及其應用。本發明公開的一種用于對多形漢遜酵母中目的基因進行敲除的DNA片段組，由DNA片段甲和DNA片段乙組成；沿著5’端至3’端的方向，DNA片段甲的結構為：目的基因5’端序列—m—mazF表達盒—抗性篩選標記基因表達盒部分片段A；沿著5’端至3’端的方向，DNA片段乙的結構為：抗性篩選標記基因表達盒部分片段B—n—目的基因3’端序列。本發明利用甲醇誘導的毒性蛋白mazF對mRNA的切割作用，達到無標記或無痕敲除的目的，為多形漢遜酵母遺傳操作提供了極大便利。
【專利說明】一種多形漢遜酵母遺傳操作策略及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多形漢遜酵母遺傳操作策略及其應用。
【背景技術】
[0002]多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)是一類能以甲醇為唯一碳源和能源進行快速生長的甲醇營養型酵母，它除了和其他酵母菌一樣具有與高等真核生物相似的基因表達調控和蛋白質翻譯后修飾機制外，還具有獨特的有利于外源蛋白高效表達的機制，如內源甲醇氧化酶(methanol oxidase)基因啟動子MOXp是強誘導型啟動子，對葡萄糖或甘油的阻遏不敏感，在葡萄糖或甘油限制或缺乏的條件下，能夠被甲醇誘導啟動外源基因的高效表達，因此細胞培養和蛋白表達可分時相控制，工藝過程的可控性好。多形漢遜酵母是一種耐熱酵母，最適生長溫度為37-43°C，因此生長速率快，有利于縮短大規模發酵的培養時間，而且為通過發酵溫度變化實現蛋白表達控制提供了便利。它能夠同時利用五碳糖和六碳糖，對環境脅迫的耐受性高，在簡單廉價的培養基中可實現高密度發酵，并且其對表達蛋白的合適的糖基化修飾有利于提高蛋白的生物活性和穩定性。多形漢遜酵母內源的分泌型蛋白少，有利于外源蛋白的分離純化。因此多形漢遜酵母是目前國際上公認的最理想的外源蛋白表達系統之一，在蛋白質結構功能的晶體學研究、蛋白質藥物、高效生物催化劑、工農業生產過程中功能性蛋白的高效制備中發揮著非常重要的作用。
[0003]無論外源蛋白在多形漢遜酵母中的高效表達，還是多形漢遜酵母對五碳糖和六碳糖的高效利用和轉化，都需要通過對宿主菌的遺傳操作來實現。同時隨著對多形漢遜酵母全基因組序列的不斷揭示，需要對大量功能未知的基因進行遺傳操作以研究和明確其功能及生物學意義。
[0004]在漢遜酵母遺傳操作 中常用的篩選標記主要有兩種，一種是抗生素抗性基因，如KanMX6、zeoR等，另一種是營養缺陷互補標記，如URA3、TRPl等。然而，這種篩選標記存在很多局限性。首先，漢遜酵母菌株利用一種標記獲得了抗生素抗性或者營養缺陷得到互補之后，這種標記就不能再次使用，限制了對多基因功能的研究和改造。另外，帶有抗生素抗性基因的轉基因菌株在實際應用過程中會存在潛在的危險。因此，建立簡便高效的、具有反向篩選功能的遺傳操作體系對多形漢遜酵母的功能基因組學、蛋白表達研究和代謝工程改造等具有非常重要的現實意義。
[0005]目前，在多形漢遜酵母中可應用的反向篩選標記主要是乳清苷5-磷酸脫羧酶基因URA3和5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構酶基因TRP1，其中前者乳清苷5-磷酸脫羧酶能將5-氟乳清酸(5-F0A)轉化為有毒物質，后者5-磷酸核糖氨基苯甲酸異構酶能將2-氨基-5-氟苯甲酸(5-FAA)轉化為有毒物質，因此在5-F0A或5-FAA存在下迫使帶有上述篩選標記的多形漢遜酵母細胞利用標記兩側的同向重復序列重組從而去掉URA3或TRPl，獲得上述篩選標記丟失細胞，即進行反向篩選。但這種反向篩選方法只限定在ura3缺陷型或trpl缺陷型的漢遜酵母細胞中使用，同時假陽性比例較高，篩選效率低。
[0006]大腸桿菌的mazF基因編碼產物能特異識別和切割mRNA的5’ -ACA-3’序列，從而對細胞產生致死效應，它作為一種毒性蛋白是否可應用于多形漢遜酵母遺傳操作中的反向篩選標記還沒有報道。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種多形漢遜酵母遺傳操作策略及其應用。
[0008]本發明提供的一種用于對多形漢遜酵母中目的基因進行敲除的DNA片段組，由DNA片段甲和DNA片段乙組成；
[0009]沿著5’端至3’端的方向，DNA片段甲的結構為:目的基因5’端序列一m — mazF表達盒一抗性篩選標記基因表達盒部分片段A ；
[0010]沿著5’端至3’端的方向，DNA片段乙的結構為:抗性篩選標記基因表達盒部分片段B—η一目的基因3’端序列；
[0011]抗性篩選標記基因表達盒是用于篩選重組多形漢遜酵母菌的；
[0012]mazF表達盒能夠在重組多形漢遜酵母菌中表達mazF蛋白；
[0013]抗性篩選標記基因表達盒部分片段A為抗性基因表達盒的一部分片段，不是完整的抗性篩選標記基因表達盒，其從抗性篩選標記基因表達盒的5’末端開始至抗性篩選標記基因表達盒的中間某個堿基處結束；抗性篩選標記基因表達盒部分片段B為抗性篩選標記基因表達盒的一部分片段，不是完整的抗性篩選標記基因表達盒，其從抗性篩選標記基因表達盒的中間某個堿基開始至抗性篩選標記基因表達盒3’末端結束；抗性篩選標記基因表達盒部分片段A的3’端與抗性篩選標記基因表達盒部分片段B的5’端有部分重疊序列，該部分重疊序列供DNA片段甲和DNA片段乙發生同源重組從而在漢遜酵母細胞內形成完整的抗性篩選標記基因表達盒；·
[0014]mazF表達盒中的啟動子是甲醇誘導的MOXp啟動子；
[0015]mazF的氨基酸序列是如SEQ ID N0.2所示；
[0016]m和η為如下中的任一種:
[0017](I) m 為 CYClTT 序列，η 為 CYClTT 序列；
[0018]CYClTT的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示；
[0019](2)m為空白序列，η為目的基因5’端上游序列；
[0020](3)m為目的基因3’端下游序列，η為空白序列；
[0021](4) m為空白序列，η為目的基因5’端序列；
[0022](5) m為目的基因3’端序列，η為空白序列；
[0023]上述DNA片段組中，所述抗性篩選標記基因為Zeocin抗性基因。
[0024]上述任一所述的DNA片段組中，所述mazF表達盒的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所示；
[0025]所述抗性篩選標記基因表達盒部分片段A的核苷酸序列為如SEQ ID N0.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示；
[0026]所述抗性篩選標記基因表達盒部分片段B的核苷酸序列為如SEQ ID N0.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示。
[0027]—種敲除多形漢遜酵母中一個目的基因的方法也屬于本發明的保護范圍，包括如下步驟:將上述任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起轉入多形漢遜酵母中，通過所述抗性篩選標記進行抗性篩選獲得重組酵母；將所述重組酵母進行甲醇誘導培養，得到目的重組菌，目的重組菌中所述目的基因被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失；
[0028]當!11和η為上述(I)所述的序列時，所述目的重組菌中所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失，所述目的基因的除5’端序列和3’端序列外的中間序列被所述CYClTT序列取代，實現了所述目的基因的無篩選標記敲除；
[0029]當m和η為上述(2)所述的序列時，所述目的重組菌中所述目的基因中除3’端序列外的序列被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失，使所述目的基因失去活性，實現了所述目的基因的無痕敲除；
[0030]當m和η為上述(3)所述的序列時，所述目的重組菌中所述目的基因中除5’端序列外的序列被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失，使所述目的基因失去活性，實現了所述目的基因的無痕敲除；
[0031]當m和η為上述(4)所述的序列時，所述目的重組菌中所述目的基因的除5’端序列和3’端序列外的中間序列被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失，使所述目的基因失去活性，實現了所述目的基因的無痕敲除；
[0032]當m和η為上述(5)所述的序列時，所述目的重組菌中所述目的基因的除5’端序列和3’端序列外的中間序列被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失，使所述目的基因失去活性，實現了所述目標基因的無痕敲除。
[0033]一種敲除多形漢遜酵母中多個目的基因的方法也屬于本發明的保護范圍，包括如下步驟:
[0034]( I)敲除宿主多形漢遜酵母中的目的基因A:
[0035]按照上述方法敲除多形漢遜酵母中的目的基因A，將所得重組菌記作重組菌A ；
[0036](2)敲除宿主多形漢遜酵母中的目的基因B:
[0037]再將上述任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起轉入重組菌A中，通過所述抗性篩選標記進行抗性篩選獲得重組酵母；將所述重組酵母進行甲醇誘導培養，得到目的重組菌，目的重組菌中所述目的基因B和目的基因A均被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失；
[0038]所述步驟(1)中的所述的方法中的DNA片段組與所述步驟(2)中的DNA片段組不同時含有CYClTT序列。
[0039]上述方法中，所述CYClTT的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示。
[0040]本發明利用甲醇誘導的毒性蛋白mazF對mRNA的切割作用，在甲醇存在下對多形漢遜酵母菌株構成致死壓力，在這種壓力下迫使mazF-zeoR表達盒兩側的同向重復序列發生重組從而刪除正向篩選標記zeoR和反向篩選標記mazF，達到無標記或無痕敲除的目的。
[0041]本發明提供的策略應用范圍廣，在野生型和各種營養缺陷型酵母宿主菌中均可使用，克服了目前已有反向篩選標記只限定在營養缺陷型酵母菌株中應用的弊端，為多形漢遜酵母遺傳操作提供了極大便利。本發明同時利用了斷裂正向篩選標記法，在同源臂為500-1000bp時，同源重組率達到50%，明顯高于常規的15%的重組率，克服了多形漢遜酵母同源重組效率低、篩選效率低、工作量大的缺點。【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為重組質粒pMOXZ-mazF物理圖譜。
[0043]圖2為對照菌株HUll和HUll-M在不同培養基中的生長比較。
[0044]圖3為重組質粒pEBCMMZC物理圖譜。
[0045]圖4為蛋白酶A基因PEP4無標記敲除菌株的PCR分析。
[0046]圖5為蛋白酶A基因PEP4無痕敲除菌株的PCR分析。
[0047]圖6為羧肽酶Y基因CPY無痕敲除菌株的PCR分析。
【具體實施方式】
[0048]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0049]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0050]KOD-Plus-Neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司，產品目錄號為K0D-401。
[0051]抗生素Zeocin購自Invitrogen公司，產品目錄號為R25001。
[0052]ρΜΟΧΖα-Α 載體在文獻 “Chen ZY, Wang ZY, He XP, Guo XN, Li ffff, ZhangBR.Uricase production by a recombinant Hansenula polymorpha strainharbouring Candida utilis uricase gene.Applied Microbiology andBiotechnology, 2008, 79:545-554”中公開過，公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。
[0053]多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) HUll保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.1218，該菌株在專利號為ZL200410080517.2，發明名稱為“一種重組多形漢遜酵母菌及其構建方法與應用”的專利中公開過。
[0054]實施例中用到的各種培養平板:
[0055]YEPD固體培養基:該培養基由溶質和溶劑組成；溶質為酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和瓊脂粉，溶劑為水；溶質的濃度如下:10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和10g/L瓊脂粉，自然pH。
[0056]YEPG固體培養基:該培養基由溶質和溶劑組成；溶質為酵母粉、蛋白胨、甘油和瓊脂粉，溶劑為水；溶質的濃度如下:10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、10g/L瓊脂粉和10mL/L甘油,自然pH。
[0057]YEPM固體培養基:該培養基由溶質和溶劑組成；溶質為酵母粉、蛋白胨、甲醇和瓊脂粉，溶劑為水；溶質的濃度如下:10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、5ml/L甲醇和10g/L瓊脂粉，自然pH。
[0058]以上培養基的液體培養基由不添加其中的瓊脂粉制成，其余成分以及濃度相同。
[0059]pEasy Blunt購自北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為CBlOl。
[0060]pEasy Blunt Simple購自北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為CBlll。
[0061]大腸桿菌JM109購自寶生物工程(大連)有限公司，產品目錄號為D9022。
[0062]實施例1、 大腸桿菌毒性蛋白mazF的表達及其生物學功能分析
[0063]一、重組質粒pMOXZ-mazF的構建[0064](一)根據大腸桿菌JM109毒性蛋白基因mazF序列(GenBankAccessN0.U00096.2)，設計并合成如下引物:
[0065]引物1:5，-CGGAAGCTTATGGTAAGCCGATACGTAC-3> ；
[0066](下劃線部分為HindIII酶切識別位點)
[0067]引物2:5 ’ -CCCTCTAGAAGTAACACTACCCAATCAGT-3 ’。
[0068](下劃線部分為XbaI酶切識別位點)
[0069](二)提取大腸桿菌JM109基因組DNA，以基因組DNA為模板，以引物I和引物2進行PCR擴增。
[0070]PCR反應體系:基因組DNA50ng，引物I終濃度0.3 μ mol/L,引物2終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0071]PCR 反應條件:94°C 5 分鐘，循環 I 次；94°C 30 秒，56°C 30 秒，68°C 20 秒，30 個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0072](三)將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物大小約為350bp，與預期大小一致。序列分析表明 擴增到的PCR產物與GenBank中mazF序列一致性為100%。
[0073](四)用HindIII和Xba I雙酶切mazF基因，得到基因片段；用Hind III和Xba I雙酶切pMOXZ a -A載體，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒pMOXZ-mazF。將重組質粒pMOXZ-mazF測序,測序結果正確。
[0074]重組質粒pMOXZ-mazF的物理圖譜如圖1所示。
[0075]圖1中，pMOXZ-mazF用mazF基因序列替換了載體pMOXZ a -A上的α信號肽分泌序列(α-MF)，mazF上游含有強誘導型啟動子ΜΟΧρ，在甲醇誘導下可以啟動mazF的高效表達，除了 mazF表達盒外，pMOXZ-mazF還含有Zeocin抗性基因zeoR表達盒,可以作為在大腸桿菌和酵母中的通用篩選標記，pMOXZ-mazF的其他元件與載體pMOXZ a -A相同，其中CYClterminator 為 CYC1TT。
[0076]mazF表達盒的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所
/Jn ο
[0077]mazF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第1970位至第2305位所示，mazF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0078]zeoR表達盒的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第2712位至第3882位核苷酸所示。
[0079]Zeocin抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5，端起第3196位至第3570位所示，Zeocin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0080]二、重組菌HU11-M的構建
[0081](一)用SphI酶切重組質粒pMOXZ-mazF，得到4.2kb的線性化DNA片段，將此片段轉化多形漢遜酵母菌HU11，在含有100 μ g/mL Zeocin的YETO培養基平板上篩選重組菌
轉化子。
[0082](二)將步驟(一)平板上長出的轉化子單菌落分別接于無菌水中混勻，室溫靜置4小時，同時以宿主菌多形漢遜酵母菌HUll為對照，分別接種于含0、100、200、400、60(^8/mL Zeocin的YEPD平板上，37°C靜置培養48h。[0083]結果顯示，所有步驟(一)平板上長出的單菌落以及對照菌HUll (多形漢遜酵母菌HUlI)在不含Zeocin的YEH)平板上均正常生長。在含有Zeocin的YEH)平板上，對照菌HUll不能生長，挑取的100個轉化子單菌落中，僅有3個不能在IOOy g/mLZeocin的YETO平板生長，其他轉化子均可在含400 μ g/mL Zeocin的YETO培養基平板上正常生長，將此種重組菌命名為HU11-M。
[0084](三)以引物I和引物2對對照菌HUl1、不能在100μ g/mL Zeocin的YEPD平板上生長的3個轉化子單菌落以及HUl 1-M進行菌落PCR，結果表明，對照菌HUl I和不能在100 μ g/mL Zeocin的YETO平板上生長的3個轉化子單菌落均沒有目的條帶的產生，而從HUl1-M菌落中均能擴增出約350bp的DNA片段，該片段序列與mazF基因序列一致。
[0085]三、mazF基因在多形漢遜酵母中的表達及其功能分析
[0086](一)將對照菌HUl1、 不能在100μ g/mL Zeocin的YEPD平板上生長的3個轉化子單菌落、及HUl1-M接種于無菌水中。室溫靜置4h后，分別將各菌接種在YEH)、YEPG和YEPM平板上，37 °C培養48h。
[0087]結果表明，對照菌HUlI和3個不能在100 μ g/mL Zeocin的YETO平板上生長的轉化子單菌落在YEro、YEPG和YEPM平板上均能正常生長。HUll-M在YEI3D和YEPG平板上正常生長，而在YEPM平板上的生長被抑制。
[0088]說明在甲醇的誘導下,啟動子MOXp啟動了 mazF基因的表達,其表達產物mazF蛋白對酵母細胞產生了毒性，抑制了 HUl 1-M的生長，所以HUl 1-M在YEPM平板上的生長被抑制，而對照菌HUll和3個不能在100 μ g/mL Zeocin的YEH)平板上生長的3個轉化子由于沒有攜帶mazF基因，所以能在YEPM平板(即甲醇存在的條件)上正常生長。
[0089](二)將菌株HUll-M和對照菌株HUll在2ml YEH)液體培養基中培養16小時，5000rpm離心5分鐘，分別收集菌體，用無菌水洗兩次，然后分別重新懸浮于2ml無菌水中。從菌懸液中各取100 μ L分別轉接于40mL YEPD, YEPG和YEPM液體培養基中，37°C>200rpm振蕩培養，通過檢測0D_考察各菌株在不同培養基中的細胞活力。
[0090]結果如圖2所示。
[0091]圖2表明，菌株HUll-M和對照菌株HUll在YETO和YEPG培養基中均正常生長，而且生長速率沒有明顯差異；但在YEPM培養基中，對照菌株HUl I能生長，而重組菌株HUll-M的生長完全被抑制。
[0092]以上結果表明在啟動子MOXp的調控下，mazF基因在多形漢遜酵母中得到了可誘導的功能性表達，對多形漢遜酵母產生了細胞毒性，為反向篩選系統的建立奠定了基礎，初步證明了 mazF基因可以作為多形漢遜酵母基因敲除過程中的反向篩選標記。
[0093]實施例2、mazF表達盒和zeoR表達盒在基因無標記敲除中的應用
[0094]一、重組質粒pEBCMMZC的構建
[0095](一)根據載體pMOXZa -A上的CYClTT序列，設計如下引物:
[0096]引物3:5，-ATCCAATTGTGACACGTCCGAC-3，；
[0097]引物4: 5，-CCTTTTTACGGTTCCTGGCC-3，。
[0098](二)以pMOXZ a -A為模板，以引物3和引物4進行PCR，擴增得到CYClTT片段。
[0099]PCR反應體系:pM0XZ a -A50ng,引物3終濃度0.3 μ mol/L,引物4終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0100]PCR 反應條件:94°C 5 分鐘，循環 I 次；94°C 30 秒，56°C 30 秒，68°C 20 秒，30 個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0101](三)將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小383bp的DNA片段，序列分析表明擴增到的PCR產物與pMOXZ a -A中CYClTT序列一致性為100%，將該片段命名為CYClTT。CYClTT的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示、SEQID N0.1中自5’末端起第3571位至第3941位核苷酸所示。
[0102](四)將CYClTT基因與載體pEasyBlunt連接，獲得重組質粒pEB-CYClTT。
[0103](五)根據重組質粒pMOXZ-mazF序列，設計如下引物: [0104]引物5:5’ -ATTTGCGGCCGCTCATGCATGAGATCAGATC-3’ ；
[0105](下劃線部分為NotI酶切識別位點)
[0106]引物6: 5，-AAAGGGCCCGCTAGCATCGATGCCAGCAACGCG-3，。
[0107](下劃線部分為ApaI酶切識別位點)
[0108]以質粒pMOXZ-mazF為模板，利用引物5和引物6進行PCR擴增。
[0109]PCR反應體系:pM0XZ-mazF50ng,引物5終濃度0.3 μ mol/L,引物6終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0110]PCR反應條件:94 °C 5分鐘，循環I次；94 V 30秒，56 V 30秒，68 °C 3分鐘，30個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0111]PCR產物大小為3.5kb，序列分析表明擴增到的PCR產物與pMOXZ-mazF中mazF和zeoR表達盒序列一致性為100%，說明PCR產物正確，其中包含mazF表達盒和zeoR表達盒，將該片段命名為mazF-zeoR，該片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中5’末端起第415位至第3972位核苷酸所示。
[0112](六)用NotI和Apa I雙酶切mazF-zeoR片段，得到基因片段；用Not I和Apa I雙酶切pEB-CYCITT，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒pEBCMMZCο
[0113]重組質粒pEBCMMZC物理圖譜如圖3所示。
[0114]重組質粒pEBCMMZC中的DNA片段C-mazF_zeoR，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所
/Jn ο
[0115]C-mazF-zeoR片段的組成如下:
[0116]C-mazF-zeoR含有Zeocin抗性基因zeoR,在基因敲除過程中作為正向篩選標記；含有mazF表達盒,可以作為反向篩選標記；C-mazF-zeoR兩端的CYClTT序列可以作為反向篩選時的同源重組位點，在mazF基因表達帶來的致死壓力下發生重組，使mazF-zeoR片段刪除，以此方法將篩選標記刪除。
[0117]二、多形漢遜酵母蛋白酶A基因的無標記敲除
[0118](一)PEP4基因5’端序列和3’端序列的PCR擴增
[0119]根據多形漢遜酵母蛋白酶A基因PEP4序列(GenBank Access N0.U67173)，設計如下引物7、8、9和10，其中引物8和引物9中設計了 Sac I酶切位點。
[0120]引物7:5，-TCCTGCAATGGTACAAATGGG-3，；[0121]引物8:5’ -GTTTTTCTGGTAAGTGGAGGAGCTCATCGTGGTCGTATTT-3’ ；
[0122](下劃線部分為SacI酶切識別位點)
[0123]引物9:5’ -AAATACGACCACGATGAGCTCCTCCACTTACCAGAAAAAC-3’ ；
[0124](下劃線部分為SacI酶切識別位點)
[0125]引物10:5’ -GGAAACACACAGAGCAGCAC-3’。
[0126](二)以多形漢遜酵母HUll的基因組為模板，利用引物7和引物8進行PCR擴增，獲得約Ikb的PEP4基因的5’端同源序列，該序列如SEQ ID N0.4中自5’末端起第I位至第1028位核苷酸所示。
[0127]以多形漢遜酵母HUll的基因組為模板，利用引物9和引物10進行PCR擴增，獲得約Ikb的PEP4基因的3’端同源序列，該序列如SEQ ID N0.4中自5’末端起第989位至第2011位核苷酸所示。
[0128]PCR反應體系為:基因組DNA50ng，引物7終濃度0.3 μ mol/L，引物8終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0129]PCR反應體系為:基因組DNA50ng，引物9終濃度0.3 μ mol/L，引物10終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0130]兩種PCR反應條件均為:94°C 5分鐘，循環I次；94°C 30秒，56°C 30秒，68°C I分鐘，30個循環；68°C 10分鐘·，循環I次。
[0131 ](三)重組質粒PEBS-PEP4-S的構建
[0132]以上述步驟(二)獲得的PEP4基因的5’端同源序列和3’端同源序列為模板，利用引物7和引物10進行融合PCR擴增。
[0133]PCR反應體系:5’端同源序列和3’端同源序列各25ng，引物7終濃度0.3 μ mol/L，引物 10 終濃度 0.3ymol/L，KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L, 10XK0D buffer5 μ L, 2mMdNTPs5 μ L, 25mM Mg2+ 2 μ L，用去離子水將體系補至50 μ L，混勻。
[0134]PCR反應條件:94°C 5分鐘，循環I次；94°C 30秒，56°C 30秒，68°C 2分鐘，30個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0135]PCR產物為約2kb的PEP4基因5’端和3’端融合的DNA片段，將其命名為PEP4-S，該序列如SEQ ID N0.4所示。將PEP4-S與載體pEasy Blunt Simple連接,得到重組質粒PEBS-PEP4-S，將重組質粒測序，結果正確。
[0136](四)重組質粒pCMMZC-PEP4的構建
[0137]根據重組質粒pEBCMMZC的序列，設計如下引物:
[0138]引物11:5’-AGGGAGCTCATCCAATTGTGACACGTC-3’ ；
[0139](下劃線部分為SacI酶切識別位點)
[0140]引物12: 5，-AAAGGTCACCGATGCCAGCAACGCG-3，。
[0141](下劃線部分為BstEII酶切識別位點)
[0142]以重組質粒pEBCMMZC為模板，利用引物11和引物12進行PCR擴增。
[0143]PCR反應體系:pEBCMMZC50ng，引物11終濃度0.3 μ mol/L,引物12終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0144]PCR反應條件:94°C 5分鐘，循環I次；94°C 30秒，56°C 30秒，68°C 4分鐘，30個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0145]PCR產物為約3.9kb的DNA片段C-mazF-zeoR，該片段如SEQ ID N0.1中自5’末端起第I位至第3598位核苷酸所示。用Sac I和BstE II雙酶切PCR產物，得到基因片段；用Sac I和BstE II雙酶切PEBS-PEP4-S，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒PCMMZC-PEP4。
[0146]在重組質粒pCMMZC-PEP4中，PEP4的5’端和3’端序列之間約IOObp序列被帶有正向篩選標記和反向篩選標記的DNA片段C-mazF-zeoR所替換。
[0147](五)片段C的獲得
[0148]根據重組質粒pCMMZC-PEP4的序列，設計如下引物:
[0149]引物13:5，-CGTCCCGGAAGTTCGTGG-3，；
[0150]引物14: 5，-CCAAGTTGACCAGTGCCGTT-3，。
[0151]以重組質粒pCMMZC-PEP4為模板，利用引物7和引物10進行PCR擴增。
[0152]PCR反應體系:pCMMZC-PEP450ng，引物7終濃度0.3 μ mol/L,引物10終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus- Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0153]PCR反應條件:94°C 5分鐘，循環I次；94°C 30秒，56°C 30秒，68°C 6分鐘，30個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0154]PCR產物為約5.9kb,中間為C-mazF-zeoR、兩端分別為PEP4的5’端和3’端序列的DNA片段，將此產物命名為DNA片段C，該片段的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0155](六)片段C-5和C-3的獲得
[0156]以重組質粒pCMMZC-PEP4為模板，分別利用引物7和引物13、引物14和引物IO進行PCR擴增。
[0157]PCR反應體系:pCMMZC-PEP450ng，引物7終濃度0.3 μ mol/L,引物13終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0158]PCR反應體系:pCMMZC-PEP450ng，引物14終濃度0.3 μ mol/L，引物10終濃度0.3 μ mol/L, KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 I μ L，10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMg2+ 2 μ L,用去離子水將體系補至50 μ L,混勻。
[0159]PCR反應條件:94°C 5分鐘，循環I次；94°C 30秒，56°C 30秒，68°C 4分鐘，30個循環；68°C 10分鐘，循環I次。
[0160]以重組質粒PCMMZC-PEP4為模板，利用引物7和引物13進行PCR得到4.5kb的DNA片段C-5，該片段序列如SEQ ID N0.5中自5’末端起第I位至第4469位核苷酸所示。
[0161]以重組質粒pCMMZC-PEP4為模板，利用引物14和引物10進行PCR得到1.6kb的DNA片段C-3，該片段序列如SEQ ID N0.5中自5’末端起第4209位至第5877位核苷酸所示。
[0162]DNA片段C-5包含PEP4基因5’端序列、CYClTT序列、mazF表達盒及zeoR表達盒的5’端序列(zeoR表達盒的5’端序列是SEQ ID N0.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示)；DNA片段C-3包含zeoR表達盒的3’端序列(zeoR表達盒的3’端序列是SEQ ID N0.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示)及PEP4基因3’端序列；C-5和C-3之間存在261bp的重疊區，可以通過重組形成完整的zeoR表達盒，使轉化菌株表現出Zeocin抗性。C-5和C-3這兩個片段構成斷裂正向篩選標記。
[0163](七)片段C轉化酵母菌
[0164]將6yg DNA片段C通過電轉化的方法轉化到多形漢遜酵母HUll中，在100 μ g/mLZeocin的YETO培養基平板上篩選轉化子，對能夠在上述篩選平板上生長的單菌落的Zeocin抗性進行進一步分析,結果表明所有轉化子均可在400 μ g/mL Zeocin的YEF1D培養基平板上生長，將此類重組菌命名為HU11-MC。
[0165](A)片段C-5和C-3轉化酵母菌
[0166]將DNA片段C-5和C_3按摩爾濃度等量混合，然后取6 μ g電轉化多形漢遜酵母HUll ;同時分別以6 μ g DNA片段C-5或DNA片段C-3電轉化多形漢遜酵母HUll作為對照，通過Zeocin抗性篩選轉化子。
[0167]結果顯示，DNA片段C-5或DNA片段C_3分別單獨轉化多形漢遜酵母HU11，在含有Zeocin的YEH)平板上均沒有菌落生長；而采用斷裂正向篩選標記法，將DNA片段C-5和C-3混合物轉化多形漢遜酵母HU11，在100 μ g/mL Zeocin的YETO平板上均有菌落生長，而且進一步的Zeocin抗性分析表明，所有轉化子均可在400 μ g/mL Zeocin的YEH)培養基平板上生長，將此類重組菌命名為HU11-MC5/C3。
[0168](九)同源重組率分析 [0169]在多形漢遜酵母中非同源重組頻率非常高，同源重組的頻率比較低，因此通過Zeocin抗性篩選到的轉化子只能說明DNA片段C整合到酵母染色體上，不能保證是同源重組還是非同源重組，因此需要通過PCR分析區分在PEP4基因位點發生同源重組的正確轉化菌株和非同源重組的轉化菌株，并統計同源重組頻率。
[0170]依據PEP4基因5’端上游序列和3’端下游序列設計合成引物PEP4-5U和PEP4-3D:
[0171 ] PEP4-5U:5’-GATCAAAACTCCTCGTACAG-3’
[0172]PEP4-3D: 5’-CTGCTAAAGAAGAGACAATC-3’
[0173]隨機取上述轉化獲得的HUll-MC菌株和HU11-MC5/C3菌株各50個，提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，以PEP4-5U和PEP4-3D為引物進行PCR分析，同時以多形漢遜酵母HUl I基因組作為對照。
[0174]PCR分析表明，用片段C直接轉化獲得的轉化菌株中有15%的菌株中片段C替換了原始菌株染色體上PEP4基因內部序列，另有85%的菌株中片段C插入到染色體上其他的位點，PEP4沒有受到影響(即發生了非同源重組)，因此同源重組率為15% ;而以DNA片段C5和C3同時轉化進行的斷裂篩選標記法獲得的轉化菌株中有50%的菌株中片段C替換了原始菌株染色體上PEP4基因內部序列，另有50%的菌株中片段C插入到染色體上其他的位點，即斷裂篩選標記法的同源重組率為50%。
[0175]將HUl1-MC菌株和HUl 1-MC5/C3菌株中發生正確同源重組的菌株統一命名為HU-p印4-MC。
[0176](十)PEP4基因的無篩選標記敲除
[0177]1、將HU-pep4-MC接種于ImL無菌水中制成菌懸液，然后涂布在YEPM平板上，37°C靜置培養2-3天。將YEPM平板上出現的單菌落挑于ImL無菌水，各取一接種環的菌懸液點于YEH)和含100 μ g/mL Zeocin的YEH)培養基平板上，同時以多形漢遜酵母HUll和步驟(九)得到的HU-p印4-MC分別為對照。
[0178]結果所有菌均能在YEro平板上正常生長，在含100 μ g/mL Zeocin的YEH)培養基上只有步驟(九)得到的HU-p印4-MC能夠生長，說明步驟(九)得到的HU-p印4-MC經過YEPM培養后都失去了 Zeocin抗性。
[0179]2、利用引物PEP4-5U和PEP4-3D，對步驟I中YEPM平板上出現的單菌落進行PCR分析，同時以多形漢遜酵母HUll和步驟(九)得到的HU-pep4-MC為對照。
[0180]結果從菌株HUll中擴增到2.8kb的DNA片段、從菌株HU-pep4_MC中擴增到6.5kb的DNA片段、而從步驟(九)得到的HU-pep4-MC經過YEPM培養出現的單菌落中擴增到3.1kb的DNA片段。
[0181]分別對2.Skb和3.1kb的DNA片段進行序列分析，發現二者有相同的5’端序列和3’端序列，但中間序列出現差異，存在于2.8kb DNA片段的約IOObp中間序列在3.1kb的DNA片段中不存在，3.1kb的DNA片段中該序列被380bp的CYClTT替換，將此類菌株命名為HU_pep4_C0
[0182]對菌株HU-p印4-MC、HUll和HU-ρ印4-C的PCR分析結果如圖4所示。
[0183]圖4中，I為以HU-p印4-C基因組為模板的PCR結果(3.lkb)，2為以HU-ρ印4-MC基因組為模板的PCR結果(6.5kb)，3為以HUll基因組為模板的PCR結果(2.8kb)，M為DNAmarkerο
[0184]三、按文獻(BaeJ H, Sohn JH, Rhee SK, Choi ES.Cloning andcharacterization of the Hansenula polymorpha PEP4gene encoding proteinaseA.Yeast, 2005, 22:13-19)所述的方法測定蛋白酶A的活性。
[0185]蛋白酶A能夠切割羧肽酶Y前體，產生有活性的羧肽酶Y，羧肽酶Y降解底物N-苯甲酰-L-酪氨酸-P-硝基苯胺使其呈現黃色，生成物在415nm有光吸收。
[0186]測定方法如下:
[0187]將HU-p印4-C以及HU-p印4-MC和HUl I在5mL YEPD液體培養基中培養至0D600值為3.0。取Iml各培養液5000rpm離心5分鐘收集菌體，分別用無菌水和Tris-HCl (pH7.5)洗滌菌體，然后將菌體重懸于50 μ L2.5mg/mL N-苯甲酰-L-酪氨酸-p-硝基苯胺(溶于二甲基甲酰胺中)和200 μ L ρΗ7.5的Tris-HCl溶液中。37°C，200rpm搖床培養10小時，各取200 μ L上清于96孔板中，以不加酵母細胞的反應液為對照調零，于415nm檢測各上清的吸光值，每組設三個平行，結果取平均值。結果如表1所示。
[0188]表1蛋白酶A活性測定結果
[0189]
【權利要求】
1.一種用于對多形漢遜酵母中目的基因進行敲除的DNA片段組，由DNA片段甲和DNA片段乙組成； 沿著5’端至3’端的方向，DNA片段甲的結構為:目的基因5’端序列一m — mazF表達盒一抗性篩選標記基因表達盒部分片段A ; 沿著5’端至3’端的方向，DNA片段乙的結構為:抗性篩選標記基因表達盒部分片段B—η一目的基因3’端序列； 抗性篩選標記基因表達盒是用于篩選重組多形漢遜酵母菌的； mazF表達盒能夠在重組多形漢遜酵母菌中表達mazF蛋白； 抗性篩選標記基因表達盒部分片段A為抗性基因表達盒的一部分片段，不是完整的抗性篩選標記基因表達盒，其從抗性篩選標記基因表達盒的5’末端開始至抗性篩選標記基因表達盒的中間某個堿基處結束；抗性篩選標記基因表達盒部分片段B為抗性篩選標記基因表達盒的一部分片段，不是完整的抗性篩選標記基因表達盒，其從抗性篩選標記基因表達盒的中間某個堿基開始至抗性篩選標記基因表達盒3’末端結束；抗性篩選標記基因表達盒部分片段A的3’端與抗性篩選標記基因表達盒部分片段B的5’端有部分重疊序列，該部分重疊序列供DNA片段甲和DNA片段乙發生同源重組從而在漢遜酵母細胞內形成完整的抗性篩選標記基因表達盒； mazF表達盒中的啟動子是甲醇誘導的MOXp啟動子； mazF的氨基酸序列是如SEQ ID N0.2所示； m和η為如下中的任一種: (1)m 為 CYClTT 序列，η 為 CYClTT 序列； CYClTT的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示； (2)m為空白序列，η為目的基因5’端上游序列； (3)m為目的基因3’端下游序列，η為空白序列； (4)m為空白序列，η為目的基因5’端序列； (5)m為目的基因3’端序列，η為空白序列。
2.根據權利要求1所述的DNA片段組，其特征在于:所述抗性篩選標記基因為Zeocin抗性基因。
3.根據權利要求1或2所述的DNA片段組，其特征在于:所述mazF表達盒的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所示； 所述抗性篩選標記基因表達盒部分片段A的核苷酸序列為如SEQ ID N0.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示； 所述抗性篩選標記基因表達盒部分片段B的核苷酸序列為如SEQ ID N0.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示。
4.一種敲除多形漢遜酵母中一個目的基因的方法，包括如下步驟:將權利要求1-3中任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起轉入多形漢遜酵母中，通過所述抗性篩選標記進行抗性篩選獲得重組酵母；將所述重組酵母進行甲醇誘導培養，得到目的重組菌，目的重組菌中所述目的基因被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失。
5.一種敲除多形漢遜酵母中多個目的基因的方法，包括如下步驟: (I)敲除宿主多形漢遜酵母中的目的基因A:按照權利要求4所述的方法敲除多形漢遜酵母中的目的基因A，將所得重組菌記作重組菌A; (2)敲除宿主多形漢遜酵母中的目的基因B: 再將權利要求1-3中任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起轉入重組菌A中，通過所述抗性篩選標記進行抗性篩選獲得重組酵母；將所述重組酵母進行甲醇誘導培養，得到目的重組菌，目的重組菌中所述目的基因B和目的基因A均被敲除、所述抗性篩選標記基因表達盒丟失、所述mazF表達盒丟失； 所述步驟(1)中的權利要求4所述的方法中的DNA片段組與所述步驟(2)中的DNA片組不同時含有CYClTT序列。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述CYClTT的序列如SEQ ID N0.1中自.5’末端起第13位至第383位核苷酸所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103667274SQ201310665134
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】何秀萍, 宋盼盼, 郭雪娜, 劉莎, 張博潤 申請人:中國科學院微生物研究所