一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑，該試劑通過對等溫環介導擴增所使用的引物組中的前內引物標記一種抗原同時對后內引物標記另一種抗原，能夠在擴增嗜肺軍團菌特異性目的基因的同時對該基因進行標記。標記后使用配套的膠體金試紙能夠快速檢測目的基因的擴增產物，從而檢測嗜肺軍團菌。本發明的檢測試劑操作簡單快速、特異性強、靈敏度高。
【專利說明】—種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑【技術領域】
[0001]本發明涉及一種應用于核酸檢測的試劑，具體講，涉及一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑。
【背景技術】
[0002]1976年美國費城退伍軍人協會會員中曾爆發急性發熱性呼吸道疾病，參加者中超過200人發生肺炎，其中34人遇難。經研究，發現一種細菌命名為嗜肺軍團菌。隨后，許多有關細菌暫被列入這一屬，且追溯研究發現早在1943年即有軍團人員病的病例。現已提出了超過30種軍團桿菌，至少19種是人類肺炎的病原。其中最常見病原體為嗜肺軍團菌(占病例的85%~90%)，這次事件反映了嗜肺軍團菌并非小面積的人與人的傳染。加強水資源管理及人工輸水管道和設施的消毒處理，防治軍團菌造成空氣和水源污染，是預防軍團菌病擴散的重要措施，嗜肺軍團菌的快速檢測對該疾病的防控具有重要的意義。
[0003]環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification)是一種新型的核酸檢測技術，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下,在60°C~65°C恒溫擴增，60分鐘左右即可實現IO9~IOltl倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強等特點。該技術的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應。其擴增結果可以通過凝膠電泳、肉眼觀察焦磷酸鎂沉淀或加入熒光物質后的顏色改變來做初步的判斷。但該方法也有一定的缺陷，主要表現在擴增結果檢測環節，凝膠電泳檢測容易造成污染，焦磷酸鎂沉淀檢測靈敏度較差，熒光物質變色方法受到熒光物質的成本或者需要使用檢測儀器的限制。因此，在產物檢測環節的限制，影響了該技術的推廣應用。
[0004]本發明公開了一種新型的等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑。該方法具有本發明的相對傳統環介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優勢。

【發明內容】

[0005]本發明的首要發明目的在于提供一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑。
[0006]本發明的第二發明目的在于提供一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測方法。
[0007]本發明的第三發明目的在于提供這種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑盒的應用。
[0008]發明的主要技術方案為:
1.等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑的組成為:
(O核酸恒溫標記擴增反應試劑
核酸恒溫擴增反應液中含有前外引物、后外引物、前促環引物、后促環引物、前內引物、后內引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如'Bst DNA聚合酶等)、MgSO4、無菌雙蒸水以及環介導等溫擴增的緩沖液。
[0009]環介導等溫擴增的緩沖液的最終工作濃度為20 mM Tris-HClUO mMKClUO mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4 以及質量濃度為 0.1% Triton X-100，緩沖液的 pH 值為 8.8。
[0010]其中前外引物、后外引物、前促環引物、后促環引物、前內引物、后內引物均為人工合成的脫氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:1、后外引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2、前促環引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:3、后促環引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:4、前內引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:5、后內引物的核苷酸序列為SEQ IDN0:6，上述引物分別與待測基因的相應位置互為反義互補序列，上述引物能夠在等溫條件下以環介導的方式檢測待測基因。將前內引物的5’端標記上生物素基團，將后內引物的5’端標記上異硫氰酸熒光素基團。
[0011]各引物的具體核苷酸序列如下:
SEQ ID NO:1 5’ - AAGATGAAATTGGTGACTGCAGC -3’，
SEQ ID NO:2 5’ - AGCAGTACGTTTTGCCATCA -3’，
SEQ ID NO:3 5’ - CCGATGCCACATCATTAGCTACAGACA -3’，
SEQ ID NO:4 5’ - TTGGCTTTAACCGAACAGCA -3’，
SEQ ID NO:5 5’ - TCGGCACCAATGCTATAAGACAACTAATGTCAACAGCAATGGCTGC -3’，
SEQ ID NO:6 5’ - GGCTAAAGGCATGCAAGACGTTTCTGAAACTTGTTAAGAACG -3’。
[0012](2)標記核酸膠體金檢測試紙條
該試紙條的組成包括樣品墊、金膠墊、醋酸纖維素膜(膜上由相應的抗體組成的檢測線和質控線)和吸水墊等，具體組成參見附圖1。該膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。
[0013]2.使用等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑的具體步驟為:
(I)將待檢測的DNA溶液，加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中；在對照PCR管中分別加入陽性對照試劑和陰性對照試劑，將上述PCR管在60~65°C下擴增反應30~60分鐘，優選條件為62°C下擴增反應60分鐘。
[0014](2)利用標記核酸膠體金檢測試紙條，檢測PCR管中反應后的核酸擴增產物。
[0015]下面對本發明的技術方案作進一步的解釋和說明:· 等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑能夠在60~65°C下將嗜肺軍團菌的DNA進行擴增，在擴增的同時，由于前內引物和后內引物分別標記有生物素基團和異硫氰酸熒光素基團，因此在DNA擴增產物上同時含有生物素基團和異硫氰酸熒光素基團。
[0016]上述擴增產物滴加在核酸膠體金檢測試紙條的樣品墊上，在層析作用下，擴增產物在經過金膠墊時雙標記的核酸擴增產物由于攜帶有生物素基團和異硫氰酸熒光素基團，因此能夠和標記有金顆粒的抗生物素抗體結合形成核酸抗體復合物；核酸抗體復合物在醋酸纖維素膜上層析，經過檢測線時該復合物由于帶有異硫氰酸熒光素基團，因此能夠和檢測線上的抗異硫氰酸熒光素抗體結合，形成復合物，該復合物由于攜帶有有色的標記物(納米金顆粒呈紅色)，此時檢測線呈現紅色；當核酸抗體復合物或者單獨的標記抗生物素抗體經過質控線時，由于質控線上含有能夠結合抗生物素抗體的二抗，所以只要有標記的抗生物素抗體層析至質控線，無論該抗體是否結合有標記的核酸，均能夠形成二抗和標記抗體的復合物，該復合物由于攜帶有有色的標記物(納米金顆粒呈紅色)，此時質控線呈現紅色。
[0017]本發明的相對傳統環介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優勢。首先，本發明的新型恒溫環介導核酸標記檢測試劑，使用標記的引物，使得環介導等溫擴增后，擴增產物攜帶了兩種抗原標記物。這樣的雙標記核酸擴增產物，能夠被制備好的膠體金試紙條檢測出來。當含有雙標記擴增產物的樣本在膠體金試紙上層析時，雙標記產物能夠結合攜帶有有色顆粒標記的抗體，在檢測線上呈現紅色，這樣目的擴增產物可以通過試紙上檢測線的顏色改變顯示出來。即使有很少的擴增產物也能夠進行準確的檢測，因此有效地提高了檢測靈敏度。其次，檢測反應的結果通過膠體金檢測試紙的檢測線得到，相對于濁度觀察法和熒光燃料變色法讀取結果更加準確，避免了由于檢驗人員主觀判斷帶來的結果偏差。上述檢測方法擴大了該檢測試劑的應用范圍，使之可以廣泛應用于野外現場等特殊環境。此方法操作簡單、時間短，同時也降低了檢測成本，使得檢測結果更加快速、可靠，具有免疫與核酸診斷試劑各自的優點。該技術由于操作簡單、快速、低廉的成本和防止核酸擴增物對實驗室的污染，對于病原體的檢測具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]附圖1膠體金試紙條的組成。
[0019]該試紙條的組成包括樣品墊(I)、金膠墊(2 )、醋酸纖維素膜(3 )、質控線(4 )、檢測線(5)和吸水墊(6)。該膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。
[0020]附圖2嗜肺軍團菌標記擴增檢測結果
加入的擴增DNA模板如下，I號條為嗜肺軍團菌DNA模板標準品其中含目的基因約IO5拷貝；2號條為嗜肺軍團菌DNA模板標準品其中含目的基因約10°拷貝；3號條為待測樣品；4號條為肺炎鏈球菌DNA模板標準品；5號條為加入的雙蒸水進行陰性對照。
[0021]下面結合具體實施例，進`一步詳細地闡述本發明。
【具體實施方式】
[0022]本發明的【具體實施方式】僅對本發明做進一步的解釋和說明，并不對本發明的內容進行限制。
[0023]實施例1:嗜肺軍團菌DNA基因組梯度稀釋標記擴增檢測
取濃度已知的嗜肺軍團菌DNA基因組對其進行10倍梯度稀釋，稀釋至嗜肺軍團菌DNA中的目的基因終濃度為10°拷貝/ μ L，取嗜肺軍團菌DNA模板標準品制備的陽性參照物，陰性參照物，以及嗜肺軍團菌DNA梯度稀釋液(在PCR管中嗜肺軍團菌特異性目的基因的終濃度分別為IO3拷貝、IO2拷貝、IO1拷貝和10°拷貝)，做為模板進行標記擴增檢測。
[0024]等溫擴增中的各組分構成比例如下:
【權利要求】
1.一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑，其特征在于，所述的檢測試劑包括嗜肺軍團菌等溫環介導核酸標記擴增反應液，該反應液中含有前外引物、后外引物、前促環引物、后促環引物、5’端標記生物素基團的前內引物、5’端標記異硫氰酸熒光素基團的后內引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如M DNA聚合酶)、MgSO4、無菌雙蒸水以及環介導等溫擴增的緩沖液。
2.根據權利要求1所述的一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑，其特征在于，使用的前外引物、后外引物、前促環引物、后促環引物、前內引物和后內引物的序列如下:
SEQ ID NO:1 5’ - AAGATGAAATTGGTGACTGCAGC -3’，
SEQ ID NO:2 5’ - AGCAGTACGTTTTGCCATCA -3’，
SEQ ID NO:3 5’ - CCGATGCCACATCATTAGCTACAGACA -3’，
SEQ ID NO:4 5’ - TTGGCTTTAACCGAACAGCA -3’，
SEQ ID NO:55 - TCGGCACCAATGCTATAAGACAACTAATGTCAACAGCAATGGCTGC -3’ ，
SEQ ID NO:6 5’ - GGCTAAAGGCATGCAAGACGTTTCTGAAACTTGTTAAGAACG -3’。
3.根據權利要求1所述的一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑，其特征在于，使用該試劑，能夠在擴增目的基因的同時將擴增產物DNA上標記生物素基團和異硫氰酸熒光素基團。
4.根據權利要求1所述的一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑，其特征在于，將提取得到的待測D`NA溶液作為擴增模板加入到裝有核酸恒溫標記擴增反應液的PCR管中，在60~65°C下擴增反應30~60分鐘，優選62°C下擴增反應60分鐘。
5.一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑所使用的膠體金檢測試紙，其特征在于，膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。
6.根據權利要求4所述的一種新型等溫環介導嗜肺軍團菌核酸標記檢測試劑所使用的膠體金檢測試紙，其特征在于，將待測標記擴增產物滴加在檢測試紙的樣品墊上，當檢測線和質控線都呈現紅色時表明DNA樣品中含有嗜肺軍團菌的待測基因，當檢測線無色而質控線呈現紅色表明DNA樣品中不含有嗜肺軍團菌的待測基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667501SQ201310736719
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】關淳, 王馨, 祁軍, 左鋒, 劉寅, 韓靜娜, 姜智賢, 葉正 申請人:天津國際旅行衛生保健中心