一種從貧營養水體沉積物分離異養型氨氧化微生物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從貧營養水體沉積物篩選異養型氨氧化微生物的方法。a、取潔凈河流底層沉積物的表面沉積物，經過隔除和沉淀后，放入序批式反應器中進行富集，經過富集培養得到含有馴化菌群的預培養液；b、從預培養液取出液體，分離純化富集培養液體中的微生物；c、異養氨氧化活性實驗：采用專性液體培養基對步驟（b）分離純化富集培養的微生物進行氨氮降解活性測定，挑選在培養2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株；d、對步驟（c）獲得的高效菌株進行再分離純化富集培養，由此得到異養型氨氧化微生物。
【專利說明】一種從貧營養水體沉積物分離異養型氨氧化微生物的方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于環保【技術領域】，具體涉及一種從貧營養水體沉積物分離異養型氨氧化微生物的方法。
【背景技術】:
[0002]異養氨氧化微生物是近年來被廣泛關注的新型氨氧化微生物群體，異養氨氧化的基本原理是此類微生物在好氧條件下同時轉化氨氮、有機物為氮氣與二氧化碳等，以達到同時降解河流中氨氮與有機物的功能。氮元素循環是地球元素循環的主要途徑之一，當含氮污染物被分解后，將進入氮循環的第一步核心環節:氨氧化過程。但傳統理論認為的自養氨氧化過程型微生物驅動，往往受有機物的存在而嚴重抑制，導致河流氮污染情況的加劇。然而在自然環境下有機物的不規律出現會影響異養氨氧化微生物的代謝，缺乏碳源條件下可能導致多數。近年來，隨著人們對自然水體氮循環系統的深入研究，認識到在自然沉積物存在豐富的好氧氨氧化微生物，存在一大類耐貧營養型的異養氨氧化微生物，在缺乏碳源存在條件下，此類微生物可長期休眠，而當滿足條件時，進行異養氨氧化作用。此類微生物的發掘對菌劑的研發，拓寬異養氨氧化微生物應用的前景乃至環境工程具有重要的意義。
[0003]由于以往對自然界異養氨氧化過程的忽視，導致其微生物功能大大被低估。應用異養氨氧化技術的一個關鍵前提就是新的研發篩選方法。從自然界河流等水體的沉積物所篩選的土著異養氨 氧化微生物，經過專性的篩選方法，可達到分離出耐貧營養型的異養氨氧化微生物的目的。

【發明內容】
:
[0004]本發明的目的是提供一種能夠獲取耐貧營養型異養氨氧化菌株的從貧營養水體沉積物篩選異養氨氧化微生物的方法。
[0005]本發明的從貧營養水體沉積物篩選異養型氨氧化微生物的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a、取潔凈河流底層沉積物的表面沉積物，經過隔除和沉淀后，放入序批式反應器中進行富集，經過富集培養得到含有馴化菌群的預培養液；
[0007]b、從預培養液取出液體，分離純化富集培養液體中的微生物；
[0008]C、異養氨氧化活性實驗:采用專性液體培養基對步驟(b)分離純化富集培養的微生物進行氨氮降解活性測定，挑選在培養2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株；
[0009]d、對步驟(C)獲得的高效菌株進行再分離純化富集培養，由此得到異養型氨氧化微生物。
[0010]對于步驟(d)所分離純化富集培養的菌株可以接種到M4液體培養基中，靜置培養2個月，再重復步驟(c)的異養氨氧化活性實驗，挑選在培養2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到異養型氨氧化微生物；[0011]M4液體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入NaHCO30.2g，KH2PO40.1g,CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g 和 NaCl 0.04g,用 NaHCO3 調節 pH 到7-8。
[0012]所述的步驟(a)的放入序批式反應器中進行富集，經過富集培養得到含有馴化菌群的預培養液，具體優選為:首先將經過隔除和沉淀后的表面沉積物預曝氣5min，按泥水質量比1:1放入序批式反應器進行富集，反應器第一階段加入MO液體培養基，培養2~4周，第一階段反應器停留時間3-4天，培養溫度為25°C，用碳酸氫鈉調節維持pH6-7之間，無需曝氣，培養第一階段觀察培養基澄清，沉積物絮狀成團后轉入第二階段培養，逐漸置換Ml液體培養基序批式培養，培養6周，第二階段停留時間5-7天，培養溫度為20°C，用碳酸氫鈉調節維持PH7-8之間，無需曝氣，經過培養得到含有馴化菌群的預培養液；
[0013]MO液體培養基，每升是這樣配制的:在IL抽濾滅菌后河水中加入NH4Cl 0.1g和葡萄糖 0.5g，COD 控制在 500mg/L, pH6_7 之間；
[0014]Ml液體培養基，每升是這樣配制的:在IL抽濾滅菌后河水中加入NH4Cl 0.1g,葡萄糖 0.5g, NaHCO30.2g, KH2PO40.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g和NaCl 0.04g,用NaHCO3調節pH到7_8左右，每升培養基加入Iml微量元素培養基，每升微量元素培養基中含有:FeS04, 5g ；EDTA, 15g;ZnS04.7Η20, 0.43g;CoC12.6Η20,.24g;MnCl2.4H20, 0.99g;CuSO4 *5H20, 0.25g;NaMoO4 *2H20, 0.22g;NiCl2 *6H20, 0.19g;NaSeO4.1OH2O, 0.21g;和H3BO4, 0.014g，余量為水。
[0015]所述的步驟(b)和步驟(d)的分離純化富集培養，其具體步驟優選為:采用稀釋法對微生物稀釋后，涂平板進行分離，涂布平板的培養基為M2固體培養基，經培養后，采用平板劃線分離，劃線平板的培養基為M2固體培養基，再經培養后，完成對微生物的分離純化
富集培養；
[0016]所述的M2固體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入瓊脂20g、NH4Cl 0.lg、葡萄糖 0.5g、NaHCO30.2g、KH2PO40.lg、CaCl2.2H20 0.04g 和 MgSO4.7H20 0.0.82g。
[0017]所述的步驟(c)的氨氮降解活性測定優選為:以步驟(b)的微生物作為受試菌體，在試管中按體積加入1%受試菌體，加入滅菌后的M3液體培養基，管口加上九層紗布或透氣棉篩，培養條件為25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，搖床轉速150rpm條件下培養，測定C0D、TOC與氨氮降解率，挑選在培養2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物；
[0018]M3液體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg、葡萄糖0.5g，NaHCO30.2g, KH2PO40.lg，CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7Η20 0.0.82g，KCl 0.04g，NaCl 0.04g,用NaHCO3調節pH到7左右。
[0019]本發明的從貧營養水體沉積物篩選異養型氨氧化微生物的方法具有以下優勢:(O能夠獲取耐貧營養型異養型氨氧化菌株，在貧營養時期存活；(2)所獲菌株來源于自然水體，具有安全性、環境友好性與經濟性的優點。(3)所獲取菌株能同時降解有機物與水體
氨氮，無需曝氣。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1是序批式反應器的結構示意圖；
[0021]圖2是實施例1所篩選的異養型氨氧化微生物的氨氮去除率和TOC降解曲線。【具體實施方式】:
[0022]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0023]實施例1:
[0024](I)取河源新豐江底層沉積物表面(5-lOcm)沉積物100g，經過常規的隔除和去除沙粒、沉淀后，預曝氣5min，按泥水質量比1:1放入序批式反應器進行富集，反應器第一階段加入MO液體培養基，培養2周，第一階段反應器停留時間3-4天，培養過程目標是1.利用培養基脅迫菌群變化，初步使氨氧化微生物富集；2.篩除非貧營養型氨氧化微生物，馴化裝置(序批式反應器)的結構如圖1所示，培養溫度為25°C，用碳酸氫鈉調節維持pH6-7之間，無需曝氣，培養第一階段觀察培養基澄清，沉積物絮狀成團后轉入第二階段培養。逐漸置換Ml液體培養基序批式培養。培養6周，第二階段停留時間5-7天，培養溫度設定為20°C，用碳酸氫鈉調節為pH7-8之間，無需曝氣，經過培養得到含有馴化菌群的預培養液。此過程逐漸采用氨氮與有機物脅迫，讓耐貧營養型的異養氨氧化微生物逐步成為懸浮體系的主體，加快富集的時間。
[0025](2)從預培養體系中取IOml菌液，采用稀釋法將菌液稀釋至到10_5_10_6比例，涂平板進行分離，涂布平板的培養基為M2固體培養基，25°C培養2天后，再采用平板劃線分離，劃線平板的培養基為M2固體培養基，進行3天富集培養后，得到富集后的菌種，所得菌種進行下一步異養氨氧化活性實驗，測定其活性。
[0026](3)對上一階段所分離的富集后的菌種進行異養型氨氧化活性測定，具體為:在試管中按體積加入1%受試菌體，加入滅菌后的M3液體培養基，管口加上九層紗布或透氣棉篩，培養條件為25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，搖床轉速150rpm條件下培養72小時，測定COD、TOC與氨氮降解率，降解率超過80%以上，為具有異養氨氧化活性，即獲得高效菌株。
[0027](4)對所獲得的高效菌株按照步驟(2)的方法進行再富集培養，富集培養后的菌種轉入M4液體培養基中，靜置培養`2個月，再進行異養型氨氧化活性測定，具體步驟同步驟(3)，測定COD、TOC與氨氮降解率，降解率超過80%以上，獲得具有耐貧營養型的異養型氨氧化微生物。篩選獲得氨氮降解率為80%，TOC降解率100%的菌株I株，名為(Stenotrophomonas maltophilia DJlX
[0028]所篩選得到的異養型氨氧化微生物的第一階段氨氮、TOC降解曲線如圖2所示。
[0029]MO液體培養基，每升是這樣配制的:在IL抽濾滅菌后河水(本底氨氮0.14mg/L,C0D20mg/L以下)中加入NH4Cl 0.1g和葡萄糖0.5g，COD控制在500mg/L左右，pH6_7之間。滅菌備用。
[0030]Ml液體培養基，每升是這樣配制的:在IL抽濾滅菌后河水中加入NH4Cl 0.1g,葡萄糖 0.5g, NaHCO30.2g, KH2PO40.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g 和NaCl 0.04g,用NaHCO3調節pH到7_8左右，每升培養基加入Iml微量元素培養基，每升微量元素培養基中含有:FeS04, 5g;EDTA, 15g;ZnS04.7Η20, 0.43g;CoC12.6Η20,.24g;MnCl2.4Η20，0.99g;CuSO4.5Η20, 0.25g;NaMoO4.2Η20, 0.22g;NiCl2.6Η20, 0.19g;NaSeO4.IOH2O, 0.21g;andH3BO4, 0.014g，余星為水。滅囷備用。
[0031]M2固體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入瓊脂20g、NH4Cl 0.lg、葡萄糖
0.5g、NaHCO30.2g、KH2PO40.lg、CaCl2.2H20 0.04g 和 MgSO4.7H20 0.0.82g。滅菌備用。[0032]M3液體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg、葡萄糖0.5g，NaHCO30.2g, KH2PO40.lg，CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7Η20 0.0.82g，KCl 0.04g，NaCl 0.04g,用NaHCO3調節pH到7左右。滅菌備用。
[0033]M4液體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入NaHCO30.2g，KH2PO40.1g,CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g 和 NaCl 0.04g,用 NaHCO3 調節 pH 到7-8左右。滅菌備用。
[0034]實施例2: [0035](I)取河源東江段底層沉積物表面(4-8cm)沉積物300g，經過常規的隔除和沉淀后，預曝氣5min，按泥水質量比1:1放入序批式反應器進行富集，反應器第一階段加入MO液體培養基，培養4周，第一階段反應器停留時間3天，培養溫度為25°C，用碳酸氫鈉調節為PH6-7之間，無需曝氣，培養第一階段觀察培養基澄清，沉積物絮狀成團后轉入第二階段培養。然后逐漸置換Ml液體培養基序批式培養。培養6周，第二階段停留時間5-7天，培養溫度為20°C，用碳酸氫鈉調節為pH7-8之間，無需曝氣，經過培養得到含有馴化菌群的預培養液。
[0036](2)從預培養液中取20ml菌液，采用稀釋法將培養菌液稀釋至到10_5_10_6比例，涂平板進行分離，涂布平板的培養基為M2固體培養基，25°C培養2天后，采用平板劃線分離，劃線平板的培養基為M2固體培養基，進行3天富集培養后，得到富集后的菌種，所得菌種進行下一步異養氨氧化活性實驗，測定其活性。
[0037](3 )對上一階段所分離的富集后的菌株進行異養型氨氧化活性測定，具體為:在試管中按體積加入1%受試菌體，加入滅菌后的M3液體培養基，管口加上九層紗布或透氣棉篩，培養條件為25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，搖床轉速150rpm條件下培養48小時，測定COD、TOC與氨氮降解率，降解率超過80%以上，為具有異養氨氧化活性，即獲得高效菌株。
[0038](4)對所獲得的高效菌株按照步驟(2)的方法進行再富集培養純化，獲得氨氮降解率超過80%以上，具有耐貧營養型異養氨氧化微生物5株，經測序，比對其中的兩株為Lysobacter brunescens、Aeromonas hydrophila。
[0039]所述的MO液體培養基、Ml液體培養基、M2固體培養基和M3液體培養基同實施例1o
【權利要求】
1.一種從貧營養水體沉積物篩選異養型氨氧化微生物的方法，其特征在于，包括以下步驟: a、取潔凈河流底層沉積物的表面沉積物，經過隔除和沉淀后，放入序批式反應器中進行富集，經過富集培養得到含有馴化菌群的預培養液； b、從預培養液取出液體，分離純化富集培養液體中的微生物； C、異養氨氧化活性實驗:采用專性液體培養基對步驟(b)分離純化富集培養的微生物進行氨氮降解活性測定，挑選在培養2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株； d、對步驟(C)獲得的高效菌株進行再分離純化富集培養，由此得到異養型氨氧化微生物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對于步驟(d)所分離純化富集培養的菌株接種到M4液體培養基中，靜置培養2個月，再重復步驟(c)的異養氨氧化活性實驗，挑選在培養2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到異養型氨氧化微生物； 所述的M4液體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入NaHCO30.2g，KH2PO40.1g,CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g 和 NaCl 0.04g,用 NaHCO3 調節 pH 到7-8。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(a)的放入序批式反應器中進行富集，經過富集培養得到含有馴化菌群的預培養液，具體為:首先將經過隔除和沉淀后的表面沉積物預曝氣5min，按泥水質量比1:1放入序批式反應器進行富集，反應器第一階段加入MO液體培養基，培養2~4周，第一階段`反應器停留時間3-4天，培養溫度為25°C，用碳酸氫鈉調節維持PH6-7之間，無需曝氣，培養第一階段觀察培養基澄清，沉 積物絮狀成團后轉入第二階段培養，逐漸置換Ml液體培養基序批式培養，培養6周，第 二階段停留時間5-7天，培養溫度為20°C，用碳酸氫鈉調節維持PH7-8之間，無需曝氣， 經過培養得到含有馴化菌群的預培養液； 所述的MO液體培養基，每升是這樣配制的:在IL抽濾滅菌后河水中加入NH4Cl 0.1g和葡萄糖0.5g, COD控制在500mg/L, pH6_7之間； 所述的Ml液體培養基，每升是這樣配制的:在IL抽濾滅菌后河水中加入NH4Cl 0.1g,葡萄糖 0.5g, NaHCO30.2g, KH2PO40.lg, CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.0.82g, KCl 0.04g和NaCl 0.04g,用NaHCO3調節pH到7_8左右，每升培養基加入Iml微量元素培養基，每升微量元素培養基中含有:FeS04, 5g ；EDTA, 15g;ZnS04.7Η20, 0.43g;CoC12.6Η20,.24g;MnCl2.4H20, 0.99g;CuSO4 *5H20, 0.25g;NaMoO4 *2H20, 0.22g;NiCl2 *6H20, 0.19g;NaSeO4.1OH2O, 0.21g;和H3BO4, 0.014g，余量為水。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)和步驟(d)的分離純化富集培養，其具體步驟為:采用稀釋法對微生物稀釋后，涂平板進行分離，涂布平板的培養基為M2固體培養基，經培養后，采用平板劃線分離，劃線平板的培養基為M2固體培養基，再經培養后，完成對微生物的分離純化富集培養； 所述的M2固體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入瓊脂20g、NH4Cl 0.lg、葡萄糖 0.5g、NaHCO30.2g、KH2PO40.lg、CaCl2.2H20 0.04g 和 MgSO4.7H20 0.0.82g。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(c)的異養氨氮降解活性測定為:以步驟(b)的微生物作為受試菌體，在試管中按體積加入1%受試菌體，加入滅菌后的M3液體培養基，管口加上九層紗布或透氣棉篩，培養條件為25°C，pH7，溶解氧不低于2mg/L，搖床轉速150rpm條件下培養，測定COD、TOC與氨氮降解率，挑選在培養2_3天后氨氮降解效率60%以上的微生物； 所述的M3液體培養基，每升是這樣配制的:在IL水中加入NH4Cl 0.lg、葡萄糖0.5g，NaHCO30.2g, KH2PO40.lg，CaCl2.2H20 0.04g, MgSO4.7Η20 0.0.82g，KCl 0.04g，NaCl 0.04g,用NaHCO3調節pH到7左右`。
【文檔編號】C12N1/02GK103773715SQ201310738232
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】鐘玉鳴, 許玫英, 郭俊, 孫國萍, 潘國平, 連英麗 申請人:廣東省微生物研究所