一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，該方法包括制備藥敏培養(yǎng)基；用注射用水分別配制獸藥的液體制劑和固體制劑；對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備；在藥敏試驗(yàn)管加入中MH肉湯和獸藥制劑，再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品，充分混勻，進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)。本發(fā)明的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，對(duì)以多重耐藥的細(xì)菌性混合感染為主的動(dòng)物疫情，能及時(shí)篩選出理想的抗菌藥物，操作簡(jiǎn)便快速、臨床實(shí)用、可定量、重復(fù)性和穩(wěn)定性高，為獸醫(yī)臨床工作者迅速有效控制動(dòng)物疫情提供了新思路。
【專利說明】一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)細(xì)菌性動(dòng)物疫病時(shí)，通常采用細(xì)菌形態(tài)檢查、分離培養(yǎng)、生化鑒定、致病性試驗(yàn)、血清學(xué)檢查等診斷方法，并對(duì)分離菌株進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，一般采用紙片擴(kuò)散法或肉湯稀釋法，前者只能定性檢測(cè)分離的病原細(xì)菌藥敏性，后者能定量檢測(cè)藥物最小殺菌濃度和最小抑菌濃度，但要求條件較高，操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，一般五天以上才能得出確診和藥敏結(jié)果。在藥敏結(jié)果出來前，只能依靠臨床獸醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)判斷治療，由于細(xì)菌耐藥性的廣泛存在，往往導(dǎo)致延誤最佳治療時(shí)間，造成疫情反復(fù)、以致失控，損失巨大。故實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷方法及藥敏試驗(yàn)在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上的價(jià)值受到限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，旨在解決現(xiàn)有的獸藥敏感試驗(yàn)方法要求條件較高，操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)的問題。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法包括以下步驟:
[0005]步驟一、制備藥敏培養(yǎng)基；
[0006]步驟二、用注射用水分別配制獸藥的液體制劑和固體制劑；
[0007]步驟三、對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備；
[0008]步驟四、在藥敏試驗(yàn)管加入中MH肉湯和獸藥制劑，再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品，充分`混勻，進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)。
[0009]進(jìn)一步，步驟一所述的制備藥敏培養(yǎng)基的方法具體步驟如下:
[0010]選擇杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的《細(xì)菌干粉培養(yǎng)基》即MH肉湯，產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):YZB/浙0660-2009，培養(yǎng)基成分符合GB4789-28的要求，外觀為細(xì)粉末狀，產(chǎn)品批號(hào)在有效期內(nèi)，PH7.4 ;準(zhǔn)確稱取干粉培養(yǎng)基36g，加入到1000ml蒸餾水中，煮沸充分溶解，補(bǔ)足水分，過濾、準(zhǔn)確分裝到小試管，每管5ml ;121°C滅菌30min后，再進(jìn)行37°C 20h培養(yǎng)，無菌檢驗(yàn)合格的放入4°C冰箱備用。
[0011]進(jìn)一步，步驟二所述的液體制劑的配制的具體方法如下:
[0012]試驗(yàn)選用液體獸藥制劑的治療劑量為0.2ml/kgBff,以MH肉湯培養(yǎng)液5ml代表lkgBW，在5ml MH肉湯培養(yǎng)液中加入試驗(yàn)獸藥原液Iul ;操作時(shí)，用微量移液器先在無菌小試管中加入900ul注射用水，再準(zhǔn)確吸取IOOul試驗(yàn)獸藥原液，放入其中，充分混勻，再吸取IOul藥液放入MH肉湯培養(yǎng)液5ml試驗(yàn)管中。
[0013]進(jìn)一步，步驟二所述的固體制劑的配制的具體方法如下:
[0014]采用頭孢噻呋鈉粉針，治療劑量是3mg/kgBW，在5ml MH肉湯培養(yǎng)液中加入15ug頭孢噻呋鈉粉針，操作時(shí)，先在0.5g/瓶中加入IOml注射用水，充分搖勻，用微量移液器準(zhǔn)確吸取30ul的藥液，放入含有970ul注射用水的無菌小試管中，充分搖勻，再準(zhǔn)確吸取IOul的藥液放入MH肉湯培養(yǎng)液5ml即可。
[0015]進(jìn)一步，步驟三所述的對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備具體方法如下:
[0016]對(duì)處于流行早期的典型發(fā)病動(dòng)物，無菌采集2~3份全血，各2~4ml，再將分離的血清混合后作為待檢樣品；對(duì)于流行中期的發(fā)病動(dòng)物群,撲殺典型發(fā)病動(dòng)物2~3頭，無菌采集心包滲出液、或關(guān)節(jié)液、胸腔積液等，每份病料采集I~2ml，混合后作為待檢樣品。
[0017]進(jìn)一步，步驟四所述的進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)的具體方法如下:
[0018]每個(gè)藥敏試驗(yàn)管及對(duì)照管中MH肉湯為5ml，每種獸藥按設(shè)定的劑量配制后，分別加入2支藥敏試驗(yàn)管10ul，以便重復(fù)對(duì)照；再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品10ul，充分混勻；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組各2管，設(shè)不加獸藥及待檢樣品的MH肉湯空白對(duì)照管、不加獸藥而加發(fā)病動(dòng)物待檢樣品IOul的MH肉湯細(xì)菌對(duì)照管。經(jīng)35°C ±2°C培養(yǎng)18小時(shí)，對(duì)比分析結(jié)果，篩選敏感藥物，得出病料細(xì)菌對(duì)各種獸藥的敏感程度。
[0019]進(jìn)一步，所述的獸藥敏感試驗(yàn)管設(shè)高度敏感++++、敏感+++、中度敏感++、低度敏感+、不敏感_，五個(gè)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)；
[0020]“++++”:100%液體完全透明，無細(xì)菌生長(zhǎng)，管底無凝集沉淀物；
[0021 ] “+++”:75%液體透明，有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，略呈混濁，管底有極少量凝集沉淀物；
[0022]“++”:50%液體透明 ，有部分細(xì)菌生長(zhǎng)，中等程度混濁，管底有少量凝集沉淀物；
[0023]“ + ”:25%液體透明，有多量細(xì)菌生長(zhǎng)，明顯混濁，管底有較多凝集沉淀物；
[0024]:100%液體不透明，有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，有明顯凝集沉淀物，振蕩呈均勻混濁。
[0025]進(jìn)一步，設(shè)定的MH肉湯空白對(duì)照管和MH肉湯細(xì)菌對(duì)照管，必須達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn):
[0026]MH肉湯空白對(duì)照管:100%液體完全透明，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)，管底無凝集沉淀物，以“++++” 標(biāo)記。
[0027]MH肉湯細(xì)菌對(duì)照:100%液體不透明，有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，有明顯凝集沉淀物，振蕩時(shí)呈均勻混濁，以標(biāo)記。
[0028]效果匯總
[0029]本發(fā)明的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，對(duì)以多重耐藥的細(xì)菌性混合感染為主的動(dòng)物疫情，能及時(shí)篩選出理想的抗菌藥物，操作簡(jiǎn)便快速、臨床實(shí)用、可定量、重復(fù)性和穩(wěn)定性高，為獸醫(yī)臨床工作者迅速有效控制動(dòng)物疫情提供了新思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0032]圖1示出了本發(fā)明的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法流程，如圖所示，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法包括以下步驟:
[0033]SlOl:制備藥敏培養(yǎng)基；[0034]S102:用注射用水分別配制獸藥的液體制劑和固體制劑；
[0035]S103:對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備；
[0036]S104:在藥敏試驗(yàn)管加入中MH肉湯和獸藥制劑，再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品，充分混勻，進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)。
[0037]進(jìn)一步，步驟SlOl所述的制備藥物培養(yǎng)基的方法具體步驟如下:
[0038]選擇杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的《細(xì)菌干粉培養(yǎng)基》即MH肉湯，產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):YZB/浙0660-2009，培養(yǎng)基成分符合GB4789-28的要求，外觀為細(xì)粉末狀，產(chǎn)品批號(hào)在有效期內(nèi)，PH7.4 ;準(zhǔn)確稱取干粉培養(yǎng)基36g，加入到1000ml蒸餾水中，煮沸充分溶解，補(bǔ)足水分，過濾、準(zhǔn)確分裝到小試管，每管5ml ;121°C滅菌30min后，再進(jìn)行37°C 20h培養(yǎng)，無菌檢驗(yàn)合格的放入4°C冰箱備用。
[0039]進(jìn)一步，步驟S102所述的液體制劑的配制的具體方法如下:
[0040]試驗(yàn)選用液體獸藥制劑的治療劑量為0.2ml/kgBff,以MH肉湯培養(yǎng)液5ml代表lkgBW，在5ml MH肉湯培養(yǎng)液中加入試驗(yàn)獸藥原液Iul ;操作時(shí)，用微量移液器先在無菌小試管中加入900ul注射用水，再準(zhǔn)確吸取IOOul試驗(yàn)獸藥原液，放入其中，充分混勻，再吸取IOul藥液放入MH肉湯培養(yǎng)液5ml的試驗(yàn)管中。
[0041]進(jìn)一步，步驟S102所述的固體制劑的配制的具體方法如下:
[0042]采用頭孢噻呋鈉粉針，治療劑量是3mg/kgBW，在5ml MH肉湯培養(yǎng)液中加入15ug頭孢噻呋鈉粉針，操作時(shí)，先在0.5g/瓶中加入IOml注射用水，充分搖勻，用微量移液器準(zhǔn)確吸取30ul的藥液，放入含有970ul注射用水的無菌小試管中，充分搖勻，再準(zhǔn)確吸取IOul的藥液放入MH肉湯培養(yǎng)液5ml即 可。
[0043]進(jìn)一步，步驟S103所述的對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備具體方法如下:
[0044]對(duì)處于流行早期的典型發(fā)病動(dòng)物，無菌采集2~3份全血，各2~4ml，再將分離的血清混合后作為待檢樣品；對(duì)于流行中期的發(fā)病動(dòng)物群,撲殺典型發(fā)病動(dòng)物2~3頭，無菌采集心包滲出液、或關(guān)節(jié)液、胸腔積液等，每份病料采集I~2ml，混合后作為待檢樣品。
[0045]進(jìn)一步，步驟S104所述的進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)的具體方法如下:
[0046]每個(gè)藥敏試驗(yàn)管及對(duì)照管中MH肉湯為5ml，每種獸藥按設(shè)定的劑量配制后，分別加入2支藥敏試驗(yàn)管10ul，以便重復(fù)對(duì)照；再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品10ul，充分混勻；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組各2管，設(shè)不加獸藥及待檢樣品的MH肉湯空白對(duì)照管、不加獸藥而加發(fā)病動(dòng)物待檢樣品IOul的MH肉湯細(xì)菌對(duì)照管。經(jīng)35°C ±2°C培養(yǎng)18小時(shí)，對(duì)比分析結(jié)果，篩選敏感藥物，得出待檢樣品中細(xì)菌對(duì)各種獸藥的敏感程度。
[0047]進(jìn)一步，所述的獸藥敏感試驗(yàn)管設(shè)高度敏感++++、敏感+++、中度敏感++、低度敏感+、不敏感_，五個(gè)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)；
[0048]“++++”:100%液體完全透明，無細(xì)菌生長(zhǎng)，管底無凝集沉淀物；
[0049]“+++”:75%液體透明，有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，略呈混濁，管底有極少量凝集沉淀物；
[0050]“++”:50%液體透明，有部分細(xì)菌生長(zhǎng)，中等程度混濁，管底有少量凝集沉淀物；
[0051]“ + ”:25%液體透明，有多量細(xì)菌生長(zhǎng)，明顯混濁，管底有較多凝集沉淀物；
[0052]:100%液體不透明，有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，有明顯凝集沉淀物，振蕩呈均勻混濁。
[0053]進(jìn)一步，設(shè)定的MH肉湯空白對(duì)照管和MH肉湯細(xì)菌對(duì)照管，必須達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn):[0054]MH肉湯空白對(duì)照管:100%液體完全透明，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)，管底無凝集沉淀物，以“++++” 標(biāo)記。
[0055]MH肉湯細(xì)菌對(duì)照:100%液體不透明，有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，有明顯凝集沉淀物，振蕩時(shí)呈均勻混濁，以標(biāo)記。
[0056]本發(fā)明的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，對(duì)以多重耐藥的細(xì)菌性混合感染為主的動(dòng)物疫情，能及時(shí)篩選出理想的抗菌藥物，操作簡(jiǎn)便快速、臨床實(shí)用、可定量、重復(fù)性和穩(wěn)定性高，為獸醫(yī)臨床工作者迅速有效控制動(dòng)物疫情提供了新思路。
[0057]上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性的勞動(dòng)即可做`出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法包括以下步驟: 步驟一、制備藥敏培養(yǎng)基； 步驟二、用注射用水分別配制獸藥的液體制劑和固體制劑； 步驟三、對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備； 步驟四、在藥敏試驗(yàn)管加入中MH肉湯和獸藥制劑，再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品，充分混勻，進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)。
2.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，步驟一所述的制備藥敏培養(yǎng)基的方法具體步驟如下: 選擇杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的《細(xì)菌干粉培養(yǎng)基》即MH肉湯，產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):YZB/浙0660-2009，培養(yǎng)基成分符合GB4789-28的要求，外觀為細(xì)粉末狀，產(chǎn)品批號(hào)在有效期內(nèi)，PH7.4 ;稱取干粉培養(yǎng)基36g，加入到1000ml蒸餾水中，煮沸充分溶解，補(bǔ)足水分，過濾、分裝到小試管，每管5ml ;121°C滅菌30min后,再進(jìn)行37°C 20h培養(yǎng),無菌檢驗(yàn)合格的放入4 °C冰箱備用。
3.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，步驟二所述的液體制劑的配制的具體方法如下: 試驗(yàn)選用液體獸藥制劑的治療劑量為0.2ml/kgBff,以MH肉湯培養(yǎng)液5ml代表lkgBW，則在5ml MH肉湯培養(yǎng)液中加入試驗(yàn)獸藥原液Iul ;操作時(shí)，用微量移液器先在無菌小試管中加入900ul注射用水，再吸取IOOul試驗(yàn)獸藥原液，放入充分混勻，再吸取IOul藥液放入MH肉湯培養(yǎng)液5ml的試驗(yàn)管中。
4.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，步驟二所述的固體制劑的配制的具體方法如下: 采用頭孢噻呋鈉粉針，治療劑量是3mg/kgBW，在5ml MH肉湯培養(yǎng)液中加入15ug頭孢噻呋鈉粉針，操作時(shí)，先在0.5g/瓶中加入IOml注射用水，充分搖勻，用微量移液器準(zhǔn)確吸取30ul的藥液，放入含有970ul注射用水的無菌小試管中，充分搖勻，再吸取IOul的藥液放入MH肉湯培養(yǎng)液5ml即可。
5.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，步驟三所述的對(duì)發(fā)生疫情的動(dòng)物進(jìn)行病料采集和樣品制備具體方法如下: 對(duì)處于流行早期的典型發(fā)病動(dòng)物，無菌采集2~3份全血，各2~4ml，再將分離的血清混合后作為待檢樣品；對(duì)于流行中期的發(fā)病動(dòng)物群，撲殺典型發(fā)病動(dòng)物2~3頭，無菌采集心包滲出液、或關(guān)節(jié)液、胸腔積液，每份病料采集I~2ml，混合后作為待檢樣品。
6.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，步驟四所述的進(jìn)行獸藥敏感試驗(yàn)的具體方法如下: 每個(gè)藥敏試驗(yàn)管及對(duì)照管中MH肉湯為5ml，每種獸藥按設(shè)定的劑量配制后，分別加入2支藥敏試驗(yàn)管10ul，以便重復(fù)對(duì)照；再在各藥敏試驗(yàn)管中加入無菌采集發(fā)病動(dòng)物待檢樣品10ul，充分混勻；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組各2管，設(shè)不加獸藥及待檢樣品的MH肉湯空白對(duì)照管、不加獸藥而加發(fā)病動(dòng)物待檢樣品IOul的MH肉湯細(xì)菌對(duì)照管。經(jīng)35°C ±2°C培養(yǎng)18小時(shí)，對(duì)比分析結(jié)果，篩選敏感藥物，得出待檢樣品中細(xì)菌對(duì)各種獸藥的敏感程度。
7.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，所述的獸藥敏感試驗(yàn)管設(shè)高度敏感++++、敏感+++、中度敏感++、低度敏感+、不敏感-，五個(gè)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)； “++++”:100%液體完全透明，無細(xì)菌生長(zhǎng)，管底無凝集沉淀物； “+++”:75%液體透明，有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，略呈混濁，管底有極少量凝集沉淀物； “++”:50%液體透明，有部分細(xì)菌生長(zhǎng)，中等程度混濁，管底有少量凝集沉淀物； “ + ”:25%液體透明，有多量細(xì)菌生長(zhǎng)，明顯混濁，管底有較多凝集沉淀物；:100%液體不透明，有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，有明顯凝集沉淀物，振蕩呈均勻混濁。
8.如權(quán)利要求1所述的直接肉湯獸藥敏感試驗(yàn)方法，其特征在于，設(shè)定的MH肉湯空白對(duì)照管和MH肉湯細(xì)菌對(duì)照管，達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn): MH肉湯空白對(duì)照管:100%液體完全透明，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)，管底無凝集沉淀物，以“++++”標(biāo)記； MH肉湯細(xì)菌對(duì)照:100%液體不透明，有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，有明顯凝集沉淀物，振蕩時(shí)呈均勻混濁，以標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12Q1/18GK103740801SQ201310745303
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】劉躍生, 姚寧屏 申請(qǐng)人:嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院