單臂單價抗體構建體及其用途

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單臂單價抗體構建體及其用途
【專利摘要】本文提供單價抗體構建體。在具體實施方案中是一種包含以下的單價抗體構建體：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；和包含CH3結構域的二聚Fc多肽構建體，所述構建體包含兩個單體Fc多肽，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自所述抗原結合多肽構建體的多肽融合。這些治療新型分子涵蓋與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比展示與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和Bmax(在靶標與抗體比為1:1時的最大結合)增加的單價構建體。本文提供制造在等摩爾濃度下與相應二價抗體構建體相比顯示優越效應功效的單價抗體構建體的方法。本文提供制造出乎意料地抑制腫瘤細胞生長并可以被內化，而且在等摩爾飽和濃度下與二價抗體構建體相比顯示較大功效的單價抗體構建體的方法。提供用于治療HER2表達疾病的單價抗體構建體。
【專利說明】單臂單價抗體構建體及其用途
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請根據35U.S.C. § 1 19(e)要求2012年5月10日提交的美國臨時專利申請號61/645547、2012年11月2日提交的美國臨時專利申請號61/722070、2012年7月13 日提交的美國臨時專利申請號61/671640和2013年2月8日提交的美國臨時專利申請號 61/762812的權益，所述臨時專利申請各自以引用的方式整體并入本文中。發明領域
[0003] 本發明的領域是用于定制開發生物治療藥物的支架的合理設計。
[0004] 相關領域描述
[0005] 在治療性蛋白質的領域中，具有多價靶標結合特征的抗體是用于設計藥物候選物的優良支架。目前市場上的抗體治療藥物是經過優化和選擇由兩個抗體FAB賦予的高親和力結合和親合力的二價單特異性抗體。已采用通過誘變進行去巖藻糖基化或增強FcgR結合來通過抗體Fc依賴性細胞介導的細胞毒性機制使抗體更有效。無巖藻糖基化的抗體或 FcgR結合增強的抗體在臨床檢驗中仍遭受不完全的治療功效，而且任何這些抗體仍有待實現市場上的藥物狀態。
[0006] 治療性抗體將理想地具備某些最低限度的特征，包括在施用于目標患者后的靶標特異性、生物穩定性、生物利用度和生物分布，以及足夠的靶標結合親和力和高的靶標占有率以及對靶細胞的抗體裝飾從而使抗體依賴性治療作用最大化。對于產生具備所有這些最低限度特征的抗體治療藥物，尤其是在1:1的抗體與靶標的比率下可完全占有靶標的抗體所做的努力僅獲得了有限的成功。舉例而言，即使在飽和濃度下，全長二價單特異性IgG抗體在1:1比率下仍無法完全占有靶標。就理論角度而言，在飽和濃度下，預期傳統的單特異性二價抗體在1個抗體：2個靶標的比率下最大限度地結合靶標，這是因為與單價抗體片段相比存在兩個一致的可以賦予親合力作用的抗原結合FAB。另外，所述全長抗體由于分子尺寸更大而具有更有限的生物利用度和/或生物分布。此外，全長抗體在一些情況下可抑制在與靶抗原結合時的激動性作用，這在拮抗性作用是需要的治療功能的情況下是不利的。在一些情況下，這種現象是因為二價抗體在與細胞表面受體結合時促使導致受體活化的受體二聚化作用的"交聯"作用。另外，傳統的二價抗體具有有限的治療功效，這是因為在允許抗體依賴性細胞毒性作用或其它治療活性機制的最大治療安全劑量下，在1:2的抗體與靶抗原比率下有限的抗體結合和靶細胞的裝飾。發明概要
[0007] 本文提供一種分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；和二聚Fc多肽構建體，所述Fc多肽構建體包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc 多肽，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自抗原結合多肽構建體的多肽融合；其中所述單價抗體構建體以以下參數選擇性地和/或特異性地結合展示所述抗原的靶細胞：與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比增加的結合密度和B max;與所述單特異性二價抗體構建體相當的解離常數（Kd);與所述單特異性二價抗體構建體相當或較慢的解離速率；且其中所述單價抗體構建體展示與所述單特異性二價抗體構建體相當的生物物理學和體內穩定性；和與所述單特異性二價抗體構建體相當或較大的細胞毒性。
[0008] 在某些實施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗體構建體阻斷同源配體與靶抗原的結合。在某些實施方案中是本文提供的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗體構建體不阻斷同源配體與靶抗原的結合。在一個實施方案中是分離的單價抗體構建體，其中在抗體與靶標比率為1:1時，在大于觀察到的抗體的平衡常數 (Kd)直到飽和濃度的濃度下觀察到結合密度和Bmax相對于單特異性二價抗體的增力口。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中在大于觀察到的抗體的平衡常數（Kd)直到飽和濃度的濃度下，所述單價抗體構建體與所述相應二價抗體構建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C功效中的至少一種。
[0009] 在一些實施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體是包含參與效應物活性的Fc結構域的單價裂解性抗體構建體，其中所述裂解性抗體構建體是非激動性的、阻斷同源配體與靶抗原結合、抑制細胞生長；且其中所述裂解性抗體構建體以與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比增加的、快速的結合速率和相當的解離速率結合所述靶細胞并使其飽和。
[0010] 在一個實施方案中是分離的單價抗體構建體，其中所述構建體未經內化。在一些實施方案中是分離的單價抗體構建體，其中所述構建體經內化。
[0011] 本文提供一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體是經有效內化的單價內化抗體構建體；其中所述內化抗體是非激動性的、阻斷同源配體與靶抗原結合且不引發細胞生長；且其中所述內化抗體構建體以與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比增加的B max、快速的結合速率和較慢的解離速率結合所述靶細胞。
[0012] 在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體的內化大于、等于或小于相應單特異性二價抗體的內化。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和Bmax的增加與靶細胞上的抗原的密度無關。在一個實施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和Bmax的增加與靶抗原表位無關。
[0013] 在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體不展現親合力。
[0014] 在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述二聚Fc多肽構建體是異源二聚體的。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗原結合多肽構建體是能結合抗原的Fab片段、scFv、sdAb、抗原結合肽或蛋白質結構域。在一個實施方案中是分離的單價抗體構建體，其中所述Fab片段包含重鏈多肽和輕鏈多肽。
[0015] 在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中靶細胞是表達同源抗原的細胞，所述細胞選自包括以下的清單：癌細胞和表達J1ER2的病變細胞。在一些實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述抗原結合多肽構建體結合J1ER2且其中靶細胞是以下中的至少一種：低、中或高J1ER2表達細胞、孕酮受體陰性細胞或雌激素受體陰性細胞。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述抗原結合多肽構建體結合HER2胞外結構域，其中所述胞外結構域是ECR 1、2、3和4中的至少一種。
[0016] 本文提供一種結合HER2的分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合HER2的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中所述單體Fc多肽中的一個與抗原結合多肽構建體融合；其中在等摩爾濃度下，所述抗體構建體與結合HER2的相應二價抗體構建體相比展示與FcyR的結合密度增加。
[0017] 本文提供一種結合HER2的分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合HER2的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中所述單體Fc多肽中的一個與抗原結合多肽構建體融合；其中所述抗體構建體由靶細胞內化，其中所述構建體與結合HER2的相應二價抗體構建體相比展示出與祀細胞上展示的HER2的結合密度和Bmax增加，且其中在等摩爾濃度下，所述構建體與所述相應二價HER2 結合抗體構建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C中的至少一種。
[0018] 在一個實施方案中是一種結合HER2的分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合HER2的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc 多肽構建體，其中所述單體Fc多肽中的一個與抗原結合多肽構建體融合；其中所述抗體構建體結合FcRn，但與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比展示較高的 Vss〇
[0019] 在一些實施方案中是一種本文所述的分離的單價HER2結合抗體構建體，其中所述單價HER2結合多肽構建體是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一種。
[0020] 本文提供一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中二聚Fc構建體是包含變體CH3結構域的異源二聚Fc構建體。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，所述變體CH3結構域包含促使形成與天然同源二聚Fc區具有相當的穩定性的所述異源二聚體的氨基酸突變。在一個實施方案中是分離的單價抗體構建體，其中所述變體CH3 結構域具有約70°C或更高的熔解溫度（Tm)。在另一個實施方案中是分離的單價抗體，其中變體CH3結構域具有約75°C或更高的熔解溫度（Tm)。還提供一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中變體CH3結構域具有約80°C或更高的熔解溫度（Tm)。在另一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中二聚Fc構建體還包含含有促使選擇性結合 Fc Y受體的氨基酸修飾的變體CH2結構域。在一個相關實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中異源二聚體Fc構建體相對于野生型Fc區而言在CH3結構域中不包含另外的二硫鍵。在一個實施方案中是本文提供的分離的單價抗體構建體，其中異源二聚體 Fc構建體相對于野生型Fc區而言在變體CH3結構域中包含另外的二硫鍵，且其中變體CH3 結構域具有至少約77. 5°C的熔解溫度（Tm)。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中二聚Fc構建體是以大于約75%的純度形成的異源二聚Fc構建體。在一些實施方案中是本文所述的分離的單價抗體，其中二聚Fc構建體是以大于約80%的純度形成的異源二聚Fc構建體。還提供分離的單價抗體構建體，其中二聚Fc構建體是以大于約90%的純度形成的異源二聚Fc構建體。在一些實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中二聚Fc構建體是以大于約95%的純度形成的異源二聚Fc構建體。
[0021] 本文提供一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單體Fc多肽與抗原結合多肽構建體通過連接子融合。在某些實施方案中，連接子是多肽連接子。
[0022] 在一個實施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體具備的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種大于具有兩個抗原結合多肽構建體的相應二價抗體構建體的約105%。在一個實施方案中，構建體具備的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種是具有兩個抗原結合多肽構建體的相應二價抗體構建體的至少約125%。在另一個實施方案中，構建體具備的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種是相應二價抗體構建體的至少約150 %。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體具備的ADCC、ADCP和CDC 中的至少一種是具有兩個抗原結合多肽構建體的相應二價抗體構建體的至少約300%。
[0023] 在一個實施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和 B max的增加是相應二價抗體構建體的結合密度和Bmax的至少約125%。在一個實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和的增加是相應二價抗體構建體的結合密度和Bmax的至少約150%。還提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和B max的增加是相應二價抗體構建體的結合密度和Bmax的至少約200%。
[0024] 在一個實施方案中是一種包含編碼本文所述的分離的單價抗體構建體的核酸的宿主細胞。在一些實施方案中是一種宿主細胞，其中編碼抗原結合多肽構建體的核酸和編碼Fc構建體的核酸存在于單一載體中。還提供一種制備本文所述的分離的單價抗體構建體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)培養包含編碼抗體片段的核酸的宿主細胞；和（b) 從宿主細胞培養物回收抗體片段。
[0025] 在一個實施方案中是一種在穩定的哺乳動物細胞中產生糖基化單價抗體構建體或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其包括：用以下物質轉染至少一種穩定的哺乳動物細胞：編碼包含重鏈可變結構域和第一 Fc結構域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結構域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結構域；和編碼包含輕鏈可變結構域的輕鏈多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細胞中以預定比率轉染；在至少一種哺乳動物細胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩定的哺乳動物細胞中被表達成需要的糖基化單價不對稱抗體。
[0026] 在一個實施方案中提供產生本文所述的糖基化單價抗體構建體或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其包括用不同預定比率的所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列轉染至少兩種不同細胞以便至少兩種細胞各自以不同的比率表達重鏈多肽和輕鏈多肽。在一個實施方案中是產生糖基化單價抗體構建體或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其包括用包含所述第一、第二和第三DNA序列中至少兩種的多順反子載體轉染至少一種哺乳動物細胞。在一個實施方案中，所述至少一種哺乳動物細胞選自呢1?0、他1^、冊1(、呢0、中國倉鼠卵巢（010)、1138、8冊、 COS-7、Caco-2和MDCK細胞及其子類和變體。
[0027] 在一個實施方案中提供產生糖基化單價抗體構建體或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序列：第三DNA序列的預定比率是約1:1:1。
[0028] 在另一個實施方案中是產生本文所述的糖基化單價抗體構建體或糖基化工程無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序列：第三DNA序列的預定比率使得所翻譯的第一重鏈多肽的量約等于第二重鏈多肽的量和輕鏈多肽的量。在一個實施方案中是本文所述的方法，其中至少一種穩定的哺乳動物細胞的表達產物與單體重鏈或輕鏈多肽或其它抗體相比包含更大百分比的需要的糖基化單價抗體。
[0029] 在一個實施方案中提供產生本文所述的糖基化單價抗體構建體或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其包括鑒定和純化需要的糖基化單價抗體。在某些實施方案中，所述鑒定是通過液相色譜法和質譜分析法中的一者或兩者來進行。
[0030] 本文提供一種產生具有改善的ADCC的抗體構建體的方法，其包括：用以下物質轉染至少一種穩定的哺乳動物細胞：編碼包含重鏈可變結構域和第一 Fc結構域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結構域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結構域；和編碼包含輕鏈可變結構域的輕鏈多肽的第三DNA 序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細胞中以預定比率轉染；在至少一種哺乳動物細胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩定的哺乳動物細胞中被表達成糖基化單價抗體，其中所述糖基化單價不對稱抗體與相應野生型抗體相比具有較高的 ADCC。
[0031] 本文提供的一種產生具有改善的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種的HER2結合抗體構建體的方法，其包括：用以下物質轉染至少一種穩定的哺乳動物細胞：編碼包含重鏈可變結構域和第一Fc結構域多肽的第一重鏈多肽的第一DNA序列；編碼包含第二Fc結構域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結構域；和編碼包含輕鏈可變結構域的輕鏈多肽的第三DNA序列，以便所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細胞中以預定比率轉染；在所述至少一種哺乳動物細胞中翻譯所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩定的哺乳動物細胞中被表達成不對稱的糖基化單價J1ER2結合抗體，其中所述糖基化單價J1ER2結合抗體與相應野生型HER2結合抗體相比具有改善的ADCC、 ADCP和⑶C中的至少一種。
[0032] 提供一種增加至少一種靶細胞上的抗體濃度的方法，其向靶細胞提供包含以下的單價抗體構建體：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；二聚Fc區；其中所述單價抗體構建體與具有兩個抗原結合區的相應二價抗體構建體相比展示出與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和Bmax的增加，且其中所述單價抗體構建體與相應二價抗體構建體相比顯示改善的功效，且其中所述改善的功效并非通過抗原的交聯、抗原二聚化、防止抗原調節、抗原內化或抗原下調、或抗原活化而引發。
[0033] 本文提供一種包含本文所述的單價抗體構建體和藥學上可接受的載劑的藥物組合物。在某些實施方案中是一種還包含與單價抗體構建體偶聯的藥物分子的本文所述的藥物組合物。
[0034]本文提供一種治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的藥物組合物。提供一種治療HER信號傳導紊亂的方法，其向有需要的患者提供有效量的本文所述的藥物組合物。本文提供一種抑制腫瘤生長的方法，其包括使腫瘤與包含有效量的本文所述的單價抗體構建體的組合物接觸。提供一種使腫瘤萎縮的方法，其包括使腫瘤與包含有效量的本文所述的單價抗體構建體的組合物接觸。
[0035] 提供一種治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的單價抗體構建體。在一個實施方案中是一種在對用曲妥珠單抗（Trastuzumab)、帕妥珠單抗 (pertuzumab)、TDM1和抗HER二價抗體中的一種或多種的治療具有部分反應的患者中治療乳癌的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的單價抗體構建體。在一個實施方案中是一種在對用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、TDM1 (ADC)和抗HER二價抗體中的一種或多種的治療無反應的患者中治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的單價抗體構建體。提供一種本文所述的治療乳癌的方法，其中所述方法包含除了另一種治療劑以外還提供所述抗體構建體。在一個實施方案中是一種本文所述的治療乳癌的方法，其中所述抗體構建體與所述治療劑同時提供。還提供一種本文提供的治療乳癌的方法，其中所述抗體構建體與所述治療劑偶聯。
[0036] 提供本文所述的分離的單價抗體構建體，其中單價抗體構建體與一個或多個藥物分子偶聯。
[0037] 提供一種抑制抗原分子多聚化的方法，其包括使抗原與包含有效量的本文所述的單價抗體構建體的組合物接觸。還提供一種抑制抗原與其同源結合配偶體的結合的方法，其包括使抗原與包含足以與抗原結合的量的本文所述的單價抗體構建體的組合物接觸。 [0038] 還提供經過修飾以含有本文所述的核酸分子以編碼和表達本文所述的單價抗體構建體的轉基因生物體。
[0039] 在結合附圖審閱本發明具體實施方案的以下描述后，本發明的其它方面和特征對本領域普通技術人員來說將顯而易見。
[0040] 附圖簡述
[0041] 在說明本發明的實施方案的圖中，
[0042] 圖1描繪對抗體Fc依賴性細胞毒性即補體依賴性細胞毒性（CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP)的說明。
[0043] 圖2A至2B描繪與抗原結合的單價和二價抗體。圖2A描繪本文所述的以1:1的化學計量結合抗原的單價抗體構建體。圖2B描繪以1:2的化學計量結合抗原的二價抗體構建體。如本文所述，單價抗體構建體在每個細胞的基礎上導致較高的抗體濃度/裝飾并導致更多由ADCC、CDC、ADCP引起的Fc介導的細胞殺傷。
[0044] 圖3描繪示例性的單價抗HER2抗體與SK0V3細胞結合的能力：A.非線性擬合結合曲線；B.對數變換曲線。
[0045] 圖4描繪示例性的單價抗HER2抗體在不同的密度下與表達HER2的細胞結合的能力：A. MDA-MB-231 細胞；B. SK0V3 細胞；C. SKBR3 細胞。
[0046] 圖5描繪示例性的單價抗HER2抗體與二價全尺寸抗體（FSA)相比介導增強的 ADCC的能力。
[0047] 圖6描繪示例性的單價抗HER2抗體與二價全尺寸抗體（FSA)相比介導增強的⑶C 的能力。
[0048] 圖7描繪示例性的單價抗HER2抗體與二價全尺寸抗體（FSA)相比介導增強的⑶C 的能力：A.和B.各自代表其中使用兩種PBMC供體的實驗。C.具有0A2-Fab-HER2和4PBMC 供體的兩個獨立實驗的綜述，根據供體表示CD16+細胞的百分比。將數據標準化成WT FSA Hcptn的最大溶胞作用，并呈現出0A2-Fab-HER2相對于WT FSA Hcptn的最大溶胞作用的倍數差異。
[0049] 圖8描繪對示例性的單價抗HER2抗體在蛋白A純化后的產量和純度的分析。 A.對純化單價抗HER2抗體的SDS-PAGE分析；B.對0A1-Fab-HER2的LCMS分析；C.對 0八24 &13-冊1?2的^1^分析；0.在約0.8%兩條輕鏈+1條短重鏈（72,8980&)、單獨的約 0.7%短重鏈（25,9070 &)下顯示較低質量肽的(^24&13-冊1?2的^1^光譜的展開圖。
[0050] 圖9描繪單價抗HER2抗體被內化的能力。A.結果以內化％的形式繪圖；b.結果以相對于對照的作用％的形式繪圖。
[0051] 圖10描繪單價抗HER2抗體抑制SKBR3細胞生長的能力。
[0052] 圖11描繪單價抗HER2抗體與FcRn受體結合的能力。
[0053] 圖12描繪另一種示例性的單價抗HER2抗體與SK0V3細胞結合的能力。
[0054] 圖13描繪FSA-scFv-HER2的DNA和氨基酸序列。A.和C.分別是鏈A和鏈B的 DNA序列；B.和D.分別是鏈A和鏈B的氨基酸序列。
[0055] 圖14描繪0A3-scFv-HER2的DNA和氨基酸序列。A.和C.分別是鏈A和鏈B的 DNA序列；B.和D.分別是鏈A和鏈B的氨基酸序列。
[0056] 圖15描繪0A1-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.、C.和E.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的DNA序列；B.、D.和F.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的氨基酸序列。
[0057] 圖16描繪0A2-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.、C.和E.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的DNA序列；B.、D.和F.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的氨基酸序列。
[0058] 圖17描繪wt FSA Hcptn的DNA和氨基酸序列。A?和C?重鏈A的DNA序列；B?和 D.輕鏈的氨基酸序列。
[0059] 圖18描繪FSA-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.、C.和E.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的DNA序列；B.、D.和F.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的氨基酸序列。
[0060] 圖19描繪FSA-scFv-BID2的DNA和氨基酸序列。A.鏈A和鏈B的DNA序列；B.鏈 A和鏈B的氨基酸序列。
[0061] 圖20描繪0A4-scFv-BID2的DNA和氨基酸序列。A.和C.分別是鏈A和鏈B的 DNA序列；B.和D.分別是鏈A和鏈B的氨基酸序列。
[0062] 圖21A至21E描繪示例性的單價抗體構建體在不同細胞系中介導ADCC的能力。圖 21A、C、D和E描繪MCF7細胞中的結果，而圖21B描繪MDA-MB-231細胞中的結果。
[0063] 圖22描繪示例性的單價抗體構建體在小鼠體內的藥物動力學概況。
[0064] 圖23A至23B描繪用示例性的單價抗Her2抗體（0A1-Fab-Her2)處理SKBr3細胞對信號傳導分子的磷酸化作用的影響。圖A顯示對ErbB2的磷酸化作用的影響，而圖B顯示對MAPK和AKT的磷酸化作用的影響。
[0065] 圖24A至25B顯示對在15分鐘（圖A)和30分鐘（圖B)時由ELISA測量的Akt 的磷酸化作用程度的定量評估。
[0066]圖25A至25B描繪根據本發明的示例性單價抗體構建體結合JMT-1細胞（圖A)、 BT474細胞（圖B)和MCF-7細胞（圖C)的能力。
[0067] 圖26A至26B描繪示例性的單價抗Her2抗體抑制BT-474細胞（圖A， 0Al-Fab-Her20A2-Fab-HER2 ;圖 B，0A5-Fab-HER2, 0A6-Fab-Her2)生長的能力。
[0068] 圖27A至27B描繪示例性的單價抗體構建體0A1-Fab-Her2和0A5-Fab-Her2 (在 200nM下）在BT-474細胞（圖A)或JIMT-1細胞（圖B)中內化的能力。
[0069]圖28描繪示例性的單價抗體構建體結合MALME-3M細胞的能力。
[0070]圖29描繪示例性的單價抗體構建體-抗體藥物偶聯物（ADC)殺傷BT474細胞的能力。
[0071]圖30A至30B描繪構建體的純度。圖30A描繪示例性的單價抗體構建體 0A5-Fab-Her2和0A6-Fab-Her2在蛋白A純化后的純度。圖30B顯示通過LC/MS的異源二聚體純度分析，其表明〇A5-Fab-Her2和0A6-Fab-Her2在蛋白A和尺寸排阻色譜法后都可以被純化成大于99%的純度。
[0072] 圖31A至31F描繪0A5-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列；圖31A和圖31B分別是鏈A的DNA和氨基酸序列；圖31C和圖31D分別是鏈B的DNA和氨基酸序列；且圖31E和圖 31F分別是輕鏈的DNA和氨基酸序列。
[0073] 圖32A至32F描繪0A6-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列；圖32A和圖32B:分別是鏈A的DNA和氨基酸序列；圖32C和圖32D:分別是鏈B的DNA和氨基酸序列；且圖32E和圖32F:分別是輕鏈的DNA和氨基酸序列。
[0074] 圖33A至33F描繪FSA-Fab-pert的DNA和氨基酸序列；圖33A和圖33B分別是鏈A的DNA和氨基酸序列；圖33C和圖33D分別是鏈B的DNA和氨基酸序列；且圖33E和圖 33F分別是輕鏈的DNA和氨基酸序列。
[0075] 詳述
[0076] 本文提供單價抗體構建體，其包含單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自抗原結合多肽構建體的多肽融合；其中所述單價抗體構建體與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比展示出與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和B max的增加，且其中所述單價抗體構建體與相應二價抗體構建體相比顯示優越的功效和/或生物活性，且其中所述優越的功效和/或生物活性是結合密度增加的結果且導致靶細胞的裝飾增加。由本文提供的單價抗體構建體導致8_或結合密度增加并導致靶標裝飾增加是特異性靶標結合的作用而并非由于非特異性結合。在某些實施方案中，在1:1的靶標與抗體比率下發生最大結合。
[0077] 在某些實施方案中，本文提供的單價抗體構建體具備以下屬性中的至少一種或多種：與相應單特異性二價抗體構建體（FSA)相比增加的B max;與相應FSA相當的Kd;與相應 FSA相比相同或較慢的解離速率；激動性減少或部分激動性；祀標無交聯和二聚；對所關注靶細胞的特異性和/或選擇性；對靶細胞生長完全或部分抑制或無抑制；能引發效應物活性的完整Fc ;和被靶細胞內化的能力。
[0078] 在某些實施方案中，本文提供的單價抗體構建體具備以下最低限度的屬性：與相應FSA相比增加的B max;與相應FSA相當的K d;與相應FSA相比相同或較慢的解離速率；激動性減少或部分激動性；靶標無交聯和二聚；對所關注靶細胞的特異性和/或選擇性；對靶細胞生長完全或部分抑制或無抑制；能引發效應物活性的完整Fc ;和任選地被靶細胞內化的能力。
[0079] 本文提供一種單價抗體構建體，其中所述構建體是以下中的至少一種：單價裂解性抗體、單價內化抗體及其組合。在一些實施方案中，抗體構建體視這些抗體在以下功效因素之間展示的平衡而定是單價裂解性抗體和/或單價內化抗體：a)單價抗體構建體被內化的能力、b)單價抗體構建體增加的8_和Kd/結合-解離速率、和c)單價抗體構建體的激動性/部分激動性的程度。
[0080] 本文提供一種增加至少一種靶細胞中的抗體濃度的方法，其包括向靶細胞提供包含以下的單價抗體構建體：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；二聚Fc區；其中所述單價抗體構建體與具有兩個抗原結合區的相應二價抗體構建體相比展示出與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和Bmax(最大結合）的增加，且其中所述單價抗體構建體與相應二價抗體構建體相比顯示更佳的治療功效，且其中所述功效并非由抗原交聯、抗原二聚、防止抗原調節或防止抗原活化引發。相反，另一個事實是功效可以由抗原調節或抗原活化引發，只要這些不超過凈殺傷作用即可。
[0081] 在一些實施方案中是本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述抗體構建體不顯示親合力。
[0082] 單價裂解性（Mv-L)抗體
[0083] 提供本文所述的單價抗體構建體，其中所述構建體與FSA相比具備增加的8_和相當或較慢的解離速率（因此導致MV-L對靶細胞的裝飾較高和抗體依賴性的細胞毒性）。在一些實施方案中，本文所述的MV-L抗體構建體以與FSA相比增加的B max和快速的結合速率與緩慢的解離速率結合靶細胞。在一些實施方案中，本文所述的MV-L抗體構建體阻斷同源配體與靶抗原結合。在一些實施方案中，本文所述的MV-L抗體構建體不顯示內化，由此導致抗體在細胞上的最大裝飾和對路徑的功能性阻塞。
[0084] 在某些實施方案中，MV-L抗體構建體1)以與FSA相比增加的B max和快速的結合速率與類似或較慢的解離速率結合靶細胞并使其飽和；2)是非激動性的；3)抑制細胞生長； 4)阻斷同源配體與靶抗原結合；5)不顯示內化和6)包含參與效應物活性的Fc結構域。在某些實施方案中，MV-L抗體構建體最大限度地裝飾靶細胞表面，且阻斷靶抗原對靶細胞的活化，而不抵消可導致細胞存活和生長的活性。
[0085] 在一個實施方案中，根據本發明的單價裂解性抗體構建體1)以與單特異性二價抗體構建體相比增加的8_結合靶細胞且具有快速的結合速率和類似或緩慢的解離速率， 2)是非激動性的；3)抑制細胞生長，4)阻斷同源配體與靶抗原結合，5)顯示最小限度的內化和6)包含與Fc受體相互作用的Fc結構域和參與免疫系統的補體系統。
[0086] 在某些實施方案中，MV-L抗體構建體能結合FcyR受體和補體蛋白，且在高的細胞表面濃度下對于引發抗體依賴性的細胞毒性更有效。在某些實施方案中是一種MV-L抗體構建體，其適用于通過諸如ADCC、ADCP或⑶C的Fc效應功能來殺傷靶細胞。
[0087] 在一個實施方案中，MV-L抗體構建體由于相對于由FSA實現的參與的空間差異而能夠優先地參與效應系統。在某些實施方案中，MV-L基本上阻斷配體與靶抗原結合，同時不顯示激動性，然而與FSA相比增加的Bmax和快速的結合速率加上類似或緩慢的解離速率可以克服配體的部分阻塞、一定程度的激動性和細胞生長以及內化，從而導致仍優于 FSA的凈有效作用。在一些實施方案中，本文提供的MV-L抗體構建體結合HER2。在一些實施方案中，抗體構建體結合至少一種J1ER2胞外結構域。在某些實施方案中，胞外結構域是 E⑶1、E⑶2、E⑶3和E⑶4中的至少一種。在某些實施方案中，HER2結合MV-L是本文提供的 0A5-Fab-Her2(4182)或 0A1-Fab-Her2(1040)。
[0088] 在某些實施方案中，單價裂解性抗體構建體（MV-L)對病變細胞的裝飾增加導致通過ADCC、⑶C或ADCP去除靶細胞比單特異性二價抗體構建體（FSA)更有效。
[0089] 單價內化（MV-Int)抗體
[0090] 本文提供單價抗體構建體，其包含單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，且其中所述單價抗體構建體是單價內化（MV-Int)抗體構建體。在某些實施方案中，增加的B max和內化程度是對 MV-Int種類中的單價抗體構建體進行分類的關鍵驅動因素。在某些實施方案中，MV-Int 抗體構建體以與FSA相比增加的B max和快速的結合速率加上類似或緩慢的解離速率來結合靶細胞。在一些實施方案中，Mv-Int致使以下中的至少一種：對靶細胞的較高裝飾、阻斷同源配體與靶抗原結合和有效內化，以及抑制或不引發任何細胞生長。在一些實施方案中，本文提供的MV-L抗體結合HER2。在某些實施方案中，HER2結合MV-Int是本文提供的 0A5-Fab-Her2(4182)或 0A1-Fab-Her2(1040)。
[0091] 在某些實施方案中，本文提供與MV-L和FSA相比具有高Bmax和高內化的MV-Int 構建體，由此導致MV-Int的胞內濃度較高。在一些實施方案中，本文提供的MV-L抗體結合 HER2。在一些實施方案中，抗體構建體結合至少一種HER2胞外結構域。在某些實施方案中，胞外結構域是E⑶1、E⑶2、E⑶3和E⑶4中的至少一種。在一些實施方案中，MV-L抗體抑制HER2胞外結構域的二聚化。在一些實施方案中，抗體構建體結合至少一種HER2胞外結構域。在某些實施方案中，胞外結構域是E⑶1、E⑶2、E⑶3和E⑶4中的至少一種。
[0092] 在一些實施方案中，MV-Int抗體可以部分地活化受體，使用它作為特洛伊 (Trojan)來運送本文所述的抗體構建體，任選地與有效負荷一起到細胞中。所述MV-Int 抗體適用于制備抗體-藥物偶聯物（ADC)，而且可用于治療需要向靶細胞遞送毒性藥物的適應癥。在這種形態下，導致急性細胞死亡的高毒性的有效負荷的遞送將克服在MV-Int 中所賦予的一些激動性活性。在一些實施方案中，本文提供的MV-Int抗體結合HER2。在某些實施方案中是HER2結合單價抗體構建體，它們是MV-L和MV-Int。舉例而言， 0A1-Fab-Her2 (1040) - vl040 對于 MV-L 和 MV-Int 展示充分的特性。
[0093] 在一個實施方案中，由MV-Int實現的相對于FSA的較高裝飾和Bmax可補償內化水平的差異。
[0094] 在一個實施方案中，Mv-Int抗體構建體1)以與FSA相比增加的和快速的結合速率加上相當或緩慢的解離速率來結合靶細胞（因此導致MV-Int對靶細胞的裝飾較高）， 2)阻斷同源配體與靶抗原結合；3)是非激動性的；4)不引發細胞生長，和5)比單特異性二價抗體構建體在更大程度上有效內化。在另一個實施方案中，單價內化抗體構建體1)以與FSA相比增加的B max和快速的結合速率加上緩慢的解離速率來結合靶細胞（因此導致 MV-Int對靶細胞的裝飾較高），2)阻斷同源配體與靶抗原結合；3)只是部分激動性的；4) 不引發細胞生長，和5)比單特異性二價抗體構建體在更大程度上有效內化。
[0095] 在一些實施方案中，通過免疫T和B細胞以及病變細胞和耐藥病變細胞增加單價內化抗體構建體（MV-Int)的裝飾和內化導致通過ADC比FSA更有效地去除靶細胞。在一個實施方案中，與藥物分子偶聯的單價內化抗體構建體（MV-Int)適用于治療藥物治療無效和耐藥的患者以及無法對一線治療作出反應的患者。在一些實施方案中，本文提供的 MV-Int抗體結合HER2。在某些實施方案中是HER2結合單價抗體構建體，它們是MV-L和 MV-Int。例如0A1-Fab-Her2(1040)
[0096]在一個實施方案中，本文所述的單價裂解性抗體構建體（MV-L)使諸如病毒的病原體的裝飾增加導致病原體去除比單特異性二價抗體構建體（FSA)更有效。舉例而言，諸如HIV的病毒已演變成通過具有低密度的包膜刺突來回避二價抗體和二價結合，這是在與針對其一致地產生保護性中和抗體反應的病毒相比時的區分性特征。結果是親合力最小化，通常被抗體用來實現高親和力結合和有效中和，由此使病毒可回避抗體。本文所述的單價抗體構建體不受影響，顯著地是因為結合是針對單一的表位。在某些實施方案中，本文所述的單價抗體構建體可單獨或以組合形式用來涵蓋所有獨特的病毒表位。
[0097]在某些實施方案中，本文所述的MV_L抗體構建體通過病原體的調理作用而用于直接靶向和抗體介導的清除。在某些實施方案中，MV-L和MV-Int抗體兩者都適合受病原體感染的細胞的抗體依賴性清除。在一些實施方案中，MV-L和MV-Int抗體構建體高度裝飾受HIV感染的T細胞并標記用于通過ADCC、⑶C、ADCP或ADC殺傷而去除的這些細胞。在某些實施方案中，本文所述的單價抗體構建體可單獨或以與其它單價抗體構建體的組合形式使用。
[0098]本文提供一種分離的單價抗體構建體，其包含單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自抗原結合多肽構建體的多肽融合；其中所述單價抗體構建體與具有兩個抗原結合區的相應FSA構建體相比展示出與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和Bmax (最大結合）的增加，其中所述單價抗體構建體與相應二價抗體構建體相比顯示優越的功效和/或生物活性，且其中所述優越的功效和/或生物活性是結合密度增加的結果。
[0099]在某些實施方案中提供一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中在大于觀察到的平衡常數（Kd)的濃度下和在抗體的飽和濃度下，觀察到相對于單特異性二價抗體而言結合密度和Bmax增加。在一些實施方案中，優越的功效和/或生物活性是與所述相應二價抗體構建體相比FcyR或補體（Clq)結合增加和較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C中至少一種的結果。在具體實施方案中，分離的單價抗體構建體是抗增殖的并經過內化。在某些實施方案中是一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中所述相對于FSA而言的結合密度和Bmax的增加與靶細胞上的抗原密度無關。在一些實施方案中提供一種本文所述的分離的單價抗體構建體，其中靶細胞是癌細胞或表達J1ER2的病變細胞。在一個實施方案中，本文所述的分離的單價抗體構建體不顯示親合力。
[0100] 定義
[0101] 應了解，本發明不限于特定的實驗方案；本文所述的細胞系、構建體和試劑同樣可以改變。還應了解，本文所用的術語僅僅是為了描述特定實施方案的目的，且不打算限制本發明的范疇，本發明的范疇僅受附加的權利要求書限制。
[0102] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同含義。盡管在實踐或檢驗本發明中可以使用與本文所述類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述優選的方法、裝置和材料。
[0103]本文提到的所有公布和專利以引用的方式并入本文中，目的在于描述和公開例如在公布中描述的可能結合目前描述的發明使用的構建體和方法。本文論述的公布僅提供在本申請提交日之前的公開內容。本文中的內容都不應解釋為承認發明人無權根據先前的發明或出于任何其它原因提前所述公開內容的日期。
[0104]"二聚體"或"異源二聚體"是包含至少第一單體多肽和第二單體多肽的分子。在異源二聚體的情形下，所述單體之一的至少一個氨基酸殘基與另一單體不同。在某些實施方案中，表面區域掩埋驅使二聚體聚集。在一些實施方案中，單體多肽借助于通過有利于需要的二聚體形成和/或不利于其它不需要的樣品形成來驅使二聚體形成的靜電相互作用和/ 或鹽橋相互作用來彼此相互作用。在一些實施方案中，單體多肽借助于通過有利于需要的二聚體形成和/或不利于其它聚集類型形成來驅使需要的二聚體形成的疏水相互作用來彼此相互作用。在某些實施方案中，單體多肽借助于共價鍵形成來彼此相互作用。在某些實施方案中，在天然存在的半胱氨酸或驅使需要的二聚體形成的引進半胱氨酸之間形成共價鍵。在本文所述的某些實施方案中，單體之間不形成共價鍵。在一些實施方案中，多肽借助于通過有利于需要的二聚體形成和/或不利于其它不需要的實施方案形成來驅使二聚體形成的裝填（packing)/尺寸互補（size-complementarity)/球入洞（knob-into-hole)/ 隆凸 -腔（protruberance-cavity)型相互作用來彼此相互作用。在一些實施方案中，多肽借助于驅使二聚體形成的陽離子相互作用來彼此相互作用。在某些實施方案中，個別的單體多肽在溶液中無法以分離的單體形式存在。
[0105] 如本文所用的術語"Fc區"一般是指包含免疫球蛋白重鏈的C端多肽序列的二聚體復合物，其中C端多肽序列是可以通過木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的。Fc區可包含天然或變體Fc序列。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc序列的邊界可變化，但人IgG重鏈Fc序列通常定義為從大致Cys226位置或大致Pr 〇230位置的氨基酸殘基延伸到Fc序列的羧基端。免疫球蛋白的Fc序列一般包含兩個恒定結構域、一個CH2結構域和一個CH3結構域，且任選地包含一個CH4結構域。本文中"Fc多肽"意思是構成Fc區的多肽之一。Fc多肽可以從任何合適的免疫球蛋白獲得，諸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。在一些實施方案中，Fc多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列（一般在其N端）。在一些實施方案中，Fc多肽不包含功能型或野生型鉸鏈序列。
[0106]"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"和"ADCC"是指其中表達Fc受體（FcR)的非特異性細胞毒性細胞（例如，自然殺傷（NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞）識別靶細胞上的結合抗體并接著致使靶細胞溶解的細胞介導的反應。
[0107]"補體依賴性細胞毒性"和"CDC"是指在補體存在下溶解靶標。補體活化路徑通過補體系統的第一組分（Clq)和與同源抗原復合的分子（例如，抗體）結合來引發。
[0108]"抗體依賴性細胞吞噬作用"和"ADCP"是指通過單核細胞或巨噬細胞介導的吞噬作用破壞靶細胞。
[0109] 術語"Fc受體"和"FcR"用來描述與抗體的Fc區結合的受體。舉例而言，FcR可以是天然序列人FcR。FcR-般是結合IgG抗體的受體受體）且包括FcyRI、FCyRII 和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者拼接形式。FcyRII受體包括 FcyRIIA( "活化受體"）和FcyRIIB( "抑制受體")，它們具有主要在其細胞質結構域中不同的類似氨基酸序列。某些FcR也可以結合其它同種型的免疫球蛋白（參見例如，Janeway 等人，Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd.，NY)(第4版，1999))。活化受體FcyRIIA在其細胞質結構域中含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質結構域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITM)(在Dagron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)中綜述）。 FcR 在 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457_92 (1"1) ;Capel 等人，Immunomethods 4:25-34(1994);和 de Haas 等人，J.Lab.Clin.Med. 126:330-41(1995)中綜述。本文中的術語"FcR"涵蓋其它FcR，包括將來識別的那些FcR。此術語還包括新生兒受體FcRn，它負責向胚胎輸送母系IgG(Guyer等人，J. Immunol. 117:587 (1976);和Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994)) 〇
[0110] "病癥"是可由本發明的抗體或方法治療獲益的任何病況。此病癥包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動物具有論及病癥傾向的那些病理狀況。在本文中將要治療的病癥的非限制性實例包括惡性和良性腫瘤；非白血病和惡性淋巴腫瘤；神經元、神經膠質、星形膠質細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮細胞、基質和囊胚病癥；和炎癥性、免疫性和其它血管生成相關的病癥。
[0111] 術語"癌癥"和"癌性"是指或描述通常特征在于細胞生長/增殖失調的哺乳動物中的生理狀況。癌癥的實例包括（但不限于）癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、骨髓瘤（例如，多發性骨髓瘤）、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤/神經膠質瘤（例如，間變型星形細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、間變型少突神經膠質瘤、間變型少突星形細胞瘤）、宮頸癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌 (hepatic carcinoma)和各種類型的頭頸癌。
[0112] 如本文所用的術語"炎癥性疾病"或"炎癥性病癥"涵蓋特征為結締組織發炎或這些組織退化的病況。在某些實施方案中，炎癥性疾病或病癥包括（但不限于）阿爾茨海默癥 (Alzheimer's)、強直性脊柱炎、關節炎（包括（但不限于）骨關節炎、類風濕性關節炎（RA) 和牛皮癬性關節炎）、哮喘、動脈粥樣硬化、克羅恩氏病（Crohn's disease)、結腸炎、皮炎、憩室炎、纖維肌痛、肝炎、腸易激綜合癥（IBS)、系統性紅斑狼瘡（SLE)、腎炎、帕金森氏病和潰瘍性結腸炎。
[0113] 如本文所用，"治療"是指臨床干預試圖改變受治療個體或細胞的自然過程，而且可以進行用以預防或在臨床病理學的過程期間進行。有利的治療作用包括預防疾病發生或復發、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理學后果、預防轉移、減小疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態和緩解或改進預后。在一些實施方案中，使用本發明的抗體來延緩疾病或病癥的發展。在一個實施方案中，本發明的抗體和方法影響腫瘤消退。在一個實施方案中，本發明的抗體和方法影響對腫瘤/癌癥生長的抑制。
[0114] 術語"基本上純化"是指可基本上或大體上不含通常伴有如在其天然產生的環境中發現的蛋白質或與蛋白質相互作用的組分（即，天然細胞或在重組產生的異源多聚體的情形下是宿主細胞）的本文所述的構建體或其變體，即在某些實施方案中，基本上不含細胞材料，包括具有小于約30 %、小于約25 %、小于約20 %、小于約15 %、小于約10 %、小于約 5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1% (以干重量計）污染性蛋白質的蛋白質制劑。當異源多聚體或其變體由宿主細胞重組產生時，在某些實施方案中蛋白質以細胞干重量的約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1% 或更少存在。當異源多聚體或其變體由宿主細胞重組產生時，在某些實施方案中，蛋白質在培養基中以細胞干重量的約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約lg/L、約750mg/L、約500mg/ L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約lmg/L或更少存在。在某些實施方案中，如通過諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳的適當方法測定，由本文所述的方法產生的"基本上純化的"異源多聚體具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %的純度水平，特定而言至少約75%、80%、85%的純度水平，和更特定而言至少約90%的純度水平、至少約 95%的純度水平、至少約99%的純度水平或更大的純度水平。
[0115] "重組宿主細胞"或"宿主細胞"是指包括外源多核苷酸的細胞，而與用來插入的方法無關，所述用來插入的方法例如直接吸收、轉導、f_雜合或本領域中已知用于制造重組宿主細胞的其它方法。外源多核苷酸可保持為非整合載體形式，例如質粒，或者可以整合到宿主基因組中。
[0116] 如本文所用的術語"培養基（medium/media) "包括可支撐或含有任何宿主細胞的任何培養基、溶液、固體、半固體或硬性支撐物，所述宿主細胞包括細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CH0細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌（E.coli)或假單胞菌宿主細胞以及細胞內含物。因此，此術語可涵蓋其中已生長宿主細胞的培養基，例如蛋白質已分泌到其中的培養基，包括增殖步驟之前或之后的培養基。此術語還可以涵蓋含有宿主細胞溶解產物的緩沖劑或試劑，諸如在胞內產生本文所述的異源多聚體和宿主細胞被溶解或破壞而釋放異源多聚體的情形下。
[0117] 如本文所用的"重折疊"描述將含有二硫鍵的多肽從不當折疊或未折疊狀態轉變為就二硫鍵而言天然或適當折疊的構型的任何過程、反應或方法。
[0118] 如本文所用的"共折疊"具體是指采用至少兩種彼此相互作用的單體多肽并導致未折疊或不當折疊的多肽轉變為天然、適當折疊的多肽的重折疊過程、反應或方法。
[0119] 如本文所用，術語"已調節血清半衰期"意思是本文所述的抗體構建體相對于其天然形式而言所包含的抗原結合多肽的循環半衰期的正向或負向變化。通過在施用構建體后獲取各個時間點的血液樣本并測定每個樣本中的該分子的濃度來測量血清半衰期。血清濃度與時間的相關性使得可計算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地是至少約兩倍，但較小的增加也是適用的，例如在它能進行令人滿意的給藥方案或避免毒性作用的情況中。在一些實施方案中，增加是至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。
[0120] 如本文所用的術語"已調節治療半衰期"意思是本文所述的單價抗體構建體相對于其未修飾形式而言所包含的治療有效量的抗原結合多肽的半衰期的正向或負向變化。通過測量分子在施用后各個時間點的藥物動力學和/或藥效學特性來測量治療半衰期。治療半衰期增加理想地使得能進行特別有益的給藥方案、特別有益的總劑量或避免不利的作用。在一些實施方案中，治療半衰期增加是由于效能增加、經修飾的分子與其靶標的結合增加或減少、諸如蛋白酶的酶對分子的分解增加或減少、或未經修飾的分子的另一參數或作用機制增加或減少、或受體介導的分子清除率增加或減少。
[0121] 術語"分離的"在用于核酸或蛋白質時表示核酸或蛋白質不含至少一些在自然狀態下與其相關的細胞組分，或核酸或蛋白質已被濃縮到大于其在體內或體外產生的濃度的水平。這可以是同質狀態。分離的物質可以處于干燥或半干燥狀態，或在溶液中（包括但不限于水溶液）。其可以是藥物組合物的一種組分，其包括其它藥學上可接受的載劑和/或賦形劑。純度和同質性通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法的分析化學技術來測定。作為制劑中存在的主要物質的蛋白質是基本上純化的。具體而言，分離的基因從側接基因并編碼除所關注基因以外的蛋白質的開放閱讀框分開。術語"純化"表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上產生一個條帶。具體來說，它的意思是核酸或蛋白質至少85% 純、至少90 %純、至少95 %純、至少99 %或在更大程度上純。
[0122] 術語"核酸"是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核苷酸、脫氧核苷、核苷或核苷酸及其聚合物。除非具體限制，否則此術語涵蓋含有與參考核酸具有類似的結合特性并以與天然產生的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另外具體限制，否則此術語還指包括PNA(肽核酸）的寡核苷酸類似物、反義技術中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、氨基磷酸鹽等）。除非另外指示，否則特定的核酸序列還暗示性地涵蓋其保守性修飾的變體（包括但不限于簡并密碼子替換）和互補序列以及明確指出的序列。特定而言，可以通過產生其中一個或多個選定的（或所有）密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基替換的序列來實現簡并密碼子替換（Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ;0htsuka 等人，J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985) ;Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0123] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。即，針對多肽的描述同樣適用于對肽的描述和對蛋白質的描述，且反之亦然。所述術語適用于天然產生的氨基酸聚合物以及其中一個或多個氨基酸殘基是非天然編碼的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質，其中氨基酸殘基由共價肽鍵連接。
[0124] 術語"氨基酸"是指天然產生的和非天然產生的氨基酸以及以與天然產生的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼的氨基酸是20種常見的氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、果仁糖、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸）以及吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸類似物是指與天然產生的氨基酸具有相同的基本化學結構的化合物，即與氫結合的碳、羧基、氨基和R基，諸如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物具有經修飾的R基（諸如正亮氨酸）或經修飾的肽骨架，但保持與天然產生的氨基酸相同的基本化學結構。提到的氨基酸包括例如天然產生的蛋白質源性L-氨基酸；D-氨基酸，經過化學修飾的氨基酸，諸如氨基酸變體和衍生物；天然產生的非蛋白質源性氨基酸，諸如丙氨酸、鳥氨酸等；和具有本領域技術中已知的作為氨基酸特征的特性的化學合成化合物。非天然產生的氨基酸的實例包括（但不限于）a -甲基氨基酸（例如，a -甲基丙氨酸）、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸（例如，2-氨基-組氨酸、羥基-組氨酸、高組氨酸）、側鏈中具有額外亞甲基的氨基酸（"高"氨基酸）和側鏈中的羧酸官能團被磺酸基團取代的氨基酸（例如，磺基丙氨酸）。向本發明的蛋白質中并入非天然氨基酸（包括合成非天然氨基酸、經取代的氨基酸或一種或多種D-氨基酸）可在多種不同方面有利。含有D-氨基酸的肽等與含有L-氨基酸的對應物相比展示增加的體外或體內穩定性。因此，合并有D-氨基酸的肽構造等在需要或要求較大的胞內穩定性時可尤其適用。更具體而言，D-肽等對內源性肽酶和蛋白酶具有抗性，由此在這些特性合意時提供分子的改善的生物利用度和延長的體內壽命。另外，D-肽等無法被有效處理用于主要組織相容性復合物II級限制呈現給T輔助細胞，且因此更不可能在整個生物體中引發引發體液免疫反應。
[0125] 在本文中氨基酸可由其通常已知的三個字母符號或由IUPAC-IUB生化命名委員會推薦的一個字母符號提及。同樣，核苷酸可由其通常被接受的單字母代碼提及。
[0126] "保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。關于具體的核酸序列，"保守修飾的變體"是指編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不編碼氨基酸序列的情況下，是指基本上一致的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能一致的核酸編碼任何給定的蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶全部編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每個位置，密碼子可變成所述的任何相應的密碼子而不改變編碼的多肽。所述核酸變化是"沉默變化"，這是保守修飾變化的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述核酸的每種可能的沉默變化。本領域普通技術人員將意識到，核酸中的每個密碼子（除了 AUG(它一般是蛋氨酸的唯一密碼子）和TGG(它一般是色氨酸的唯一密碼子）以外）都可以被修飾來產生功能一致的分子。因此，每個描述序列中都暗含編碼多肽的核酸的每個沉默變化。
[0127] 關于氨基酸序列，本領域普通技術人員將意識到對核酸、肽、多肽或蛋白質序列進行的改變、增加或缺失編碼序列中的單一氨基酸或小百分比的氨基酸的個別取代、缺失或增加是"保守修飾變體"，其中改變導致氨基酸的缺失、氨基酸的增加或用化學上類似的氨基酸取代氨基酸。本領域普通技術人員已知提供功能類似氨基酸的保守取代表。所述保守修飾變體是除了本發明的多態變體、種間同系物和等位基因以外且不排除這些。
[0128] 本領域普通技術人員已知提供功能類似氨基酸的保守取代表。以下八組各自含有作為另一種的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸（A)，甘氨酸（G) ;2)天冬氨酸（D)，谷氨酸（E); 3)天冬酰胺（N)，谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸（I)，亮氨酸（L)，蛋氨酸（M)，纈氨酸（V) ;6)苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W) ;7)絲氨酸（S)，蘇氨酸 (T);和[0139]8)半胱氨酸（C)，蛋氨酸（M)(參見例如，Creighton, Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.;第 2 版（1993 年 12 月）
[0129] 術語"一致"或"同一性百分比"在兩個或更多個核酸或多肽序列的情形中是指相同的兩個或更多個序列或子序列。，當在比較窗口內或如使用以下序列比較算法（或本領域普通技術人員可用的其它算法）之一測量的指定區或通過手動比對和視覺觀察比較并比對最大對應性時，如果序列具有一定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同，就認為它們是"基本上一致的"（g卩，在指定區內約60 %同一性、約65 %、約70 %、約75 %、約80 %、約 85%、約90%或約95%同一性）。此定義也指檢驗序列的互補序列。可在長度為至少約50 個氨基酸或核苷酸的區域上或在長度為75至100個氨基酸或核苷酸的區域上，或（在不指定時）在多核苷酸或多肽的整個序列上存在同一'I"生。編碼本發明的多肽的多核苷酸（包括來自除類以外的物種的同系物）可以通過包含以下步驟的方法來獲得：在嚴格的雜交條件下用具有本發明的多核苷酸序列或其片段的標記探針篩選文庫并分離全長cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因組克隆。本領域技術人員熟知所述雜交技術。
[0130] 對于序列比較而言，通常一個序列充當參考序列，檢驗序列與其進行比較。在使用序列比較算法時，將檢驗和參考序列輸入計算機，接著指定座標，如果必要并指定序列算法程序參數。可以使用默認的程序參數，或者可以指定替代參數。序列比較算法隨后基于程序參數來計算檢驗序列相對于參考序列的序列同一性百分比。
[0131] 如本文所用的"比較窗口"包括提及選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150的連續位置數中的任一個的區段，其中可以在使兩個序列最佳對準后將一個序列與具有相同連續位置數的參考序列進行比較。本領域普通技術人員已知用于比較的序列對準方法。用于比較的最佳序列對準可以通過（包括但不限于）Smith和Waterman 的局部同源算法（1970) Adv. Appl. Math. 2:482c、通過Needleman和Wunsch的同源比對算法（1970) J. Mol. Biol. 48:443、通過 Pearson 和 Lipman 對類似性方法的搜尋（1988) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85:2444、通過計算機執行這些算法（GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，在 Wisconsin Genetics 軟件包中，Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, Wis.)或通過手動對比對和視覺觀察（參見例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995 增刊））來進行。
[0132] 適合測定序列同一性百分比和序列類似性的算法的一個實例是BLAST和BLAST 2. 0 算法，分別在 Altschul 等人（1997)Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 和 Altschul 等人 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中進行描述。用于進行BLAST分析的軟件可以通過在萬維網ncbi. nlm. nih. gov上可用的國家生物技術信息中心公開獲得。BLAST算法參數W、T和X 決定比對的敏感性和速度。BLASTN程序（對于核苷酸序列而言）使用字長（W)為11、期望值 (E)為10、M = 5、N = -4和兩條鏈的比較作為默認值。對于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用字長為3、且預期值（E)為10、且BL0SUM62計分矩陣（參見Henikoff和Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對（B)為 50、預期值（E)為 10、M = 5、N = -4 和兩條鏈的比較作為默認值。BLAST算法通常在"低復雜性"過濾器關閉的情形下進行。
[0133] BLAST算法也在兩個序列之間進行對類似性的統計學分析（參見例如，Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787)。由 BLAST 算法提供的類似性的一個量度是最小概率和（P (N))，它對于兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然發生匹配的概率提供指示。舉例而言，如果檢驗核酸與參考核酸比較中的最小概率和小于約〇. 2、或小于約 0. 01、或小于約0. 001,就認為核酸與參考序列類似。
[0134] 短語"選擇性地（或特異性地）雜交"是指當復合混合物（包括（但不限于）總的細胞或文庫DNA或RNA)中存在特定的核苷酸序列時，分子只與此序列在嚴格的雜交條件下結合、成雙鏈或雜交。
[0135] 短語"嚴格的雜交條件"是指DNA、RNA或其它核酸或其組合的序列在如本領域已知的低離子強度和高溫條件下雜交。通常，在嚴格條件下，探針將與核酸復合混合物 (包括（但不限于）總細胞或文庫DNA或RNA)中的其靶標子序列雜交，但不與復合混合物中的其它序列雜交。嚴格的條件是序列依賴性的且在不同環境下將不同。較長的序列在較高溫度下特異性地雜交。關于核酸雜交的廣泛指導可見于Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"（1993)中。
[0136] 如本文所用，術語"真核生物"是指屬于原核生物（Eucarya)系統發育域的生物體，諸如動物（包括（但不限于）哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等）、纖毛蟲、植物（包括 (但不限于）單子葉植物、雙子葉植物、藻類等）、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。
[0137] 如本文所用，術語"原核生物"是指原核生物體。舉例而言，非-真核生物體可屬于真細菌（Eubacteria)(包括（但不限于）大腸桿菌（Escherichia coli)、嗜熱細菌 (Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus)、突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、綠胺假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)等）系統發育域或古生菌（Archaea)(包括（但不限于）詹氏甲燒球菌（Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養甲燒桿菌（Methanobacterium thermoautotrophicum)、鹽桿菌屬（Halobacterium)(諸如沃氏嗜鹽富饒菌（Haloferax volcanii)和鹽桿菌屬物種NRC-1)、閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus)、強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus)、極端嗜熱古菌（Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細菌 (Aeuropyrum pernix)等）系統發育域。
[0138] 如本文所用的術語"受治療者"是指動物，在一些實施方案中是指哺乳動物，且在其它實施方案中是指人，它們是治療、觀察或實驗的目標。動物可以是同伴動物（例如，狗、貓等）、農場動物（例如，奶牛、綿羊、豬、馬等）或實驗室動物（例如，大鼠、小鼠、豚鼠等）。
[0139] 如本文所用的術語"有效量"是指施用的將在一定程度上減輕接受治療的疾病、病況或病癥的一種或多種癥狀的單價抗體構建體的量。含有本文所述的構建體的組合物可被施用來用于預防性、增強性和/或治療性治療。
[0140] 術語"增強（enhance或enhancing) "意思是增加或延長所需作用的效能或持續時間。因此，關于增強藥物分子或治療劑的作用而言，術語"增強"是指增加或延長治療劑對系統作用的效能或持續時間的能力。如本文所用的"增強有效量"是指足以增強另一種治療劑或藥物在所需系統中的作用的量。當用在患者中時，對此用途有效的量將取決于疾病、病癥或病況的嚴重程度和過程、先前的治療、患者的健康狀態和對藥物的反應以及治療醫師的判斷。
[0141] 如本文所用的術語"修飾"是指對給定多肽進行的任何改變，諸如改變多肽的長度、多肽的氨基酸序列、化學結構、共翻譯修飾或翻譯后修飾。"（修飾）"形式的術語意思是討論的多肽任選地經修飾，即討論的多肽可以是修飾的或未修飾的。
[0142] 術語"翻譯后修飾"是指在天然或非天然氨基酸被并入多肽鏈中之后此種氨基酸發生的任何修飾。僅舉例而言，此術語涵蓋共翻譯體內修飾、共翻譯體外修飾（諸如在無細胞翻譯系統中）、翻譯后體內修飾和翻譯后體外修飾。
[0143] 如本文所用的術語"單特異性二價抗體構建體"是指具有兩個與相同表位/抗原結合（單特異性）的抗原結合結構域（二價）的抗體構建體。抗原結合結構域可以是（但不限于）諸如Fab(片段抗原結合）、scFv (單鏈Fv)核sdab (單結構域抗體）的蛋白質構建體。單特異性二價抗體構建體在本文中也稱為"全尺寸抗體"或"FSA"。單特異性二價抗體構建體是測量單價抗體構建體特性的參考。
[0144] 術語"親合力"在本文中用來指治療性單特異性二價抗體的結合親和力和重要結構與生物屬性的組合協同強度。缺乏親合力和喪失協同結合強度可導致表觀靶標結合親和力減小。另一方面，在具有固定抗原數的靶細胞上，由多價（或二價）結合產生的親合力導致在相對于展示單價結合的抗體而言較少的抗體分子數時對靶抗原的占有率增加。在較少數目的抗體分子與靶細胞結合時，在二價裂解性抗體的應用中，抗體依賴性的細胞毒性殺傷機制可能無法有效進行，導致功效減小。無足夠的抗體結合來介導ADCC，因為ADCC、CDC、 ADCP -般被認為具有Fc濃度閾值依賴性。在激動性抗體的情形下，親合力減小使其交聯和二聚抗原且活化路徑的效率減小。
[0145] "單結構域抗體"或"Sdab"-單結構域抗體（諸如Camelid VhH結構域）是個別免疫球蛋白結構域。Sdab相當穩定且易于表達成具有抗體Fc鏈的融合配偶體（Harmsen MM, De Haard HJ(2007). "Properties,production, and applications of camelid single-domain antibody fragments，'? Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1):13-22) 〇
[0146] "HER受體"是屬于人表皮生長因子受體（HER)家族的受體蛋白酪氨酸激酶且包括 EGFR、HER2、HER3和HER4受體。HER受體一般將包含胞外結構域，其可結合HER配體；親脂性跨膜結構域；保守的胞內酪氨酸激酶結構域；和具有幾個可經磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號傳導結構域。
[0147] HER2的胞外（ecto)結構域包括四個結構域，結構域I(ECD1，約1至195的氨基酸殘基）、結構域II (E⑶2,約196至319的氨基酸殘基）、結構域III (E⑶3,約320至488的氨基酸殘基）和結構域IV (ECD4,約489至630的氨基酸殘基）（殘基編號不含信號肽）。參見 Garrett 等人，Mol. Cell. 11:495-505 (2003)、Cho 等人，Nature 421:756-760 (2003)、 Franklin 等人，Cancer Cell 5:317-328(2004)、Tse 等人，Cancer Treat Rev. 2012 年 4 月；38 (2) : 133-42 (2012)或 Plowman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)。
[0148] 表達"ErbB2"和"HER2"在本文中可互換使用且是指例如在Semba等人，PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)和 Yamamoto 等人，Nature 319:230-234(1986)(基因庫登錄號X03363)中所述的人HER2蛋白。術語"erbB2"和"neu"是指編碼人ErbB2蛋白的基因。P185或pl85neu是指neu基因的蛋白質產物。優選的HER2是天然序列人HER2。
[0149] "HER配體"意思是結合和/或活化HER受體的多肽。在本文中特別關注的HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長因子（EGF) (Savage等人，J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972));轉化生長因子 a (TGF-a ) (Marquardt 等人，Science 223:1079-1082(1984));雙調蛋白，也稱為神經鞘瘤或角化細胞自分泌生長因子（Shoyab 等人，Science 243:1074-1076(1989) ;Kimura 等人，Nature348:257-260 (1990);和 Cook 等人，Mol.Cell. Biol. 11:2547-2557(1991)) 細胞素（Shing 等人，Science 259:1604-1607 (1993);和 Sasada 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); 肝素-結合表皮生長因子（HB-EGF)(Higashiyama 等人，Science 251:936-939(1991)); 上皮調節蛋白（Toyoda 等人，J. Biol. Chem. 270:7495-7500(1995);和 Komurasaki 等人，0ncogenel5:2841_2848 (1997));調蛋白（heregulin)(參見下文）；神經調節蛋白 _2 (NRG-2) (Carraway 等人，Nature 3耵：512_516 (I"7));神經調節蛋白 _3 (NRG-3) (Zhang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. M: 9562_9567 (I"7));神經調節蛋白-4 (NRG-4) (Harari 等人，Oncogene 18:2681-89(1999))或畸胎瘤衍化生長因子（cripto，CR-1) (Kannan 等人，J. Biol. Chem. 272 (6) : 3330-3335 (1997))。結合 EGFR 的 HER 配體包括 EGF、 TGF-a、雙調蛋白、@細胞素、HB-EGF和上皮調節蛋白。結合HER3的HER配體包括調蛋白。能結合HER4的HER配體包括0細胞素、上皮調節蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和調蛋白。
[0150] "調蛋白"（HRG)在本文中使用時是指如美國專利號5,641，869或Marchionni 等人，Nature, 362:312-318(1993)中公開的由調蛋白基因產物編碼的多肽。調蛋白的實例包括調蛋白- ct、調蛋白- @1、調蛋白-@2和調蛋白-@3 (Holmes等人，Science, 256:1205-1210 (1992);和美國專利號 5,641,869) ;neu 分化因子 (NDF) (Peles 等人，Cell 69:205-216(1992));乙酰膽堿受體-誘發活性（ARIA) (Falls 等人，Cell 72:801-815(1993));神經膠質生長因子（GGF) (Marchionni 等人，Nature, 362:312-318 (1993));感覺和運動神經元衍生因子（SMDF) (Ho等人，J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995));y-調蛋白（Schaefer 等人，Oncogene 15:1385-1394 (1997))。此術語包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列變體，諸如其EGF樣結構域片段（例如，HRGP 1177-244)。
[0151] "HER活化"或"HER2活化"是指任一種或多種HER受體或HER2受體的活化或磷酸化。HER活化一般導致信號轉導（例如，由HER受體或基質多肽中的HER受體磷酸化酪氨酸殘基的胞內激酶結構域引起）。ffiR活化可由與包含所關注ffiR受體的ffiR二聚體結合的 HER配體來介導。與HER二聚體結合的HER配體可活化二聚體中一個或多個HER受體的激酶結構域且由此導致一個或多個HER受體中的酪氨酸殘基的磷酸化作用和/或另外基質多肽（諸如Akt或MAPK胞內激酶）中的酪氨酸殘基的磷酸化作用。
[0152] 抗體"效應功能"是指由抗體的Fc區（天然序列Fc區或氨基酸序列變體Fc區）引起的那些生物活性。抗體效應功能的實例包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如，B細胞受體；BCR)的下調等。
[0153] 抗體的"Fab片段"（也稱為片段抗原結合）含有輕鏈的恒定結構域（CL)和重鏈的第一恒定結構域（CH1)以及分別位于輕鏈和重鏈上的可變結構域VL和VH。可變結構域包含在抗原結合中涉及的互補決定環（⑶R，也成為高變區）。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于在重鏈CH1結構域的羧基端加入幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。
[0154] "單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在于單多肽鏈中。在一個實施方案中，Fv多肽另外在VH與VL結構域之間包含多肽連接子，這使得scFv形成抗原結合所需要的結構。關于scFv的綜述參見Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷中，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁（1994)。HER2 抗體 scFv 片段在 TO93/16185 ;美國專利號 5, 571，894 ; 和美國專利號5, 587, 458中描述。
[0155] "人源化"形式的非人（例如，嚙齒動物）抗體是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在大多數的情況下，人源化抗體是其中受體高變區的殘基由來自諸如小鼠、大鼠、兔子或非人靈長動物的非人物種（供體抗體）的高變區的具有所需特異性、親和力和能力的殘基取代的人免疫球蛋白（受體抗體）。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區（FR)殘基由相應的非人殘基替代。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。進行這些修飾來進一步改進抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個、且通常是兩個可變結構域，其中全部或基本上全部的高變環對應于非人免疫球蛋白的高變環且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選地也將包含至少一部分免疫球蛋白恒定區（Fc)，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白的恒定區。關于進一步詳情，參見Jones等人，Nature 321:522-525 (1986) ;Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
[0156] 人源化HER2抗體包括如以引用的方式明確并入本文中的美國專利號5, 821，337 的表 3 中所述的 huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、 huMAb4D5-6、huMAb4D5-7 和 huMAb4D5-8 或曲妥珠單抗(HERCEPTIN?);如美國專利公布號2006/0018899中所述的人源化520C9 (W093/21319)和20'人源化2C4抗體。
[0157] "表位2C4"是抗體2C4結合的HER2的胞外結構域中的區。為了篩選結合2C4表位的抗體，可進行諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 編者Harlow和David Lane(1988)中所述的常規交叉阻斷分析。或者，可以進行表位定位來評估是否使用本領域已知的方法使抗體與J1ER2的2C4表位結合和/或可以研究抗體-HER2 結構（Franklin 等人，Cancer Cell 5:317-328(2004))來確定抗體結合 HER2 的哪個結構域。表位2C4包含來自HER2的胞外結構域中的結構域II的殘基。2C4和帕妥珠單抗在結構域I、II和III的接合處結合HER2的胞外結構域。Franklin等人，Cancer Cell5:317-328(2004)。
[0158] "表位4D5"是抗體4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠單抗結合的HER2的胞外結構域中的區。此表位接近HER2的跨膜結構域且在HER2的結構域IV中。為了篩選結合4D5表位的抗體，可進行諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 編者Harlow和David Lane (1988)中所述的常規交叉阻斷分析。或者，可以進行表位定位來評估抗體是否結合J1ER2的4D5表位（例如，大約殘基529至大約殘基625 (包括殘基529 和殘基625在內）區內的任一個或多個殘基，參考美國專利公布號2006/0018899的圖1)。
[0159] "表位7C2/F3"是7C2和/或7F3抗體（各自以ATCC寄存，參考下文）結合的 HER2的胞外結構域的結構域I內N端的區。為了篩選結合7C2/7F3表位的抗體，可進行諸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,編者Harlow和 DavidLane(1988)中所述的常規交叉阻斷分析。或者，可以進行表位定位來確定抗體是否結合HER2上的7C2/7F3表位（例如，HER2的大約殘基22至大約殘基53區內的任一個或多個殘基，參見美國專利公布號2006/0018899的圖1)。
[0160] 如本文所用的術語"抗原調節"是指諸如在ADC中的表面受體密度通過內化或下調）的變化或損失。
[0161] 抗原結合多肽構建體
[0162] 單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體可源自已知的抗體或抗原結合結構域，或可源自新型的抗體或抗原結合結構域。識別用于單價抗體構建體的抗原結合多肽構建體是基于靶細胞的選擇和基于在靶細胞表面上表達的抗原的選擇。舉例而言，一旦選定靶細胞，就選擇a)在靶細胞的細胞表面上表達，而不在其它細胞的表面上表達，或b)在靶細胞的細胞表面上以較高水平表達，而在其它細胞的表面上以較低水平表達的抗原。這樣可以選擇性地來靶向靶細胞。
[0163] 靶細胞的選擇
[0164] 基于單價抗體構建體的預期用途來選擇靶細胞。在一個實施方案中，靶細胞是在癌癥、感染性疾病、自體免疫疾病或炎癥性疾病中活化或擴增的細胞。
[0165] 在一個實施方案中，當單價抗體構建體打算用于治療癌癥時，靶細胞源自展示 HER23+過度表達的腫瘤。在一個實施方案中，靶細胞源自展示HER2低表達的腫瘤。在一個實施方案中，靶細胞源自展示J1ER2抗性的腫瘤。在一個實施方案中，靶細胞源自為三陰性 (ER/PR/HER2)腫瘤的腫瘤。
[0166] 在單價抗體構建體打算用于治療癌癥的實施方案中，靶細胞是代表HER23+過度表達的癌細胞系，例如SKBR3、BT474。在一個實施方案中，靶細胞是代表HER2低表達的癌細胞系，例如MCF7。在一個實施方案中，靶細胞是代表HER2抗性的癌細胞系，例如JIMT1。在一個實施方案中，靶細胞是代表乳癌三陰性的癌細胞系，例如MDA-MD-231細胞。
[0167] 在一個實施方案中，根據本發明的單價抗體構建體被設計成靶向乳癌細胞。示例性種類的乳癌細胞包括（但不限于）以下：孕酮受體（PR)陰性和雌激素受體（ER)陰性細胞、低HER 2表達細胞、中HER2表達細胞、高HER2表達細胞或抗HER2抗體抗性細胞。
[0168] 在一個實施方案中，本文所述的單價抗體構建體被設計成靶向胃腺癌和食管腺癌。示例性的組織學類型包括：具有腸表型的HER2陽性近端胃癌和HER2陽性遠端彌漫性胃癌。示例性種類的胃癌細胞包括（但不限于）（N-87、0E-19、SNU-216和MKN-7)。
[0169] 在另一個實施方案中，本文所述的單價抗體構建體被設計成靶向腦中的轉移性 HER2+乳癌腫瘤。示例性種類的胃癌細胞包括（但不限于）BT474(如上文關于乳癌）。
[0170] 抗原的選擇
[0171] 如上文所示，抗原結合多肽構建體結合的抗原是取決于單價抗體構建體打算結合的靶細胞來選擇。在一個實施方案中，抗原結合多肽構建體結合的抗原是基于與其它細胞表面相比1)在靶細胞表面上的表達增加或b)在靶細胞表面上的選擇性表達來選擇。因此，在一個實施方案中，單價抗體構建體被設計成靶向表A1中列出的靶細胞類型之一。
[0172] 表A1 :抗體和各自靶細胞的清單
[0173]
【權利要求】
1. 一種分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；和二聚Fc多肽構建體，所述Fc多肽構建體包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自所述抗原結合多肽構建體的多肽融合；其中所述單價抗體構建體以以下參數選擇性地和/或特異性地結合展示所述抗原的靶細胞：與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比增加的結合密度和Bmax; 與所述單特異性二價抗體構建體相當的解離常數（Kd); 與所述單特異性二價抗體構建體相當或較慢的解離速率；且其中所述單價抗體構建體展示與所述單特異性二價抗體構建體相當的生物物理學和體內穩定性；和與所述單特異性二價抗體構建體相當或更大的對靶細胞毒性。
2. 根據權利要求1所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗體構建體阻斷同源配體與所述靶抗原的結合。
3. 根據權利要求1所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗體構建體不阻斷同源配體與所述靶抗原的結合。
4. 如權利要求1所述的分離的單價抗體構建體，其中在抗體與靶標的比率為1:1時，在大于觀察到的所述抗體的平衡常數（Kd)直到飽和濃度的濃度下觀察到結合密度和Bmax 相對于單特異性二價抗體的增加。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中在大于觀察到的所述抗體的平衡常數（Kd)直到飽和濃度的濃度下，所述單價抗體構建體與所述相應二價抗體構建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C功效中的至少一種。
6. 如權利要求1至5中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體是包含參與效應物活性的Fc結構域的單價裂解性抗體構建體，其中所述裂解性抗體構建體是非激動性的、可阻斷同源配體與所述靶抗原結合、阻斷抗原信號傳導、抑制細胞生長；且其中所述裂解性抗體構建體以與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比增加的Bmax、快速的結合速率和相當的解離速率結合所述靶細胞并使其飽和。
7. 如權利要求6所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體未經內化。
8. 如權利要求1至6中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體經內化。
9. 如權利要求1至6中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體是經過有效內化的單價內化抗體構建體；其中所述內化抗體可阻斷抗原信號傳導、是非激動性的、阻斷同源配體與所述靶抗原結合且不引發細胞生長；且其中所述內化抗體構建體以與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比增加的Bmax、快速的結合速率和較慢的解離速率結合所述靶細胞。
10. 如權利要求1至6、8或9中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體的內化大于、等于或小于所述單特異性二價抗體的內化。
11. 如權利要求1至9中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和 Bmax的增加與所述靶細胞上的所述抗原的密度無關。
12. 如權利要求1至10中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和 Bmax的增加與所述靶抗原表位無關。
13. 如權利要求1至11中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述靶細胞是表達所述同源抗原的細胞，所述細胞選自包括以下的清單：癌細胞和表達HER受體的病變細胞。
14. 如權利要求1至12中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體不展現親合力。
15. 如權利要求1至13中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述二聚Fc多肽構建體是異源二聚體的。
16. 如權利要求1至14中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述抗原結合多肽構建體結合HER2且其中所述靶細胞是以下中的至少一種：低、中或高HER2表達細胞、孕酮受體陰性細胞或雌激素受體陰性細胞。
17. 如權利要求1至15中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述抗原結合多肽構建體結合HER2胞外結構域，其中所述胞外結構域是E⑶1、2、3和4中的至少一種。
18. 如權利要求1至16中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗原結合多肽構建體是能結合所述抗原的Fab片段、scFv、SdAb、抗原結合肽或蛋白質結構域。
19. 如權利要求17所述的分離的單價抗體構建體，其中所述Fab片段包含重鏈多肽和輕鏈多肽。
20. -種結合HER2的分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合HER2的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中所述單體Fc 多肽中的一個與所述抗原結合多肽構建體融合；其中在高于Kd的等摩爾濃度下和在飽和下，與結合HER2的相應二價抗體構建體相比，所述抗體構建體介導由免疫效應細胞上的Fe γ R對所述靶細胞的增加的裝飾。
21. -種結合HER2的分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合HER2的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中所述單體Fc 多肽中的一個與所述抗原結合多肽構建體融合；其中所述抗體構建體由靶細胞內化，其中所述構建體與結合HER2的相應二價抗體構建體相比展示出與所述祀細胞上展示的HER2的結合密度和Bmax的增加，且其中在高于Kd的等摩爾濃度下和在飽和下，所述構建體與所述相應二價HER2結合抗體構建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C中的至少一種。
22. -種結合HER2的分離的單價抗體構建體，其包含：單價地結合HER2的抗原結合多肽構建體；和包含兩個各自包含CH3結構域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構建體，其中所述單體Fc 多肽中的一個與所述抗原結合多肽構建體融合；其中所述抗體構建體結合FcRn，但與具有兩個抗原結合區的相應單特異性二價抗體構建體相比展示較高的Vss。
23. 如權利要求1至21中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價抗體構建體與一個或多個藥物分子偶聯。
24. 如權利要求1至23中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述抗體構建體不展現親合力。
25. 如權利要求13至14中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單價HER2 結合多肽構建體是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一種。
26. 如權利要求1至24中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體具備的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種大于具有兩個抗原結合多肽構建體的相應二價抗體構建體的約105%。
27. 如權利要求1至25中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體具備的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種是具有兩個抗原結合多肽構建體的相應二價抗體構建體的至少約125%。
28. 如權利要求1至26中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體具備的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種是相應二價抗體構建體的至少約150 %。
29. 如權利要求1至27中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體具備的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種是具有兩個抗原結合多肽構建體的相應二價抗體構建體的至少約300%。
30. 如權利要求1至28中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和 Bniax的增加是所述相應二價抗體構建體的結合密度和Bmax的至少約125%。
31. 如權利要求1至29中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和 Bniax的增加是所述相應二價抗體構建體的結合密度和Bmax的至少約150%。
32. 如權利要求1至30中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述結合密度和 Bniax的增加是所述相應二價抗體構建體的結合密度和Bmax的至少約200%。
33. 根據權利要求1至31中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述二聚Fc構建體是包含變體CH3結構域的異源二聚Fc構建體。
34. 根據權利要求32所述的分離的單價抗體構建體，所述變體CH3結構域包含促使形成具有與天然同源二聚Fc區相當的穩定性的所述異源二聚體的氨基酸突變。
35. 如權利要求33所述的分離的單價抗體構建體，其中所述變體CH3結構域具有約 70°C或更高的熔解溫度（Tm)。
36. 如權利要求34所述的分離的單價抗體構建體，其中所述變體CH3結構域具有約 75°C或更高的熔解溫度（Tm)。
37. 如權利要求35所述的分離的單價抗體構建體，其中所述變體CH3結構域具有約 80°C或更高的熔解溫度（Tm)。
38. 如權利要求1至36中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述二聚Fe構建體還包含含有促使選擇性結合Fe γ受體的氨基酸修飾的變體CH2結構域。
39. 根據權利要求32至37中任一項所述的分離的單價抗體，其中所述異源二聚體Fe 構建體相對于野生型Fe區而言在所述CH3結構域中不包含另外的二硫鍵。
40. 根據權利要求32至38中任一項所述的分離的單價抗體，其中所述異源二聚體Fe 構建體相對于野生型Fe區而言在所述變體CH3結構域中包含另外的二硫鍵，且其中所述變體CH3結構域具有至少約77. 5°C的熔解溫度（Tm)。
41. 根據權利要求1至39中任一項所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構建體是以大于約75%的純度形成的異源二聚Fc構建體。
42. 根據權利要求1至40中任一項所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構建體是以大于約80%的純度形成的異源二聚Fc構建體。
43. 根據權利要求1至41中任一項所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構建體是以大于約90%的純度形成的異源二聚Fc構建體。
44. 根據權利要求1至42中任一項所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構建體是以大于約95%的純度形成的異源二聚Fc構建體。
45. 根據權利要求1至43中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述單體Fc多肽通過連接子與所述抗原結合多肽構建體融合。
46. 根據權利要求44所述的分離的單價抗體構建體，其中所述連接子是多肽連接子。
47. -種宿主細胞，其包含編碼根據權利要求1至45中任一項所述的分離的單價抗體構建體的核酸。
48. 如權利要求46所述的宿主細胞，其中所述編碼所述抗原結合多肽構建體的核酸和所述編碼所述Fc構建體的核酸存在于單一載體中。
49. 一種制備根據權利要求1至47中任一項所述的分離的單價抗體構建體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)培養包含編碼所述抗體片段的核酸的宿主細胞；和（b)從所述宿主細胞培養物回收所述抗體片段。
50. -種藥物組合物，其包含根據權利要求1至45中任一項所述的單價抗體構建體和藥學上可接受的載劑。
51. 如權利要求49所述的藥物組合物，其還包含與所述單價抗體構建體偶聯的藥物分子。
52. -種治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的如權利要求49至51中任一項所述的藥物組合物。
53. -種治療HER信號傳導紊亂的方法，其向有需要的患者提供有效量的如權利要求 49至51中任一項所述的藥物組合物。
54. -種抑制腫瘤生長的方法，其包括使所述腫瘤與包含有效量的根據權利要求1至 45中任一項所述的單價抗體構建體的組合物接觸。
55. -種使腫瘤萎縮的方法，其包括使所述腫瘤與包含有效量的根據權利要求1至45 中任一項所述的單價抗體構建體的組合物接觸。
56. -種抑制抗原分子的信號傳導的方法，其包括使所述抗原與包含有效量的根據權利要求1至45中任一項所述的單價抗體構建體的組合物接觸。
57. -種抑制抗原與其同源結合配偶體結合的方法，其包括使所述抗原與包含足以與所述抗原結合的量的根據權利要求1至45中任一項所述的單價抗體構建體的組合物接觸。
58. -種治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的如權利要求12至45中任一項所述的單價抗體構建體。
59. -種在對用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、TDMl和抗HER二價抗體中的一種或多種的治療具有部分反應的患者中治療乳癌的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的如權利要求12至45中任一項所述的單價抗體構建體。
60. -種在對用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、TDMl (ADC)和抗HER二價抗體中的一種或多種的治療無反應的患者中治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的如權利要求12至45中任一項所述的單價抗體構建體。
61. 如權利要求57至60中任一項所述的治療乳癌的方法，其中所述方法包括除另一種治療劑以外還提供所述抗體構建體。
62. 如權利要求60所述的治療乳癌的方法，其中所述抗體構建體與所述治療劑同時提供。
63. 如權利要求60所述的治療乳癌的方法，其中所述抗體構建體與所述治療劑偶聯。
64. -種在穩定的哺乳動物細胞中產生糖基化單價抗體構建體或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構建體的方法，其包括：用以下物質轉染至少一種穩定的哺乳動物細胞：編碼包含重鏈可變結構域和第一 Fc結構域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結構域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結構域；和編碼包含輕鏈可變結構域的輕鏈多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細胞中以預定比率轉染；在所述至少一種哺乳動物細胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩定的哺乳動物細胞中被表達成需要的糖基化單價不對稱抗體。
65. 如權利要求63所述的方法，其包括用不同預定比率的所述第一DNA序列、所述第二 DNA序列和所述第三DNA序列轉染至少兩種不同細胞以便所述至少兩種細胞各自以不同的比率表達所述重鏈多肽和所述輕鏈多肽。
66. 如權利要求64所述的方法，其包括用包含所述第一、第二和第三DNA序列中至少兩種的多順反子載體轉染所述至少一種哺乳動物細胞。
67. 如權利要求63至65中任一項所述的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞選自 VERO、HeLa、HEK、NS0、中國倉鼠卵巢（CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2 和 MDCK 細胞及其子類和變體。
68. 如權利要求63至66中任一項所述的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序列：第三DNA序列的所述預定比率是約1: 1:1。
69. 如權利要求63至67中任一項所述的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序列：第三DNA序列的所述預定比率使得所翻譯的第一重鏈多肽的量約等于所述第二重鏈多肽的量和所述輕鏈多肽的量。
70. 如權利要求63至68中任一項所述的方法，其中所述至少一種穩定的哺乳動物細胞的表達產物與所述單體重鏈或輕鏈多肽或其它抗體相比包含更大百分比的所述需要的糖基化單價抗體。
71. 如權利要求63至69中任一項所述的方法，其包括鑒定和純化所述需要的糖基化單價抗體。
72. 如權利要求70所述的方法，其中所述鑒定是通過液相色譜法和質譜分析法中的一者或兩者來進行。
73. -種產生具有改善的ADCC的抗體構建體的方法，其包括：用以下物質轉染至少一種穩定的哺乳動物細胞：編碼包含重鏈可變結構域和第一 Fc結構域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結構域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結構域；和編碼包含輕鏈可變結構域的輕鏈多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細胞中以預定比率轉染；在所述至少一種哺乳動物細胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩定的哺乳動物細胞中被表達成糖基化單價抗體，其中所述糖基化單價不對稱抗體與相應野生型抗體相比具有較高的ADCC。
74. -種產生具有改善的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種的HER2結合抗體構建體的方法，其包括：用以下物質轉染至少一種穩定的哺乳動物細胞：編碼包含重鏈可變結構域和第一 Fc結構域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結構域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結構域；和編碼包含輕鏈可變結構域的輕鏈多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細胞中以預定比率轉染；在所述至少一種哺乳動物細胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩定的哺乳動物細胞中被表達成不對稱的糖基化單價HER2結合抗體，其中所述糖基化單價HER2結合抗體與相應野生型HER2 結合抗體相比具有改善的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種。
75. -種增加至少一種靶細胞上的抗體濃度的方法，其向所述靶細胞提供包含以下的單價抗體構建體：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；二聚Fc區；其中所述單價抗體構建體與具有兩個抗原結合區的相應二價抗體構建體相比展示出與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和Bmax的增加，且其中所述單價抗體構建體與相應二價抗體構建體相比顯示改善的功效，且其中所述改善的功效并非由所述抗原的交聯、抗原二聚化而引起。
76. -種增加至少一種靶細胞上的抗體濃度的方法，其向所述靶細胞提供包含以下的單價抗體構建體：單價地結合抗原的抗原結合多肽構建體；二聚Fc區；其中所述單價抗體構建體與具有兩個抗原結合區的相應二價抗體構建體相比展示出與展示所述抗原的靶細胞的結合密度和Bmax的增加，且其中所述單價抗體構建體與相應二價抗體構建體相比顯示改善的功效，且其中所述改善的功效可包括抗原調節。
77. -種殺傷腫瘤的方法，其包括使所述腫瘤與包含有效量的根據權利要求1至45中任一項所述的單價抗體構建體的組合物接觸。
78. 如權利要求1至11中任一項所述的分離的單價抗體構建體，其中所述靶細胞是表達所述同源抗原的細胞，所述細胞選自包括以下的清單：癌細胞和表達HER2的病變細胞。
79. 如權利要求6所述的分離的單價抗體構建體，其中所述構建體是非激動性的或部分激動性的。
【文檔編號】C12N15/85GK104520327SQ201380036769
【公開日】2015年4月15日申請日期:2013年5月8日優先權日:2012年5月10日
【發明者】G·Y·K·吳, S·B·迪克西特, T·斯普雷特馮克羅登斯泰恩申請人:酵活有限公司

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