一種獲得中華大節(jié)竹sos1逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得中華大節(jié)竹SOS1逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，包括以下步驟：提取中華大節(jié)竹幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。利用RACE方法設(shè)計(jì)特異引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE的擴(kuò)增，通過巢式PCR分別獲得3′和5′片段；用Vector?NTI12軟件拼接中間、3′和5′片段，獲得了IsSOS1基因全長cDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2，通過PCR擴(kuò)增，得到長度為3516bp的cDNA序列。本發(fā)明的SOS1逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因可以用來提高植物抗病性和抗鹽性，可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物的耐鹽能力，使竹類植物能生長在濱海鹽漬土地上，有利于竹類植物作為濱海防護(hù)林的種植，這種措施的經(jīng)濟(jì)效益是十分可觀的，發(fā)揮了巨大作用。
【專利說明】—種獲得中華大節(jié)竹S0S1逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，一些竹類植物具有一定的耐鹽性。了解竹類植物的抗鹽機(jī)理，克隆抗鹽基因并轉(zhuǎn)移到鹽敏感的植物中，培育抗鹽的轉(zhuǎn)基因作物新品種，對(duì)于竹類植物作為濱海地區(qū)防護(hù)林來說，具有十分重要的意義。
[0003]質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)Na+的外排，將細(xì)胞質(zhì)中的Na+逆向運(yùn)送到胞外高Na+環(huán)境中，保持細(xì)胞中Na+的平衡，防止Na+對(duì)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的傷害。植物中Na+/H+antiporter最早發(fā)現(xiàn)是在大麥質(zhì)膜上,此在大麥質(zhì)膜上首次發(fā)現(xiàn)后，一些植物的質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因都已被克隆和鑒定，其中包括水稻S0S1、擬南芥AtSOSl、小麥TaSOSl、大葉補(bǔ)血草LgSOSl、番茄LeSOSl等。同時(shí)，轉(zhuǎn)SOSl基因能提高轉(zhuǎn)基因植株擬南芥的耐鹽性。
[0004]耐鹽植物在形成了各種潛在抗鹽機(jī)制，而一些竹類植物具有一定的耐鹽性包括剛竹、白哺雞竹、早竹、紅竹、淡竹等，其相關(guān)耐鹽基因在耐鹽品種的抗鹽機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。
[0005]云南竹類資源最為豐富，中華大節(jié)竹(Indosasa sinica)在云南河口天然竹林的面積約為8580多公頃，開發(fā)潛力很大。中華大節(jié)竹具有一定的耐鹽性，產(chǎn)于貴州南部，云南南部和東南部、廣西多生于`低海拔地區(qū)。葉片通常為帶狀披針形。但對(duì)中華大節(jié)竹的耐鹽機(jī)制尚未從分子水平加以研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，旨在解決現(xiàn)有缺少中華大節(jié)竹的耐鹽機(jī)制從分子水平研究的問題。
[0007]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，該獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法包括以下步驟:
[0008]步驟一，提取中華大節(jié)竹幼苗的根、莖和葉的總RNA，混合RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈 cDNA ；
[0009]步驟二，用擬南芥和水稻等模式植物的SOSl基因序列，根據(jù)保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)簡并引物IsSOS1-FI和IsSOSl-Rl，以反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0010]步驟三，PCR加樣總體系為50 μ L:cDNA模板為1.0 μ L，上和下游引物10 μ mol/L分別為 I μ L, 10 X Buffer Mg2+ 為 5 μ L，dNTPs Mixture I Ommo I/L 為 4μ L，ExTaq DNA 聚合酶5U/ μ L為0.5 μ L，最后補(bǔ)37.5 μ L的滅菌水；通過PCR的擴(kuò)增，獲得了 700bp的中間片段；[0011]步驟四，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中已知的引物，根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)特異引物IsS0Sl-3'和IsS0Sl-5'，分別進(jìn)行:V RACE和Y RACE的擴(kuò)增，通過巢式PCR分別獲得3'和5'片段；
[0012]步驟五，用Vector NTI12軟件拼接中間、3'和5'片段，拼接出IsSOSl基因全長cDNA序列，根據(jù)拼接出的全長序列，設(shè)計(jì)特異引物IsS0Sl-F2和IsS0Sl_R2通過PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后獲得含有IsSOSl基因全長編碼框的cDNA序列。
[0013]進(jìn)一步，cDNA序列包含3105bp的開放閱讀框，同時(shí)編碼1035個(gè)氨基酸殘基，序列含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。
[0014]進(jìn)一步，該獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的全長為3516bp，開放讀碼框?yàn)?105bp，編碼了 1035個(gè)氨基酸多肽。 [0015]本發(fā)明提供的獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從竹類植物中首次分離出編碼質(zhì)膜型SOSl反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。將該基因轉(zhuǎn)入鹽敏感酵母突變體ATX3，能在一定程度上恢復(fù)其抗鹽能力。本發(fā)明的SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因可以用來提高植物抗病性和抗鹽性，可用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物的耐鹽能力，使竹類植物能生長在濱海鹽潰土地上，有利于竹類植物作為濱海防護(hù)林的種植，這種措施的經(jīng)濟(jì)效益是十分可觀的，發(fā)揮了巨大作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0019]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法包括以下步驟:
[0020]SlOl:提取中華大節(jié)竹幼苗的根、莖和葉的總RNA，混合RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA ；
[0021]S102:用擬南芥和水稻等模式植物的SOSl基因序列，根據(jù)其保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)簡并引物IsSOS1-FI和IsSOSl-Rl，以反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0022]S103 =PCR加樣總體系為50 μ L:cDNA模板為1.0 μ L，上和下游引物10 μ mol/L分別為 I μ L, IOXBuffer Mg2+ 為 5 μ L，dNTPs Mixture I Ommo I/L 為 4μ L，ExTaq DNA 聚合酶5U/ μ L為0.5 μ L，最后補(bǔ)37.5 μ L的滅菌水；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件見表1，通過PCR的擴(kuò)增，獲得了約700bp的中間片段；
[0023]S104:參照 RACE 試劑盒說明書，利用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中已知的引物，根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)特異引物IsSOSl-3'和IsSOSl-5'，分別進(jìn)行3' RACE和5' RACE的擴(kuò)增，通過巢式PCR分別獲得3'和5'片段；[0024]S105:用Vector NTI12軟件拼接中間、3 '和5'片段，拼接出IsSOSl基因全長cDNA序列。根據(jù)拼接出的全長序列，設(shè)計(jì)特異引物IsS0Sl-F2和IsS0Sl_R2通過PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后獲得含有IsSOSl基因全長編碼框的cDNA序列。
[0025]本發(fā)明的具體步驟為:(1)提取中華大節(jié)竹幼苗(根、莖和葉)的總RNA。混合RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA。(2)用擬南芥和水稻等模式植物的SOSl基因序列，根據(jù)其保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)簡并引物IsSOS1-FI和IsSOSl-Rl (表1)。以反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)PCR加樣總體系為50yL:cDNA模板為1.0 μ L，上和下游引物(10 μ mol/L)分別為 I μ L，10XBuffer(Mg2+)為 5yL，dNTPs Mixture (IOmmo 1/L)為 4yL，ExTaq DNA聚合酶(5U/μ L)為0.5 μ L，最后補(bǔ)37.5 μ L的滅菌水。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件見表1，通過PCR的擴(kuò)增，獲得了約700bp的中間片段。
[0026](4)參照 RACE 試劑盒說明書，利用 SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit(Clontech，USA)試劑盒中已知的引物，根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)特異引物IsS0Sl_3 '和IsSOSl-Si，分別進(jìn)行:V RACE和Y RACE的擴(kuò)增，通過巢式PCR分別獲得:V和Y片段。3'片段和5'片段PCR反應(yīng)條件見表1。
[0027](5)用Vector NTI12軟件拼接中間、3'和5'片段，獲得了 IsSOSl基因全長cDNA序列。設(shè)計(jì)特異引物IsS0Sl-F2和IsS0Sl-R2(表1)通過PCR擴(kuò)增，得到長度為3516bp的cDNA序列。該全長序列包含3105bp的開放閱讀框，同時(shí)編碼1035個(gè)氨基酸殘基，該序列含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。
[0028]表1引物序列及PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件
【權(quán)利要求】
1.一種獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，其特征在于，該獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法包括以下步驟: 步驟一，提取中華大節(jié)竹幼苗的根、莖和葉的總RNA，混合RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA ； 步驟二，用擬南芥和水稻等模式植物的SOSl基因序列，根據(jù)保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)簡并引物IsSOS1-FI和IsSOSl-Rl，以反轉(zhuǎn)錄合成第I鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟三，PCR加樣總體系為50 μ L:cDNA模板為l.0yL,上和下游引物10 μ mol/L分別為 I μ L，IOXBuffer Mg2+為 5 μ L，dNTPs MixturelOmmol/L 為 4 μ L，ExTaq DNA 聚合酶 5U/μ L為0.5 μ L，最后補(bǔ)37.5 μ L的滅菌水；通過PCR的擴(kuò)增，獲得了 700bp的中間片段； 步驟四，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中已知的引物，根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)特異引物IsS0Sl-3'和IsS0Sl-5'，分別進(jìn)行3' RACE和5' RACE的擴(kuò)增，通過巢式PCR分別獲得3'和5'片段； 步驟五，用Vector NTI12軟件拼接中間、3'和Y片段，拼接出IsSOSl基因全長cDNA序列，根據(jù)拼接出的全長序列，設(shè)計(jì)特異引物IsSOS 1-F2和IsSOS 1-R2通過PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后獲得含有IsSOSl基因全長編碼框的cDNA序列。
2.如權(quán)利要求1所述的獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，其特征在于，在cDNA序列包含3105bp的開放閱讀框，同時(shí)編碼1035個(gè)氨基酸殘基,序列含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。
3.如權(quán)利要求1所述的 獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的方法，其特征在于，該獲得中華大節(jié)竹SOSl逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因序列的全長為3516bp，開放讀碼框?yàn)?105bp，編碼了 1035個(gè)氨基酸多肽。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103773778SQ201410010130
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】王澍, 樊國盛, 段曉梅, 彭建松, 林開文, 區(qū)智 申請(qǐng)人:西南林業(yè)大學(xué)