乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗制備及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗制備方法，其中，所述方法包括采用鑒定的乳腺癌特異表達的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域1蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ?ID?NO.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，并由SEQ?ID?NO.1-6中一項以上多肽負載樹突狀細胞，制備成樹突狀細胞疫苗，可引發很強的靶向乳腺癌的細胞毒性T淋巴細胞反應。本發明還提供了制備所述乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的試劑盒。
【專利說明】乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗制備及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及制備乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細胞和疫苗。特別地，本發明涉及采用鑒定的乳腺癌特異表達的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域I蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，負載樹突狀細胞的制備方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細胞疫苗。
【背景技術】
[0002]目前，乳腺癌是威脅女性健康最主要的疾病之一，中國是乳腺癌發病率增長速度最快的國家之一，約有47萬患者，現在乳腺癌發病率正以每年3%的速度遞增，已成為城市女性的第一殺手。現有技術即常規治療手段手術、化療和放療等可以去除或殺死機體大部分乳腺癌，但還存在一些殘余的乳腺癌細胞或產生耐藥的乳腺癌細胞成為癌癥復發和轉移的“元兇”，使得患者不能得到較長的生存期以及預后不佳。隨著分子生物學和細胞生物學的發展，臨床治療癌癥的技術也不斷呈現并發揮著很好效果，其中細胞免疫治療癌癥得到很好的發展，應用患者自體免疫細胞臨床治療乳腺癌取得良好的療效，能有效清除患者機體內殘余腫瘤細胞，抑制腫瘤的復發和轉移，而且臨床上無任何毒副作用。樹突狀細胞是機體內最大的抗原呈遞細胞，通過吞噬和加工機體內乳腺癌細胞，與T淋巴細胞結合并將抗原信息呈遞給T淋巴細胞，由該T淋巴細胞對腫瘤細胞產生細胞毒性作用。樹突狀細胞疫苗已在臨床上用于治療乳腺癌病人，樹突狀細胞如何獲得更佳地抗腫瘤效果，完全取決于腫瘤特異表達的抗原，因而篩選和找到腫瘤特異表達的抗原是樹突狀細胞發揮作用的關鍵環節。
[0003]人類表皮生長因子受體2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor2, Her2 /neu)是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，由1255個氨基酸組成，720-987位屬于酪氨酸激酶區，屬于表皮生長因子受體家族成員之一。研究發現，30%以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴增/過度表達(如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20% -30%的原發性浸潤性乳腺癌有HER2基因的擴增/過度表達，提示HER2的過度表達與腫瘤的發生和侵襲有關，可提高轉移的危險；轉染的細胞和動物模型證實，其可改變腫瘤對激素和化療藥物的敏感性。
[0004]乳腺癌耐藥蛋白(Breastcancer resistance protein,BCRP)含 655 個氨基酸殘基的跨膜蛋白，屬于ABC轉運蛋白超家族的成員，BCRP僅有6個跨膜區和I個ATP的結合位點，BCRP通過組成同二聚體或異二聚體構成跨膜通道而發揮功能，過表達BCRP的腫瘤細胞株對米托蒽醌，阿霉素，柔紅霉素，鬼白乙叉甙和拓撲替康等產生交叉耐藥，是導致臨床乳腺癌治療失敗的最主要原因之一。人乳腺癌組織BCRP陽性表達率為35%以上，而且BCRP陽性表達率與耐藥和轉移正相關。
[0005]IQ 基序與 Sec7 結構域 I 蛋白(IQ motif and Sec7domainl,GEP100)與促使乳腺癌細胞轉移密切相關。其在乳腺癌細胞中發現了過高水平，激活Arf6導致非侵入性細胞在EGFR的刺激下變成侵入性細胞。相反地，當GEPlOO被抑止時，被注入高水平侵入性乳腺癌細胞的小鼠體內癌細胞轉移被抑止了。取自入侵性乳腺癌患者的臨床樣品中有高水平的GEP100, GEP100和EGFR的同時出現與腫瘤惡性化有關。
[0006]因而研究確認Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白在乳腺癌患者表達顯著，其可作為乳腺癌耐藥及其復發轉移潛在的主要標志物。
[0007]綜上，針對特異表達Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的乳腺癌細胞進行殺傷具有很好的臨床應用意義，可以高效準確地對乳腺癌細胞進行清除，而且可以靶向惡性程度高的腫瘤細胞，并有效抑制乳腺癌的復發和轉移，同時不影響機體正常細胞。

【發明內容】

[0008]為了高效靶向乳腺癌進行殺傷和有效抑制乳腺癌的耐藥性、復發和轉移，本發明首先對乳腺癌特異表達并與腫瘤細胞的耐藥性、復發和轉移密切相關的腫瘤抗原進行篩選，發現Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白在乳腺癌中特異表達，特別是在耐藥性的和復發轉移的乳腺癌細胞中高表達，而正常組織細胞中不表達。本發明通過抗原表位預測系統分析了 Her2 / neu,BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽，并進行細胞毒性T淋巴細胞實驗鑒定得到6條可引發細胞毒性T淋巴細胞反應的HLA-A201陽性的表位多肽。本發明是提供了Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的HLA-A201陽性的表位多肽，該多肽可以用于負載樹突狀細胞，引發特異性的靶向乳腺癌的細胞毒性T淋巴細胞反應。
[0009]本發明提供了乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗制備方法，以及提供使用本發明所述方法的試劑盒，通過本發明所述方法獲得的樹突細胞疫苗。
[0010]本發明提供了乳腺癌腫瘤特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的方法，其中，所述方法包括采用鑒定的腫瘤特異表達的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，負載樹突狀細胞。通過采集人外周血中白細胞，經體外分離純化獲得的單個核細胞，在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和白介素4誘導培養獲得未成熟樹突狀細胞；未成熟樹突狀細胞負載Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的SEQ ID N0.1_6中任一項抗原表位多肽后，并在腫瘤壞死因子a與脂多糖誘導培養條件下獲得具有抗腫瘤作用的成熟樹突狀細胞疫苗。
[0011]根據本發明提供了一種制備乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的方法，其特征在于，所述樹突狀細胞疫苗由SEQ ID N0.1-6中一項以上抗原表位多肽負載的樹突狀細胞。
[0012]本發明還提供了一種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其中，所述樹突狀細胞為本發明所述的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的SEQ ID N0.1_6中抗原表位多肽負載的樹突狀細胞。
[0013]本發明還提供了一種制備乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的試劑盒，其中，所述試劑盒包括:
[0014]I)樹突狀細胞基礎培養基；
[0015]2)Her2 / neu、BCRP 和 GEP100 蛋白 SEQ ID N0.1-6 中一項以上抗原表位多肽；
[0016]3)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子；[0017]4)白介素_4、脂多糖和腫瘤壞死因子a ;以及
[0018]5)使用說明書；
[0019]其中，所述使用說明書包括權利要求1-5所述的方法。
[0020]通過本發明的方法，通過篩選和鑒定得到的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽。由本發明提供的方法得到的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽負載的樹突狀細胞的藥物，能夠在體內和體外引發免疫應答來殺死引起復發與轉移的乳腺癌細胞，從而為克服乳腺癌耐受性、根治乳腺癌的復發和轉移提供了可能，特別是原發性乳腺癌等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1表示由實施例1和4所得Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽單負載的DC引發的酶聯斑點圖像自動分析儀檢測干擾素Y酶聯斑點計數結果。
[0022]圖2表示由實施例1和4所得Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽分別負載的DC引發的細胞毒性T淋巴細胞對乳腺癌細胞(MCF-7)產生的應答結果對比圖。
[0023]圖3表示由實施例1和5所得Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白抗原表位多肽多負載樹突狀細胞引發的細胞毒性T淋巴細胞對表達Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的乳腺癌細胞(MCF-7)產生的應答結果對比圖。
【具體實施方式】
[0024]本發明提供了一種制備乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的方法，其中，所述方法包括采用鑒定的腫瘤特異表達的Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1-6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，負載樹突狀細胞。通過采集人外周血中白細胞，經體外分離純化獲得的單個核細胞，在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和白介素4誘導培養獲得未成熟樹突狀細胞；未成熟樹突狀細胞負載Her2 / neu、BCRP和GEP100蛋白的SEQ ID N0.1_6中任一項抗原表位多肽后，并在腫瘤壞死因子a與脂多糖誘導培養條件下獲得具有抗腫瘤作用的成熟樹突狀細胞疫苗，見下表。
【權利要求】
1.一種乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法包括采用鑒定的乳腺癌特異表達的人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域I蛋白的人白細胞抗原A201陽性表位多肽，即SEQ ID N0.1_6中任一項所示的氨基酸序列組成的多肽，負載樹突狀細胞，可引發特異性的靶向乳腺癌的細胞毒性T淋巴細胞反應。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述樹突狀細胞疫苗為由SEQIDN0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域I蛋白中任一項以上抗原表位多肽負載的樹突狀細胞。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述樹突狀細胞疫苗，優選地由SEQID N0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域I蛋白三項抗原表位多肽組成的多肽組合物負載。
4.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述樹突狀細胞通過以下方法獲取: 取IOOmL外周血經Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細胞；外周血單個核細胞用RPMI1640培養基重懸，并加入6孔板中貼壁； 在37°C、5% CO2培養箱中孵育90min后，未貼壁細胞洗滌收集下來，用于誘導CIK細胞；貼壁細胞加入完全培養基RPMI1640誘導培養，含有5%的自體血清、2000IU / mL重組人粒細胞巨噬集落刺激因子和1500IU / mL IL-4 ； 在培養到第三天時細胞 更換新鮮培養基； 培養到第五天收獲未成熟樹突狀細胞(DCs);成熟DCs采用完全RPMI1640培養基再誘導到第七天得到，含0.1 ii g / mL脂多糖和20ng / mL腫瘤壞死因子a。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述負載DCs通過以下方法獲取: 培養 5 天后，3 X 106 個未成熟 DCs 用 HER2 / NEU,BCRP 和 GEP100 蛋白 SEQ ID N0.1-6中一項以上抗原表位多肽組合物在37°C、5% CO2培養箱中負載2小時；抗原負載的DCs通過離心收獲得到；所得DCs經生理鹽水洗滌3次，后重懸到生理鹽水中，至濃度為3 X IO6成熟DC / mL，并添加終濃度為質量體積比2%的人血白蛋白，從而制備成負載的DC疫苗。
6.一種含權利要求1-5中任一項所述的制備乳腺癌特異抗原表位多肽負載的樹突狀細胞疫苗的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 1)樹突狀細胞基礎培養基； 2)SEQ ID N0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域I蛋白中任一項以上抗原表位多肽； 3)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子； 4)白介素-4、脂多糖和腫瘤壞死因子a;以及 5)使用說明書； 其中，所述使用說明書包括權利要求1-5任一項所述的方法。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒，優選地包括由SEQIDN0.1-6中人類表皮生長因子受體2、乳腺癌耐藥蛋白和IQ基序與Sec7結構域I蛋白三項抗原表位多肽組成的多肽組合物。
8.一種根據權利要求1-7中任一項所述的樹突狀細胞疫苗在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
【文檔編號】C12N5/0784GK103784950SQ201410030180
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】沈麗, 黃啟明, 郝麗敏 申請人:北京弘潤源生物技術有限公司